乳腺癌中HER-2基因多態(tài)性與蛋白表達(dá)的相關(guān)性研究

蘇永輝，姜永冬，謝靜靜，龐達(dá)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，黑龍江 哈爾濱 150081

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乳腺癌中HER-2基因多態(tài)性與蛋白表達(dá)的相關(guān)性研究

蘇永輝，姜永冬，謝靜靜，龐達(dá)
哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，黑龍江 哈爾濱 150081

［摘要］背景與目的：致病基因的多態(tài)性可能會影響該基因的功能，從而引起個(gè)體腫瘤易感性的差異和個(gè)體內(nèi)生物活性物質(zhì)效應(yīng)的改變。本研究旨在研究HER-2基因多態(tài)性與其蛋白表達(dá)的關(guān)系，并分析其與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。方法：收集303例漢族女性乳腺癌患者為研究對象，運(yùn)用MassARRAY技術(shù)平臺檢測HER-2基因rs2517954和rs2517955單核苷酸多態(tài)性。同時(shí)采用免疫組織化學(xué)法檢測相應(yīng)乳腺癌組織中HER-2蛋白表達(dá)并檢測雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、P53及Ki67表達(dá)。以Pearson χ2分析這兩個(gè)位點(diǎn)和其蛋白表達(dá)的關(guān)系，并分析其與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果：在共顯性模型下，HER-2基因rs2517954和rs2517955位點(diǎn)多態(tài)性與其蛋白表達(dá)相關(guān)（χ2=9.613，P=0.008；χ2=9.613，P=0.008）。在顯性模型下，HER-2基因rs2517955位點(diǎn)TT純合突變型和CT雜合突變型的頻率與其蛋白表達(dá)相關(guān)（χ2=8.894，P=0.003）。HER-2基因rs2517954和rs2517955位點(diǎn)多態(tài)性與患者的臨床分期、腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR、Ki67及P53表達(dá)均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論：HER-2基因rs2517955多態(tài)性位點(diǎn)與其蛋白表達(dá)具有相關(guān)性，對該位點(diǎn)進(jìn)一步研究可能有助于闡明乳腺癌中HER-2蛋白的表達(dá)機(jī)制。

［關(guān)鍵詞］乳腺癌；HER-2基因；基因多態(tài)性；rs2517954；rs2517955

Correspondence to: PANG Da E-mail: pangdasir@163.com

HER-2基因定位于17號染色體上，編碼跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性，能促進(jìn)細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖和細(xì)胞轉(zhuǎn)化［1］。HER-2蛋白由HER-2基因編碼，其在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，與腫瘤的侵襲性表型、生存期短及對內(nèi)分泌藥物的耐藥現(xiàn)象相關(guān)［2］。致病基因的多態(tài)性可能會影響該基因的功能，從而引起個(gè)體腫瘤易感性的差異和個(gè)體內(nèi)生物活性物質(zhì)效應(yīng)的改變。有研究顯示，HER-2基因655位密碼子（Ile655Val）多態(tài)性可能增加乳腺癌的易感性，但不同的研究結(jié)果尚存在分歧［3-5］。同時(shí)，Ile655Val多態(tài)性與HER-2陽性乳腺癌使用靶向藥物曲妥珠單抗治療所致的心臟不良反應(yīng)相關(guān)［6］。但是，目前尚無關(guān)于HER-2基因多態(tài)性與HER-2蛋白表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。本文通過MassARRAY方法檢測303例原發(fā)性乳腺癌患者HER-2基因rs2517954和rs2517955位點(diǎn)多態(tài)性，研究這兩個(gè)位點(diǎn)和其蛋白表達(dá)的關(guān)系，并分析其與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，以探討其在乳腺癌發(fā)病中的潛在價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 研究對象

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科2011 年3月—2011年12月收治的原發(fā)性乳腺癌患者303例，均為漢族女性，均經(jīng)病理證實(shí)，且入組前均未接受任何抗癌治療。本研究由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)研究倫理委員會審查認(rèn)可，所有患者均簽署知情同意書，同時(shí)收集患者的臨床信息。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測

采用免疫組織化學(xué)法對乳腺癌組織蠟塊標(biāo)本進(jìn)行雌激素受體（estrogen receptor，ER)、孕激素受體（progesterone receptor，PR)、HER-2、Ki67和P53檢測。ER和PR可見明顯的細(xì)胞核著色，且≥10%為陽性，無著色或陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)＜10%和著色弱且陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)＞10%為陰性。HER-2可見細(xì)胞膜著色，≥30%腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整均勻的細(xì)胞膜著色為陽性，無著色或陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)＜10%和著色弱且陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)＞10%為陰性。Ki67、 P53標(biāo)記陽性結(jié)果為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒，Ki-67判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)≥14%為陽性，＜14%為陰性；P53判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性，＜10%為陰性。

1.3 DNA提取和引物設(shè)計(jì)

抽取乳腺癌患者清晨空腹外周EDTA抗凝血樣本2 mL，采用愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA，-80 ℃保存。

