大鼠腦出血后血腫周圍組織中樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫功能研究

楊　斐　李小剛(通訊作者)

1)成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院　成都　610100　　2)瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　瀘州　646000

大鼠腦出血后血腫周圍組織中樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫功能研究

楊斐1)李小剛2)(通訊作者)

1)成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院成都6101002)瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科瀘州646000

【摘要】目的觀察實(shí)驗(yàn)性大鼠腦血腫周圍組織樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)的分布情況，進(jìn)一步分析腦出血后不同時(shí)相內(nèi)，DC在局部中樞性神經(jīng)組織中免疫功能的作用。方法制作實(shí)驗(yàn)性大鼠基底節(jié)區(qū)腦血腫模型，分別檢測(cè)24 h、48 h、72 h、5 d和7 d各時(shí)相點(diǎn)神經(jīng)功能障礙、腦組織水腫情況及局部腦組織中IL-6和GM-CSF的濃度、陽(yáng)性DC數(shù)量。結(jié)果出血組GM-CSF濃度在48 h時(shí)增加，隨后仍保持持續(xù)性上升。實(shí)驗(yàn)組IL-6濃度在術(shù)后48 h達(dá)到高峰，隨后下降；實(shí)驗(yàn)組DC在術(shù)后24 h時(shí)觀察到，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加。結(jié)論實(shí)驗(yàn)大鼠腦出血周圍組織中的微狀態(tài)變化，將限制和影響DC在不同時(shí)相的作用。在腦出血前期促進(jìn)腦組織損害，腦出血后期有利于局部腦組織修復(fù)。

【關(guān)鍵詞】樹(shù)突狀細(xì)胞；腦血腫；免疫反應(yīng)

研究表明，腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后，其血腫周邊組織中發(fā)生的免疫反應(yīng)，密切影響病變區(qū)域神經(jīng)組織病變。目前，研究發(fā)現(xiàn)，樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)存在于腦組織中，有極強(qiáng)的抗原呈遞現(xiàn)象[1]，并積極參與免疫反應(yīng)。但在腦血腫周邊組織中的炎癥反應(yīng)中，DC的作用尚無(wú)明確研究報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)大鼠腦血腫不同時(shí)相DC陽(yáng)性數(shù)量的變化，研究DC在ICH后繼發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)損傷中的作用。

1材料與方法

1.1材料SD大鼠50只。鼠立體定向儀；Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)；小鼠抗大鼠單克隆抗體OX62；IL-6、GM-CS檢測(cè)ELISA試劑盒；其他常用實(shí)驗(yàn)器材等。

1.2方法實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為腦出血組20只，假手術(shù)組20只。備用10只，用于模型失敗補(bǔ)充。根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)相再分為術(shù)后24 h、48 h、72 h、5 d、7 d 5個(gè)亞組。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物通過(guò)麻醉、固定、頭顱鉆孔。采集大鼠尾部凝固血液50 μL，在鼠立體定向儀引導(dǎo)下緩慢注入大鼠尾狀核。對(duì)照組不注血，余同上。根據(jù)Longa等[2]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，確定模型是否合格。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)按Schaar等[3]的神經(jīng)功能障礙評(píng)定方法評(píng)分后再行處死，立即取出全部腦組織，選取注射點(diǎn)前部腦組織檢測(cè)含水量。后部組織近血腫處用于固定蠟塊制作。腦組織含水量檢測(cè)：使用干/濕法測(cè)定不同時(shí)相標(biāo)本含水量。免疫組化染色法(S-P法)：具體操作步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行。簡(jiǎn)化操作步驟：固定蠟塊標(biāo)本切片、制片(片厚4 μm)，脫蠟后切片PBS液洗3次，行抗原修復(fù)，滴加過(guò)氧化酶阻斷劑10 min。而后依次PBS液洗5 min，兔血清封閉，加入mAbOX62(一抗、37 ℃、2 h)、二抗(37 ℃、2 h)及加親和素標(biāo)記的HRP，PBS液洗5 min。3-氨基-9-乙基卡巴唑顯色5 min。蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，陽(yáng)性DC細(xì)胞染呈紅色，其他細(xì)胞染色為藍(lán)色。CD83抗原修復(fù)操作：于0.1%胰蛋白酶CaCl2中 37 ℃消化20 min。細(xì)胞計(jì)數(shù)參照Molin法，用Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)每10 mm2單位面積的腦組織中含有陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能障礙評(píng)分各觀察時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)功能障礙評(píng)分見(jiàn)表1。

表1　2組術(shù)后神經(jīng)功能障礙評(píng)分比較±s)

