高效液相色譜法測(cè)定天黃猴棗散中膽紅素的含量

羅軼　丘明明

【摘要】目的：建立天黃猴棗散中膽紅素HPLC含量測(cè)定方法。方法：采用CAPCELLPAK C18色譜柱（250mm×46mm，5μm），以乙腈-甲醇-01%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至60）（13∶50∶37）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)451nm。結(jié)果：膽紅素在001931～19309μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系；回收率為1003% ，RSD=25%（n=9）。結(jié)論：本法專(zhuān)屬性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速，精密度良好。

【關(guān)鍵詞】膽紅素；含量測(cè)定；HPLC；天黃猴棗散

【中圖分類(lèi)號(hào)】R2841【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）10-0014-02

Abstract：Objective To establish a method of determinating content of bilirubin in Tianhuang Houzao Powder by HPLC.Methods A CAPCELLPAK C18（250mm×46mm，5 μm）column was used with acetonitril-menthol-01%Phosphoric acid solution （adjust pH to 60 with triethylamine ）（13∶50∶37） as the mobile phase.Detector wavelength was 451nm.Results The linearity was obtained over the range of 001931～19309μg.The mean recovery was 1003%，RSD=25%（n=9）.Conclusion The method was sensitive.simple and accurate.

Keywords：Bilirubin；Content determination；HPLC；Tianhuang Houzao powder

天黃猴棗散具有清心，豁痰，開(kāi)竅，涼肝，息風(fēng)，解毒的功效。臨床常用于熱病神昏，中風(fēng)痰迷，驚厥抽搐，癲癇發(fā)狂，咽喉腫痛，口舌生瘡，癰腫疔瘡。處方中體外培育牛黃為的君藥，而膽紅素為體外培育牛黃主要有效成分之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，膽紅素是一個(gè)直鏈四吡咯化合物，在人體內(nèi)是血紅素的代謝（分解）產(chǎn)物。藥理研究表明，膽紅素有解熱、降壓、抗病毒、抗衰老、抗癌和促進(jìn)紅血球新生的作用。選擇膽紅素作為含量測(cè)定指標(biāo)，可反映和控制天黃猴棗散的內(nèi)在質(zhì)量。研究采用高效液相色譜法測(cè)定天黃猴棗散中膽紅素的含量。

1儀器與材料

11儀器美國(guó)Agilent高效液相色譜儀（含DAD檢測(cè)器、Chemstations色譜工作站）；MILLI-PROA純水處理器。

12材料膽紅素對(duì)照品（批號(hào)：100077-200503，中國(guó)藥品生物制品檢定所。經(jīng)歸一化法檢查，純度以膽紅素X Ⅲα、 Ⅸα、 Ⅷα三個(gè)異構(gòu)體峰面積之和計(jì)算，為9772%）。 天黃猴棗散為廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司和廣州敬修堂（藥業(yè)）股份有限公司提供。陰性樣品為廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純，水為高純水，其它試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

21色譜條件色譜柱：CAPCELLPAK C18柱（250mm×46 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-01%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至60）（13∶50∶37）；檢測(cè)波長(zhǎng)：451nm；柱溫30℃；流速10 ml/min；進(jìn)樣量：5μl。在此色譜條件下，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[2]，膽紅素三個(gè)異構(gòu)體出峰順序?yàn)閄 Ⅲα、Ⅸα、 Ⅷα，三個(gè)異構(gòu)體之間能完全分離，且與其他雜質(zhì)峰有很好的分離。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

22對(duì)照品溶液的制備取膽紅素對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加二甲基亞砜制成每1ml含20μg的溶液，即得。

23供試品溶液的制備取本品適量，混勻，取約50mg，精密稱(chēng)定，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入二甲基亞砜25ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率400W，頻率40KHz）30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用二甲基亞砜補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

24線(xiàn)性關(guān)系考察精密稱(chēng)取膽紅素對(duì)照品988mg，置25ml棕色量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品取貯備液05、05ml，分別置50、20ml棕色量瓶中，再精密量取對(duì)照品取貯備液05、10、15、20、30、50、10ml，分別置10ml棕色量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液。取5μl上述對(duì)照品溶液按“21”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=62204×103X-58761，r=10000。表明膽紅素在001931～19309μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

25精密度試驗(yàn)取同一供試液，在“21”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)測(cè)定6次，記錄各峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果6次測(cè)定膽紅素平均峰面積RSD=06%，表明儀器精密度良好。

