激活TLR5和NLRC4通路對(duì)小鼠先天免疫細(xì)胞的影響①

卓召振　李　偉　袁　軍

(貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，貴陽550004)

激活TLR5和NLRC4通路對(duì)小鼠先天免疫細(xì)胞的影響①

卓召振李偉②③袁軍③

(貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，貴陽550004)

[摘要]目的：探討用重組鞭毛素蛋白同時(shí)或者分別激活C57BL/6小鼠模型TLR5和NLRC4通路對(duì)小鼠先天免疫細(xì)胞的影響。方法：首先，表達(dá)和純化重組鞭毛素蛋白即全長(zhǎng)鞭毛素蛋白FliC(同時(shí)激活TLR5和NLRC4兩條通路)； FliCΔ90-97(不能激活TLR5通路)；FliC-L3A(不能激活NLRC4通路)；FliCΔ90-97:L3A(兩條通路都不激活)。將小鼠分為5組，分別為:PBS組、FliC組、FliC-L3A組、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A組。分別用PBS和10 μg重組鞭毛素蛋白腹腔注射C57BL/6小鼠，每組3只。12 h后收集腹腔灌洗液，流式抗體染色檢測(cè)腹腔灌洗液中的中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例。同時(shí)，取小鼠脾臟制成脾細(xì)胞懸液，流式抗體染色檢測(cè)DC表面共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)情況及脾細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的比例。結(jié)果：激活TLR5(FliC組和FliC-L3A組)和NLRC4通路(FliCΔ90-97組)小鼠的腹腔灌洗液中中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例都顯著高于PBS組和FliCΔ90-97:L3A組(P<0.01)。激活TLR5通路的FliC組和FliC-L3A組的DC表面CD80和CD86表達(dá)水平顯著高于PBS組、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A組(P<0.01)。FliC-L3A組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例高于其他組(P<0.05)。結(jié)論：激活TLR5和NLRC4通路可以趨化中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞，兩條通路激活對(duì)中性粒、NK細(xì)胞有相同的趨化能力。鞭毛素蛋白只有激活TLR5通路才可以上調(diào)DCs表面共刺激分子CD80和CD86，促進(jìn)DCs的成熟。

[關(guān)鍵詞]鞭毛素蛋白；TLR5；NLRC4；先天免疫細(xì)胞；DC；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

先天免疫系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)抵擋外來微生物感染和異種物質(zhì)入侵的第一道防線，而且其免疫監(jiān)視的功能對(duì)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)起重要作用。模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRR)主要包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs),Nod樣受體(Nucleotide binding digomerization domain-like recep-tors，NLRs)等[1]。PRRs識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)[2]，誘導(dǎo)先天免疫細(xì)胞分泌Ⅰ型干擾素、炎性細(xì)胞因子、趨化因子而發(fā)揮先天防御的功能[3]。

鞭毛素是細(xì)菌鞭毛的重要構(gòu)成組件，也是一種重要的PAMPs。鞭毛素蛋白作為TLR5的天然配體，激活TLR5介導(dǎo)的信號(hào)通路，啟動(dòng)促炎基因的表達(dá)。同時(shí)可以被胞內(nèi)的NAIP5/NLRC4結(jié)合識(shí)別，組裝成NLRC4炎癥小體(Inflammasome)。NLRC4炎癥小體激活Caspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體并釋放成熟的IL-1β和IL-18，同時(shí)亦可引起細(xì)胞的凋亡[4,5]。在獲得性免疫方面，鞭毛素蛋白的佐劑效應(yīng)及其特異性的抗體應(yīng)答與TLR5和NLRC4通路密切相關(guān)[6]。李偉等報(bào)道了NLRC4通路的激活減弱了TLR5介導(dǎo)的鞭毛素特異性的獲得性免疫應(yīng)答[7]。另外，鞭毛素蛋白可以通過激活乳腺癌細(xì)胞上的TLR5抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，NLRC4炎癥小體在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[8]，而且腫瘤微環(huán)境是免疫抑制性的，限制了殺傷性T細(xì)胞和NK細(xì)胞等對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。也有文獻(xiàn)報(bào)道鞭毛素蛋白能夠增強(qiáng)疫苗的抗腫瘤效果[9]。鞭毛素蛋白的免疫學(xué)特性與其對(duì)TLR5和NLRC4兩條通路的激活密切相關(guān)。目前，TLR5和 NLRC4通路的激活在對(duì)先天免疫細(xì)胞的影響中的差異還不清楚。本研究通過利用重組的鞭毛素蛋白同時(shí)或者單獨(dú)激活TLR5和NLRC4通路探討了其對(duì)先天免疫細(xì)胞的影響，為今后鞭毛素蛋白在抗腫瘤免疫中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠(購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司)，所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都飼養(yǎng)在清潔級(jí)的環(huán)境條件下，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作按照動(dòng)物保護(hù)指導(dǎo)條例進(jìn)行。