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.05

2.2腦組織含水量測(cè)定見(jiàn)表2。

表2術(shù)后2組大鼠不同時(shí)相標(biāo)本中含水含量變化

組別24h48h72h5d7d假手術(shù)組77.67±0.3678.32±0.0177.96±0.2677.84±0.4877.92±0.35ICH組78.15±0.9179.49±0.25▲78.47±0.27▲78.31±0.6478.12±0.45t值0.789.182.700.790.66P值0.460.000.350.790.53

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.05

2.3腦組織IL-6含量檢測(cè)見(jiàn)表3。

表32組大鼠術(shù)后不同時(shí)相腦組織IL-6濃度變化

組別24h48h72h5d7d假手術(shù)組1.118±0.1651.153±0.2061.123±0.1871.164±0.1941.220±0.154ICH組5.884±0.365▲7.179±0.756▲6.312±0.175▲3.660±0.26▲1.876±0.245t值4.064.884.424.070.95P值0.020.000.010.030.39

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.05

2.4腦組織GM-CSF含量檢測(cè)見(jiàn)表4。

表42組大鼠術(shù)后血腫周圍腦組織中GM-CSF含量變化

組別24h48h72h5d7d假手術(shù)組1.549±0.4211.670±0.2471.587±0.2631.564±0.4211.536±0.743ICH組1.661±0.3022.638±0.624▲3.642±0.542▲4.409±0.324▲4.763±0.208▲t值0.803.593.795.066.17P值0.040.010.000.000.00

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.05

2.5血腫周圍DC細(xì)胞免疫組化染色后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在每10 mm2的切片中觀察到OX62+陽(yáng)性細(xì)胞(紅色著染，見(jiàn)圖1～4)。單位面積中含有的OX62+細(xì)胞數(shù)量變化見(jiàn)表5。24 h時(shí)ICH組OX62+細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始增加，隨后ICH組繼續(xù)增加，各觀察時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

(×400倍)

圖148 h OX62+cell

(×400倍)

圖272 h OX62+cell

(×400倍)

圖35 d OX62+cell

(×400倍)

圖47 d OX62+cell

表5　2組大鼠不同時(shí)相腦組織中OX62+數(shù)量變化

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.05

3討論

DC廣泛分布于機(jī)體的組織和器官，成熟DC發(fā)揮抗原呈遞作用[1，4]。正常情況下DC在腦組織中不易觀察到，原因可能是血腦屏障阻止了周圍DC向腦組織穿越，CNS中不具備DC分化成熟的環(huán)境。但在特定情況下，可發(fā)現(xiàn)腦組織存在成熟DC。Zozulya等[4]報(bào)道大鼠腦膜基質(zhì)中存在少量樹(shù)突狀細(xì)胞。在多發(fā)性硬化患者腦組織研究中發(fā)現(xiàn)，病理組織標(biāo)本周圍的腦實(shí)質(zhì)血管套中存在少量DC。Takato等[6]研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性大鼠腦血腫周圍的組織中有DC存在。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CNS中DC細(xì)胞的可能來(lái)源：?jiǎn)魏思?xì)胞；腦膜、脈絡(luò)叢等處的DC遷移，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的 T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化；病灶周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[7]。目前研究指出，部分炎性因子，如IL-1、IL-6、IL-12、TNF、GM-CSF等表達(dá)水平與DC有關(guān)[8]。Fischer等[9]通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GM-CSF以及腦組織共同培育能夠得到分化成熟的DC細(xì)胞，且DC細(xì)胞能夠表達(dá)MHC-Ⅱ、CD54、CD83、CD80等膜表面分子，起到抗原呈遞及免疫調(diào)節(jié)功能[10-11]。在大鼠CNS中實(shí)質(zhì)內(nèi)均有GM-CSF表達(dá)，主要來(lái)源于膠質(zhì)細(xì)胞。

本研究顯示，周圍組織中GM-CSF、OX62+細(xì)胞水平變化均顯著上升，表明在血腫崩解產(chǎn)物及炎性細(xì)胞因子的作用下病灶周圍膠質(zhì)細(xì)胞分泌、釋放GM-CSF，同時(shí)可能由于炎性因子改變了血腦屏障的通透性導(dǎo)致血液中的DC進(jìn)入腦組織，以及大腦其他部位的DC在炎性趨化因子作用下遷移到病灶周圍，從而導(dǎo)致這些成熟型DC進(jìn)一步發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。