26重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品6份，按“23”項(xiàng)下的方法制備，按“21”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定。結(jié)果 6份樣品測(cè)得膽紅素含量的平均值為119323mg/g，RSD=11%，結(jié)果表明本法的重復(fù)性較好。

27穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試液，按“21”項(xiàng)色譜條件分別在0、2、5、7、9、13、18、22、27h測(cè)定。結(jié)果供試品溶液在9h內(nèi)峰面積RSD=28%，13 h后峰面積RSD=42%，27 h后峰面積RSD=54%，表明應(yīng)在9小時(shí)內(nèi)完成膽紅素的測(cè)定。

28加樣回收率試驗(yàn)

281加樣用對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取膽紅素對(duì)照品1060mg，置25ml量瓶中，加二甲基亞砜使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為膽紅素對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液15、30、50ml，分別置A、B、C三個(gè)100ml量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得

282加樣回收試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量的天黃猴棗散25mg，共9份，1～3份分別精密加入“281”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液A 25ml，4～6份分別精密加入對(duì)照品混合溶液B 25ml，7～9分別精密加入對(duì)照品混合溶液C 25ml，按“23”項(xiàng)下的方法提取，即得。精密吸取5μl注入液相色譜儀，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

29干擾實(shí)驗(yàn)取陰性樣品，按“23”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，測(cè)定，結(jié)果陰性樣品在膽紅素峰相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明處方中成分對(duì)測(cè)定無(wú)影響。

210樣品測(cè)定對(duì)2個(gè)不同生產(chǎn)單位的10批樣品進(jìn)行膽紅素含量測(cè)定，結(jié)果含量在95～116mg/g之間。

3討論

31測(cè)定成分的選擇參考文獻(xiàn)[3]，體外培育牛黃在制備過(guò)程中，受生產(chǎn)工藝、酸、堿、光、熱及貯存條件等因素影響，雙吡咯環(huán)產(chǎn)生異構(gòu)化，即X Ⅲα、Ⅸα、 Ⅷα。膽紅素Ⅸα是天然產(chǎn)物的原型物，故以異構(gòu)體的總量來(lái)控制本品中膽紅素的含量，較為合理。

32流動(dòng)相的選擇參考《中國(guó)藥典》和文獻(xiàn)[2]，HPLC法測(cè)定膽紅素的流動(dòng)相有三氯甲烷-甲醇-二乙胺（80∶19∶1）、甲醇-三氯甲烷-1%磷酸溶液（80∶14∶6）、乙腈-二甲基亞砜-pH47的1%醋酸銨（40∶60∶55）等，考慮到本實(shí)驗(yàn)系反相色譜，三氯甲烷和二甲基亞砜對(duì)色譜柱傷害較大，經(jīng)摸索，最后確定用本文列出的流動(dòng)相，得到的色譜峰形對(duì)稱(chēng)，分離度好。

33提取溶劑的考察天黃猴棗散處方中為體外培育牛黃，其膽紅素為游離型膽紅素，由6個(gè)分子內(nèi)氫鍵形成，為不溶于水的脂溶性化合物，故對(duì)二甲基亞砜、三氯甲烷、三氯甲烷-1%鹽酸甲醇溶液（5∶1）、二甲基亞砜-乙腈（7∶3）、EDTA-二氯甲烷（1∶10）等提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果以二甲基亞砜為溶劑提取效果最好，見(jiàn)表2。

34提取方法的考察實(shí)驗(yàn)曾對(duì)靜置過(guò)夜、超聲處理和加熱回流等3種樣品溶液的制備方法進(jìn)行比較，結(jié)果加熱回流得到的供試品，未能檢測(cè)到膽紅素，表明加熱后膽紅素被破壞，不宜加熱提??；而超聲處理的含量明顯高于靜置過(guò)夜的樣品含量。

35膽紅素異構(gòu)體在空氣中尤其在光照下極易被氧化，因此整個(gè)操作因避光進(jìn)行。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，含量測(cè)定操作方法以快速為佳。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊(cè)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1994：557.

[2] 尹華，吳健敏，梁文藻.膽紅素異構(gòu)體相對(duì)含量的RP-HPLC測(cè)定[J].藥物分析雜志，1992，12（6）：338-339.

[3] Norbert Blanckacrt.Analysis of bilirubin and bilirubin mono and diconjugates[J]. Biochem J， 1980，18（5）：115-128.

（收稿日期：20160327）