1.1.2主要試劑IPTG；30 kD透析袋，鎳離子螯合樹脂層析柱，Western配膠試劑，胰蛋白胨和酵母提取物(北京索萊寶公司)；考馬斯亮藍(lán)R-250，Bradford蛋白定量試劑盒；LDH檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)；人IL-8 ELISA KIT，小鼠IL-1βELISA KIT(武漢博士德公司)；熒光標(biāo)記抗小鼠流式抗體均購自BD公司；Gibco DMEM，0.25%胰酶(Hyclone)；鱟試劑(廈門鱟試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1鞭毛素蛋白的制備已構(gòu)建的帶有His標(biāo)簽的鞭毛素蛋白不同突變體質(zhì)粒的大腸埃希菌(中科院武漢病毒所黏膜免疫學(xué)科組惠贈(zèng))分別是：全長(zhǎng)鞭毛素蛋白FliC(同時(shí)激活TLR5和NLRC4兩條通路)；缺失90-97氨基酸的FliC克隆FliCΔ90-97 (僅能激活NLRC4通路)；FliC末端三個(gè)亮氨酸突變?yōu)楸彼岬目寺liC-L3A(僅能激活TLR5通路)；同時(shí)缺失90-97氨基酸和末端 3個(gè)亮氨酸突變?yōu)楸彼岬目寺liCΔ90-97:L3A(兩條通路都不能激活)。具體方法如下：將帶有四種FliC質(zhì)粒菌擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)FliC蛋白。超聲破碎儀破碎菌液(置于冰水中)至清亮，離心12 000 r/min，20 min收集上清，鎳離子親和樹脂層析純化目的蛋白(圖1)。根據(jù)電泳結(jié)果選取蛋白量較多的管轉(zhuǎn)到透析袋，PBS透析兩次，2 h/次，第三次透析過夜。

1.2.2Triton X-114去除內(nèi)毒素透析后的鞭毛素蛋白轉(zhuǎn)到小燒杯中，按1%(v/v)加入Triton X-114，4℃磁力攪拌30 min。將上述蛋白液吸到EP管，37℃放置10 min。12 000 r/min，37℃離心20 min，將上清小心吸出，不要吸到沉淀。重復(fù)上述步驟4次，離心后的蛋白上清在超凈臺(tái)無菌分裝，凍存在-80℃冰箱備用。

1.2.3蛋白濃度定量(Bradford法)和內(nèi)毒素檢測(cè)(鱟試驗(yàn))經(jīng)鱟試劑檢測(cè)四種蛋白的內(nèi)毒素殘留均低于0.01 EU/mg蛋白(見表1)。

1.2.4重組鞭毛素蛋白活性檢測(cè)方法見參考文獻(xiàn)[7,10]，利用人腸上皮細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞檢測(cè)TLR5通路激活：Caco-2細(xì)胞系組成性表達(dá)TLR5，激活TLR5可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子IL-8的分泌。將培養(yǎng)好的Caco-2細(xì)胞傳代接種至24孔板，約2×105個(gè)細(xì)胞/孔，10%FBS高糖DMEM，37℃，5%CO2培養(yǎng)。細(xì)胞極化好后換用無血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞饑餓8～12 h后，吸棄培養(yǎng)基。用無血清培養(yǎng)基將各鞭毛素蛋白稀釋成10 μg/ml，每組三個(gè)重復(fù)，刺激6 h收集上清，檢測(cè)IL-8的濃度。