引物設(shè)計(jì)由華大基因公司按照MassARRAY分子量陣列分析系統(tǒng)的要求，利用Assay Designer引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物及探針并合成。

1.4 基因型檢測

提取純化后的基因組DNA樣品定量稀釋至100 ng/μL，按設(shè)計(jì)順序每孔加1 μL樣品于384孔板上，然后添加PCR擴(kuò)增體系使反應(yīng)物的終濃度如下：0.5 U的Taq聚合酶，100 ng基因組DNA，各0.1 pmol的PCR引物，500 μmol的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 15 s；94 ℃20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(45 個(gè)循環(huán))；72 ℃3 min，4 ℃保存。添加0.3 U的蝦堿性磷酸酶去除剩余的dNTP。在384孔中加入2 μL單堿基延伸反應(yīng)液及適量引物，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s（40個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 3 min。反應(yīng)產(chǎn)物用樹脂脫鹽60 min后經(jīng)自動點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于SpectroCHIP（Sequenom）芯片。點(diǎn)樣后的芯片使用MassARRAY Analyzer Compac進(jìn)行質(zhì)譜檢測。結(jié)果使用Typer4.0軟件分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。檢驗(yàn)HER-2基因rs2517954和rs2517955位點(diǎn)基因多態(tài)頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，以Pearson χ2分析這兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性與HER-2蛋白表達(dá)和乳腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢測

HER-2基因rs2517954位點(diǎn)CC、CT和TT三種基因型頻率分別為18.8%、54.8%和26.4%，分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.07)。rs2517954位點(diǎn)CC、CT和TT三種基因型頻率分別為26.4%、54.8%和18.8%，分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.07)。

2.2 HER-2基因rs2517954和rs2517955位點(diǎn)與HER-2蛋白表達(dá)的關(guān)系

在共顯性模型下，HER-2基因rs2517954位點(diǎn)基因型多態(tài)性與HER-2蛋白表達(dá)之間具有顯著相關(guān)性(χ2=9.613，P=0.008)。在顯性模型下，rs2517954 的CC純合野生型患者HER-2蛋白表達(dá)陽性率為26.3%(26/99)，TT純合突變型和CT雜合突變型患者HER-2蛋白表達(dá)陽性率為73.7%(73/99)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.899，P=0.089，表1)。在共顯性模型下，HER-2基因rs2517955位點(diǎn)基因型多態(tài)性與HER-2蛋白表達(dá)之間具有顯著相關(guān)性(χ2=9.613，P=0.008)。在顯性模型下，rs2517955的CC純合野生型患者HER-2蛋白表達(dá)陽性率為15.2%(15/99)，而TT純合突變型和CT雜合突變型患者HER-2蛋白表達(dá)陽性率為84.8%(84/99)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.894，P=0.003，表1)。

2.3 HER-2基因rs2517954和rs2517955位點(diǎn)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

HER-2基因rs2517954和rs2517955位點(diǎn)多態(tài)性與患者的臨床分期、腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR、Ki67及P53表達(dá)均無顯著相關(guān)性(P均＞0.05，表2、3)。

表1　HER-2基因rs2517954和rs2517955位點(diǎn)與其蛋白表達(dá)的關(guān)系Tab.1 The relationship between HER-2 gene rs2517954 and rs2517955 loci and protein expression

表2　rs2517954與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between rs2517954 and clinicopathological characteristics of breast cancer

表3　rs2517955與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 The relationship between rs2517955 and clinicopathological characteristics of breast cancer

3 討 論

HER-2蛋白由原癌基因HER-2編碼，是結(jié)合在細(xì)胞膜表面的受體酪氨酸激酶，參與細(xì)胞生長和分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明，在15%~20%的乳腺癌中可以檢測到HER-2蛋白的過表達(dá)［7］。轉(zhuǎn)染HER-2基因的哺乳動物細(xì)胞系，DNA合成增強(qiáng)，細(xì)胞生長速度加快，侵襲性增強(qiáng)，并且在裸鼠體內(nèi)成瘤性及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［8］。臨床上HER-2蛋白過表達(dá)的乳腺癌患者往往表現(xiàn)出生存率低、腫瘤惡性程度增強(qiáng)、進(jìn)展迅速、易于發(fā)生轉(zhuǎn)移、化療緩解期短及對三苯氧胺和細(xì)胞毒性化療藥耐藥等特點(diǎn)［7，9］。

