不同濃度肺炎鏈球菌造成大鼠腦膜炎模型的實驗研究

董　燕　杜開先(通訊作者)　賈天明　張曉莉　張　燕　宋麗麗

1)鄭州大學第三附屬醫(yī)院神經內科　鄭州　450052　　2)河南省紅十字血液中心　鄭州　450000

不同濃度肺炎鏈球菌造成大鼠腦膜炎模型的實驗研究

董燕1)杜開先1)(通訊作者)賈天明1)張曉莉1)張燕2)宋麗麗1)

1)鄭州大學第三附屬醫(yī)院神經內科鄭州4500522)河南省紅十字血液中心鄭州450000

【摘要】目的通過不同濃度肺炎鏈球菌造成大鼠細菌性腦膜炎模型，選出最合適的造模菌株。方法3周齡SD大鼠40只隨機分為生理鹽水對照組(10只)、細菌性腦膜炎模型組(模型組分3組，每亞組各10只)。應用不同濃度(106、107、108 cfu/mL)肺炎鏈球菌Ⅲ型對大鼠腦池穿刺建立細菌性腦膜炎模型，應用等體積生理鹽水替代肺炎鏈球菌作對照組，觀察終點為動物自然死亡或造模5 d。比較各組大鼠病死率、生理指標變化、Loeffler神經行為學評分、腦組織形態(tài)學改變表達。結果高濃度組較低濃度組病死率高，體質量增長慢，體溫升高快；Loeffler神經行為學評分低，腦組織水腫明顯(P均<0.05)。結論腦池內直接注射細菌后，能誘導出細菌性腦膜炎。通過控制菌株濃度，可造成不同程度的腦膜炎模型。107 cfu/mL為最佳造模濃度。

【關鍵詞】大鼠；肺炎鏈球菌；腦膜炎；模型；實驗研究

細菌性腦膜炎是兒科中常見的危急重病，病死率和致殘率極高[1-2]。近年來國內外采用多種方式造成動物細菌性腦膜炎模型[3-5]，以此研究腦膜炎的發(fā)病機制及治療。而對不同濃度菌株造成模型的輕重程度的評估，目前國內外尚不統(tǒng)一。肺炎鏈球菌腦膜炎是我國最常見的細菌性腦膜炎之一，嬰兒期較多。本實驗旨在建立不同濃度菌株造成細菌腦膜炎的模型，為找出造模的最佳條件奠定基礎，有利于細菌性腦膜炎的防治研究。

1材料和方法

1.1細菌懸液的制備菌株購自中國藥品食品檢定研究院中國醫(yī)學細菌保藏管理中心(菌號31003)，接種于血瓊脂糖培養(yǎng)基，在37 ℃ 5%二氧化碳環(huán)境中生長過夜，再接種于VITAL AER肉湯里，生長至對數(shù)生長中期收菌，離心，用生理鹽水沖洗，再離心，用鹽水稀釋105～108cfu/mL。

1.2腦膜炎的誘導取自鄭州大學醫(yī)學實驗動物中心3周齡SD大鼠50只，雌雄不限。隨機分為鹽水對照組(S組，n=10)、實驗組(E1、E2、E3，n=10)。用10%水合氯醛液2 mL/kg腹腔注射麻醉后，固定于立體定向儀，腦膜炎的誘導改進于劉心潔、Diab等[4-7]的方法，小腦延髓池穿剌，移去50 μL腦脊液并培養(yǎng)，試驗組注入50 μL 106～108cfu/mL肺炎鏈球菌懸液，對照組注射50 μL生理鹽水，置籠中喂養(yǎng)，每日記錄大鼠體溫、體質量，觀察臨床表現(xiàn)。觀察終點為動物自然死亡或造模5 d，深麻醉后再從腦池取腦脊液50 μL做培養(yǎng)，斷頭處死大鼠。

1.3大鼠Loeffler的神經行為學評分按5分制評分方法進行評估。5分：抓住背部時能正常運動，5 s內翻身；4分：自主運動減少，5 s內能翻身；3分：>5 s翻身；2分：不能翻身；1分：不能運動。

1.4HE染色切片觀察斷頭后肉眼觀察腦組織，取左側大腦4%多聚甲醛固定過夜，脫水、冠狀切片石蠟包埋，切成5 μm厚切片，做HE染色切片。顯微鏡下觀察組織細胞學形態(tài)。

2結果

2.1臨床表現(xiàn)及病死率E1組大鼠僅表現(xiàn)精神稍差、進食少，無死亡大鼠；E2組大鼠出現(xiàn)精神差、拒食、嗜睡、反應遲鈍，4例死亡(2例造模第2天死亡，1例造模第3天死亡，1例第4天死亡)，病死率40%；E3組運動失調，原地打轉，四肢發(fā)紺，最終昏迷伴全身抽搐、死亡，造模1 d內全部死亡，病死率100%。E2、E3組病死率較S組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，E3組病死率較E2組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2腦脊液培養(yǎng)E組感染前腦脊液無細菌生長，感染后24 h腦脊液培養(yǎng)出與接種同株的肺炎鏈球菌。S組注射前后均無細菌生長。