LDH釋放被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測(cè)。因?yàn)镹LRC4通路的激活可以引起細(xì)胞的死亡，并釋放LDH和IL-1β[10]。因此，我們?nèi)”廾氐鞍状碳ば∈蟾骨辉奘杉?xì)胞通過檢測(cè)IL-1β和LDH釋放來檢測(cè)NLRC4的激活。眼球放血后處死小鼠，在超凈臺(tái)中PBS灌洗腹腔，灌洗液離心后棄上清后加約1 ml 10%FBS的RPMI1640，混勻后細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)量，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞鋪于96孔板。過夜洗去未貼壁細(xì)胞，LPS(50 ng/ml)預(yù)處理3 h，加鞭毛素蛋白(10 μg/ml)刺激20 h，以上均嚴(yán)格無菌操作，收集上清檢測(cè)LDH和IL-1β。

1.2.5IL-8和IL-1β的檢測(cè)方法見博士德公司IL-8和IL-1β試劑盒操作說明書。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組鞭毛素蛋白對(duì)小鼠先天免疫細(xì)胞的影響制備小鼠腹腔細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液。隨機(jī)將C57BL/6小鼠分成5組，每組3只，每只小鼠分別腹腔注射100 μl PBS和10 μg重組鞭毛素蛋白。刺激12 h，眼球放血后，頸椎脫臼處死小鼠。用PBS灌洗腹腔，制成腹腔細(xì)胞懸液；并取小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液。PBS清洗一遍，離心棄上清剩余約1 ml PBS充分混勻。取30 μl細(xì)胞懸液做流式染色：脾細(xì)胞(CD11c-PE、CD86-PEcy7、CD80-FITC、CD4-PerCP和CD25-FITC)；腹腔細(xì)胞(CD11b-PerCP、Gr1-FITC和NK1.1-PE)，同時(shí)做同型對(duì)照染色，上流式細(xì)胞儀BD FACSCalibur 檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1鞭毛素蛋白的表達(dá)純化及定量經(jīng)鎳離子樹脂柱純化的鞭毛素蛋白，電泳顯示分子量約50 kD，雜蛋白量較少(圖1)。經(jīng)鱟試驗(yàn)檢測(cè)，純化的蛋白內(nèi)毒素均小于0.01 EU/mg，滿足實(shí)驗(yàn)要求。同時(shí)，我們也檢測(cè)了重組鞭毛素蛋白的濃度，結(jié)果見表1。

2.2鞭毛素蛋白的活性檢測(cè)四種重組鞭毛素蛋白刺激Caco-2細(xì)胞系，結(jié)果顯示能夠激活TLR5通路的全長(zhǎng)FliC組和FliC-L3A組IL-8分泌與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)，而不能激活TLR5通路的FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A組IL-8分泌跟對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖2A)。

圖1　純化所得四種重組鞭毛素蛋白SDS-PAGE電泳Fig.1　Four purified recombinant flagellin by SDS-PAGENote: From left to right are FliC,FliCΔ90-97,FliC-L3A，F(xiàn)liCΔ90-97:L3A and marker.

四種重組鞭毛素蛋白刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，通過檢測(cè)IL-1β和LDH釋放來檢測(cè)激活NLRC4的能力。結(jié)果顯示，全長(zhǎng)FliC和FliCΔ90-97有激活NLRC4的活性(P<0.01)，而FliC-L3A和FliCΔ90-97：L3A無激活NLRC4的能力(P>0.05)(圖2B和2C)。結(jié)果顯示重組鞭毛素蛋白生物學(xué)活性符合預(yù)期。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鞭毛素蛋白對(duì)先天免疫細(xì)胞的影響

2.3.1對(duì)腹腔NK和粒細(xì)胞比例的影響結(jié)果顯示，單獨(dú)或同時(shí)激活TLR5和NLRC4通路，對(duì)中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞有相似的趨化能力即FliC組、FliCΔ90-97和FliC-L3A組腹腔細(xì)胞懸液中的中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞的比例無差異(圖3A和3B)，但都明顯高于FliCΔ90-97:L3A和對(duì)照組(P<0.01)。

表1Bradford法鞭毛素蛋白定量

Tab.1Quantification of flagellin by Bradford method

FliCFliCΔ90-97FliC-L3AFliCΔ90-97:L3AConcentration(mg/ml)2.983.242.954.81

圖2　四種重組鞭毛素蛋白激活TLR5和NLRC4通路的生物學(xué)活性檢測(cè)Fig.2　Bioactivity of four recombinant flagellins to activate TLR5 and NLRC4 pathwaysNote: **.P<0.01；***.P<0.001.