3.1在腦出血前期的作用及機(jī)制DC是呈遞抗原能力極強(qiáng)的細(xì)胞，同時(shí)也在調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮多種作用[3，10]。機(jī)體處于病原體感染或組織壞死時(shí)，細(xì)菌核酸、組織細(xì)胞崩解產(chǎn)物等可誘導(dǎo)并趨使未成熟DC向病變部位移動(dòng)，同時(shí)逐漸分化為成熟DC，成熟DC激活初始T細(xì)胞，使之發(fā)育為輔助性T細(xì)胞(helper T cells，Th)和效應(yīng)T細(xì)胞(effector T cells，Te)，并發(fā)揮免疫應(yīng)答作用。同時(shí)成熟DC不斷分泌IL-2、IFN-γ進(jìn)一步促免疫反應(yīng)[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到48 h內(nèi)ICH組大鼠腦組織中IL-6和DC均升高。表明DC血腫形成48 h內(nèi)可能發(fā)揮促進(jìn)炎癥功能。推測(cè)其機(jī)制：該時(shí)相內(nèi)血腫崩解產(chǎn)物和隨之產(chǎn)生的壞死組織中出現(xiàn)了大量的抗原，在這些抗原和局部產(chǎn)生的免疫細(xì)胞因子刺激下，活化了DC，并發(fā)揮呈遞抗原、激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)并促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

3.2在腦出血中后期的作用及機(jī)制本實(shí)驗(yàn)中DC腦出血后48 h～7 d仍呈逐漸升高趨勢(shì)與IL-6變化相反，這一情況和其他CNS中的炎癥，如MS不一致[14]。外周DC在免疫應(yīng)答中的作用取決于其所處的環(huán)境狀況。無(wú)感染時(shí)未成熟的DC細(xì)胞接觸到自身抗原后，誘導(dǎo)抑制性T細(xì)胞分化，從而誘導(dǎo)免疫耐受[15-16]。當(dāng)病原體感染或組織出現(xiàn)壞死時(shí)，DC能夠通過(guò)促進(jìn)IFN-γ、IL-2、IL-6表達(dá)水平的升高而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[17]。通過(guò)促進(jìn)IL-5、NO的表達(dá)而抑制Th細(xì)胞分化及增殖，并促進(jìn)活化的T細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)CD8+Ts活化，發(fā)揮免疫抑制效果[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，DC細(xì)胞的增殖水平在48 h～7 d內(nèi)達(dá)到高峰，可能是由于炎癥反應(yīng)在形成血腫48 h后達(dá)到高峰水平，此時(shí)抗原水平逐漸下降。但局部病灶組織仍存在高濃度的炎癥促進(jìn)因子，如IL-1、TNF-α、IL-6等，從而導(dǎo)致DC繼續(xù)分化并成熟。但此時(shí)DC細(xì)胞周圍的微環(huán)境已出現(xiàn)變化，抗原水平不斷下降、正常組織表達(dá)增多，所以，DC不再?gòu)?qiáng)化免疫反應(yīng)，而通過(guò)增加IL-4、IL-10、IL-5、NO的表達(dá)，起到免疫抑制效果。

綜上，實(shí)驗(yàn)大鼠腦出血周圍組織中的微狀態(tài)變化，將限制和影響DC在不同時(shí)相的作用。在腦出血前期促進(jìn)腦組織損害，腦出血后期有利于局部腦組織修復(fù)。

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(收稿 2015-07-16)

Study of immune function of dendritic cells in perihematoma tissue of rats after intracerebral hemorrhage

YangFei*,LiXiaogang

*TheFirstPeople’sHospitalofLongquanyiDistrictinChengduCity,Chengdu610100,China

【Abstract】Objective To observe the distribution of dendritic cells (DC) in perihematoma tissue through the establishment of intracerebral hemorrhage (ICH) model of rat, and to analyze the immune function of dendrite cells in the local central nervous tissue, in the different phases after ICH. Methods The model of ICH in the caudate nucleus of rat was produced; and the neurological dysfunction, cerebral edema, concentration of interleukin-6 (IL-6) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) in local brain tissue, count of DC-positive were detected at 24-hour, 48-hour, 72-hour, 5-day and 7-day time points. Results The concentration of GM-CSF in ICH group began to ascend at 48-hour, and then remained persistent rose. The concentration of IL-6 in the experimental group was reached the peak at 48-hour after surgery, and then decreased; DC was observed in the experimental group at 24-hour after operation, and continued to increasing with the time prolonged. Conclusion The changes of micro environmental conditions in perihematoma tissue of ICH model of rat will restrict and influence the effect of DC according different phases. It may aggravate the brain damage in the early stage of ICH, and promote the damage tissue repaired in late stage.

【Key words】Dendritic cell; Intracerebral hemorrhage; Immune response

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)11-0029-03