2.3體溫、體質量的改變見表1、2。初始各組體溫比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，E1、E2組體溫均趨于上升趨勢(P<0.05)，造模24 h、48 h、5 d體溫E2組較E1組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1　各組大鼠體溫比較，℃)

注：與S組同時間點比較，#P<0.05；與E1組同時間點比較，*P<0.05；與同組初始時間點比較，@P<0.05；與同組24 h比較，%P<0.05

表2　各組大鼠體質量比較±s，g)

注：與S組同時間點比較，#P<0.05；與E1組同時間點比較，*P<0.05

各組初始體質量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，48 h、5 d體質量E1組較同時間點S組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，24 h、48 h、5 d體質量E2組較同時間點S組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4Loeffler神經行為學評分見表3。同時間點比較E1、E2組較S組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E2與E1相同時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3　各組大鼠Loeffler神經行為學評分比較

注：與S組同時間點比較，#P<0.05；與E1組同時間點比較，*P<0.05

2.5腦組織肉眼觀察及病理形態(tài)學觀察造模5 d處死大鼠取腦組織肉眼觀察，S組無異常，E組水腫明顯，有炎癥粘連和灶性出血。HE染色切片觀察：S組無病理性損傷，造模組大鼠腦組織形態(tài)發(fā)生明顯改變，E1組神經元細胞出現(xiàn)固縮，細胞及血管周圍出現(xiàn)腔隙；E2組神經元細胞固縮明顯，血管周圍腔隙明顯增寬，可見炎性細胞浸潤(圖1)。

對照組

E1組5 d

E2組5 d

3討論

細菌性腦膜炎是兒童常見的疾病之一，部分可遺留嚴重的神經系統(tǒng)后遺癥，肺炎鏈球菌性是嬰兒顱內感染病原菌中最多見的細菌[6-8]。系統(tǒng)研究肺炎鏈球菌型腦膜炎，在該病的診斷治療、減少甚至避免并發(fā)癥的出現(xiàn)等領域起至關重要的作用。

目前，國內外腦膜炎的動物模型的建立可通過不同的方法，樊一斌等[9]通過尾靜脈接種隱球菌構建小鼠中樞神經系感染模型，與本研究造模方式不同；Huang等[10]通過幼鼠延髓小腦池注入B族溶血性鏈球菌構建大鼠腦膜炎模型，與本研究腦膜炎類型不同；Cao等[11]通過對3%氯化鈉溶液對脂多糖造成的腦水腫模型中作用的研究與腦水腫相關的AQP4的表達，與本研究造模方式及研究目的不同，且目前對不同程度腦膜炎大鼠臨床表現(xiàn)的研究甚少。本文旨在通過對大鼠小腦延髓池注射菌株造成腦膜炎模型，通過病死率、腦脊液培養(yǎng)、病理形態(tài)學觀察等證實模型制造成功。同時發(fā)現(xiàn)，菌株濃度不同，大鼠臨床表現(xiàn)各異，Loeffler的神經行為學評分107較106組低。各組時間點體溫、體質量變化差異有統(tǒng)計學意義。為此，可通過控制菌株的濃度造成不同程度腦膜炎模型。

總之，通過對不同濃度菌株造成腦膜炎模型，通過大鼠臨床表現(xiàn)、神經行為學評分、體質量改變、病死率、腦組織病理學改變，最終表明107cfu/mL為最佳造模濃度，造模后及時治療是控制病死率的關鍵。通過本實驗可評估造模成功與否并了解造模輕重程度，利于探討腦水腫的發(fā)生機制，為細菌性腦膜炎的診治奠定基礎。

4參考文獻

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(收稿 2015-06-21)

Study of bacterial meningitis models in rats induced by different concentration of bacteria

DongYan*，DuKaixian，JiaTianming，ZhangXiaoli，ZhangYan，SongLili

*DepartmentofPediatric，theThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，ChinaCorrespondingauthor：DuKaixian

【Abstract】Objective To choose the most approprite bacterial concentration to induce bacterial meningitis model.Methods Sprague-Dawley rats on postnatal 3 weeks were divided into 4 groups randomly.The model groups were established by direct intracisternal injecting different concentration of streptococcus pneumoniae Ⅲ(SPⅢ)(106，107，108 cfu/mL)into cerebellomedullary cistern，the saline(NS)control group was injected by NS.The end was the death of the rats or days after model established.The rats were observed death rate，the physiological index，Loeffler’s neuroethology score，etc.Results The death rate of high concentration group was higher than that of the low concentration group，while the weight growth was slower，the body temperature increased faster，Loeffler neurobehavioral score was lower and brain tissue was more obviously edema(P<0.05).Conclusion Bacterial meningitis model could be induced by direct intracisternal injection of a suspension of SPⅢ on postnatal 3 weeks in SD rats.To control the concentration of the bacteria could control the degree of the bacterial meningitis model.107 cfu/mL was the most comfortable concertration to induce the model.

【Key words】SD rat；Streptococcus pneumoniaeⅢ；Bacterial meningitis；Model；Study

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)11-0023-02