圖3　重組鞭毛素蛋白對(duì)腹腔NK和粒細(xì)胞比例的影響Fig.3　Impact of recombinant flagellin on propertion of innate immune cells in peritoneal cavity of miceNote: **.P<0.01.

圖4　重組鞭毛素蛋白對(duì)小鼠脾臟DC和Treg比例的影響Fig.4　Impact of recombinant flagellin on propertion of splenic DC and Treg in miceNote: *.P<0.05.

圖5　重組鞭毛素蛋白對(duì)小鼠脾臟中DC表面CD80和CD86表達(dá)的影響Fig.5　Impact of recombinant flagellin on expression of CD80 and CD86 on splenic DC in miceNote: **.P<0.01.

2.3.2對(duì)脾臟DC和Treg比例的影響流式分析如圖4A所示。結(jié)果顯示，激活TLR5通路可以增加脾臟中DC和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。FliC-L3A組Treg高于FliC(P<0.05)，而FliC和FliCΔ90-97組、FliCΔ90-97:L3A組、對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖4A)；FliC組和FliC-L3A組DC比例高于FliCΔ90-97組、FliCΔ90-97:L3A組和對(duì)照組(P<0.05)(圖4B)。

2.3.3對(duì)脾臟DC表面共刺激分子CD80和CD86的影響結(jié)果顯示，激活TLR5使DC表面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)liC組和FliC-L3A組CD80(圖5A)和CD86(圖5B)的平均熒光強(qiáng)度明顯高于FliCΔ90-97組和FliCΔ90-97:L3A組(P<0.01)，即促進(jìn)DC成熟主要是通過激活TLR5通路起作用。

3討論

模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)是免疫系統(tǒng)檢測(cè)入侵病原，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，聯(lián)系先天免疫和獲得性免疫的重要橋梁，主要包括TLRs和NLRs。鞭毛素蛋白具有激活胞外TLR5和胞漿NLRC4兩條通路的能力。鞭毛素蛋白誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，趨化炎性相關(guān)細(xì)胞與其激活TLR5和NLRC4通路密切相關(guān)。激活TLR5通路主要產(chǎn)生IL-8、MCP-1、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子和趨化因子，而NLRC4通路的激活主要產(chǎn)生IL-18和IL-1β，兩條通路的激活調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的趨化、成熟和分化。但是這兩條通路在激活先天免疫方面相互間的作用如何，尚未見相關(guān)研究。因此本研究利用重組的鞭毛素蛋白，來探討單獨(dú)或者同時(shí)激活TLR5和NLRC4通路對(duì)先天免疫細(xì)胞的影響。

本研究結(jié)果顯示，激活TLR5的FliC-L3A組、FliC組和激活NLRC4的FliCΔ90-97誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的能力相似。激活DC表面TLR5對(duì)DC的成熟起主要作用，單獨(dú)激活NLRC4通路并不能促進(jìn)DC的成熟，與之前研究結(jié)果一致[11]。文獻(xiàn)報(bào)道的鞭毛素蛋白的佐劑效應(yīng)與TLR5和NLRC4通路相關(guān)，本研究也揭示了NLRC4通路介導(dǎo)的鞭毛素蛋白的佐劑效應(yīng)并不是通過對(duì)DC的激活而介導(dǎo)的。但對(duì)于CD4+CD25+Treg激活TLR5上調(diào)其比例，激活NLRC4抵消了單獨(dú)激活TLR5的效應(yīng)，F(xiàn)liC組Treg比例低于FliC-L3A(P<0.05)。TLR5和NLRC4通路激活對(duì)于Treg活性的影響還需進(jìn)一步探討，之前有報(bào)道TLR5可以增強(qiáng)Treg抑制活性。

Toll受體不僅在先天免疫防御中起重要作用，Toll受體的差異表達(dá)和腫瘤侵襲有關(guān)，鞭毛素蛋白激活乳腺癌細(xì)胞上的TLR5可以直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[12]。鞭毛素蛋白還有可能通過NLRC4信號(hào)通路來參與介導(dǎo)免疫細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞釋放的趨化因子能夠募集不同的炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞。其中Treg細(xì)胞的大量募集，導(dǎo)致了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，抑制了抗腫瘤免疫細(xì)胞的功能。在抗腫瘤方面，NK細(xì)胞是早期對(duì)致病菌和腫瘤產(chǎn)生先天免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞[13]。它能夠通過激活DC，促進(jìn)其分化而誘導(dǎo)Th1和CTL反應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答，在抗腫瘤的免疫治療中發(fā)揮重要作用[14]。粒細(xì)胞也被認(rèn)為具有重要的抗腫瘤效應(yīng)[15]。Tsujimoto等[16]報(bào)道了鞭毛素蛋白能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力，我們的研究也發(fā)現(xiàn)了TLR5和NLRC4通路的激活都可以增加NK細(xì)胞的比例。另外，鞭毛素蛋白作為重要的免疫免疫佐劑，能夠有效的激活機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性的T細(xì)胞應(yīng)答和抗體應(yīng)答。提示我們鞭毛素蛋白可能通過增強(qiáng)腫瘤特異性的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答、增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能而抑制腫瘤生長(zhǎng)，另一方面鞭毛素蛋白也可能通過激活DC而減弱機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受。

本研究初步揭示了TLR5和NLRC4通路對(duì)先天免疫細(xì)胞的影響，為我們進(jìn)一步利用鞭毛素蛋白進(jìn)行抗腫瘤免疫治療提供依據(jù)，但是這兩條通路在抗腫瘤免疫中的作用仍然需要我們做進(jìn)一步的研究。

致謝：感謝中國科學(xué)院武漢病毒所鄢慧民研究員在實(shí)驗(yàn)材料提供方面給予的大力幫助，感謝貴州省人民醫(yī)院劉水和老師在流式操作上給予的協(xié)助。

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[收稿2015-12-24修回2016-01-12]

(編輯許四平)

Impact of TLR5 and NLRC4 activation on innate immune cells in mice

ZHUO Zhao-Zhen,LI Wei,YUAN Jun.

Department of Immunology,Guizhou Medcial University,Guiyang 550004,China

[Abstract]Objective:To investigate the impact of recombinant flagellin targeting TLR5 and NLRC4 simultaneously or respectively on innate immune cells in mice.Methods: Induction,expression,purification and identification of recombiant FliC,which were FliC(activating both TLR5 and NLRC4);FliCΔ90-97(unable to activate TLR5),FliC-L3A(unable to activate NLRC4),FliCΔ90-97:L3A(unable to activate both TLR5 and NLRC4).The mice were divided into five groups,namely group FliC,FliC-L3A,FliCΔ90-97,FliCΔ90-97:L3A and PBS,which were injected with 100 μl PBS or 10 μg recombinant flagellin intraperitoneally,three mice in each group.12 h later,the mice were executed using dislocation of cervical vertebra and the splenic and peritoneal cells were isolated.The spleen was grinded into single-cell suspension.The proportion of neutrophils,NK cells,DCs and the expression level of CD80 and CD86 on DCs were evaluated with flow cytometry.Results: Group FliC,group FliC-L3A and group FliCΔ90-97 shared the similar proportion of neutrophils in peritoneal cavity(P>0.05),and all of which were significantly higher than group PBS and group FliCΔ90-97(P<0.01),and NK cells also showed the similar trend.Compared with group FliCΔ90-97 and FliCΔ90-97:L3A，the mean fluorescence intensities(MFIs) of CD80 and CD86 in group FliC and FliC-L3A increased significantly(P<0.01).The proportion of Treg in spleen was highest among all groups.Conclusion: Activation of TLR5 and NLRC4 had similar chemotaxis of neutrophils and NK cells.The expression of CD80 and CD86 on DCs were upregulated after stimulation by flagellin and TLR5-dependent.Activation of TLR5,but not NLRC4,increased the proportion of Treg in spleen.

[Key words]Flagellin;TLR5;NLRC4;Innate immune cells;DC;Treg

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.007

作者簡(jiǎn)介：卓召振(1987年-)，男，在讀碩士，檢驗(yàn)師，主要從事腫瘤免疫的研究，E-mail：475059537@qq.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：袁軍(1970年-)，女，博士，教授，主要從事器官移植和腫瘤免疫方面的研究，E-mail：junyuan99430@163.com。

中圖分類號(hào)R392.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0803-05

①本文受貴州省衛(wèi)計(jì)委科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(gzwjkj2015-1-020)、國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)子課題(2011AA02A111)和貴州省人民醫(yī)院博士基金(GZSYBS[2015]11號(hào))資助。

②并列第一作者。

③貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴陽550002。