目前關(guān)于HER-2基因多態(tài)性的研究主要在于HER-2基因655位密碼子多態(tài)性的研究，該位點(diǎn)突變可導(dǎo)致異亮氨酸置換為纈氨酸，從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，可能與乳腺癌的易感性相關(guān)［10］，其結(jié)果尚存在分歧［3-5，11］。同時(shí)該位點(diǎn)的多態(tài)性與乳腺癌經(jīng)不同方案治療的預(yù)后相關(guān)［12］。HER-2基因rs903506位點(diǎn)與突尼斯人乳腺癌的易感性相關(guān)［11］。本文所研究的rs2517954和rs2517955位點(diǎn)均位于HER-2基因的啟動子區(qū)域，查詢Hapmap數(shù)據(jù)庫，rs2517954位點(diǎn)在北京地區(qū)漢族人群中CC、CT和TT基因型的頻率分別為29.5%、43.2%和27.3%；rs2517955位點(diǎn)在北京地區(qū)漢族人群中CC、CT和TT基因型的頻率分別為22.0%、61.0%和17.1%。這兩個(gè)位點(diǎn)基因型的頻率與本組實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)略有差異，可能與實(shí)驗(yàn)樣本量和研究人群特異性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在共顯性模型下rs2517954和rs2517955位點(diǎn)不同基因型(CC、CT 和TT基因型)與乳腺癌中HER-2蛋白表達(dá)相關(guān)。且在顯性模型下，rs2517955位點(diǎn)TT純合突變型和CT雜合突變型的頻率與HER-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。這種蛋白表達(dá)差異的機(jī)制尚不清楚。我們推測rs2517955位點(diǎn)可能是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其基因型的改變可能通過影響DNA的轉(zhuǎn)錄，從而影響HER-2蛋白的表達(dá)。但是，HER-2基因多態(tài)性如何調(diào)控蛋白表達(dá)的機(jī)制，尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

乳腺癌中HER-2蛋白的過表達(dá)往往與乳腺癌的組織學(xué)分級［13］及ER和PR的表達(dá)狀況［14］等臨床病理特征相關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，HER-2基因rs2517954和rs2517955位點(diǎn)多態(tài)性與患者的臨床分期、腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR、Ki67及P53表達(dá)均無顯著相關(guān)性。

綜上所述，HER-2基因2517955位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌HER-2蛋白的表達(dá)具有相關(guān)性，對該位點(diǎn)的進(jìn)一步研究可能有助于乳腺癌患者HER-2狀態(tài)評估，也有利于闡明乳腺癌中HER-2蛋白的表達(dá)機(jī)制。

［參 考 文 獻(xiàn)］

［1］HOLMES W E， SLIWKOWSKI M X， AKITA R W， et al.Identification of heregulin， a specific activator of p185erbB2 ［J］.Science， 1992， 256（5060）： 1205-1210.

［2］MéNARD S， PUPA S M， CAMPIGLIO M， et al.Biologic and therapeutic role of HER2 in cancer ［J］.Oncogene， 2003，22（42）： 6570-6578.

［3］DAHABREH I J， MURRAY S.Lack of replication for the association between HER2 I655V polymorphism and breast cancer risk： a systematic review and meta-analysis ［J］.Cancer Epidemiol， 2011， 35（6）： 503-509.

［4］MA Y， YANG J， ZHANG P， et al.Lack of association between HER2 codon 655 polymorphism and breast cancer susceptibility： meta-analysis of 22 studies involving 19，341 subjects ［J］.Breast Cancer Res Treat， 2011， 125（1）： 237-241.

［5］TAO W， WANG C， HAN R， et al.HER2 codon 655 polymorphism and breast cancer risk： a meta-analysis ［J］.Breast Cancer Res Treat， 2009， 114（2）： 371-376.

［6］BEAUCLAIR S， FORMENTO P， FISCHEL J L， et al.Role of the HER2 ［Ile655Val］genetic polymorphism in tumorogenesis and in the risk of trastuzumab-related cardiotoxicity ［J］.Ann Oncol， 2007， 18（8）： 1335-1341.

［7］SOERJOMATARAM I， LOUWMAN M W， RIBOT J G， et al.An overview of prognostic factors for long-term survivors of breast cancer ［J］.Breast Cancer Res Treat， 2008， 107（3）：309-330.

［8］BAASNER S， VON M H， KLENNER T， et al.Reversible tumorigenesis in mice by conditional expression of the HER2/ c-erbB2 receptor tyrosine kinase ［J］.Oncogene， 1996，13（5）： 901-911.

［9］丁 渭， 鄭春艷， 賀智敏， 等.HER2介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥的作用及機(jī)制 ［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志， 2005，25（5）： 381-385.

［10］NELSON S E， GOULD M N， HAMPTON J M， et al.A casecontrol study of the HER2 Ile655Val polymorphism in relation to risk of invasive breast cancer ［J］.Breast Cancer Res，2005， 7（3）： R357- R364.

［11］KALLEL I， KHARRAT N， AL-FADHLY S， et al.HER2 polymorphisms and breast cancer in Tunisian women ［J］.Genet Test Mol Biomarkers， 2010， 14（1）： 29-35.

［12］HAN X， DIAO L， XU Y， et al.Association between the HER2 Ile655Val polymorphism and response to trastuzumab in women with operable primary breast cancer ［J］.Ann Oncol，2014， 25（6）： 1158-1164.

［13］HUSSEIN M R， ABD-ELWAHED S R， ABDULWAHED A R.Alterations of estrogen receptors， progesterone receptors and c-erbB2 oncogene protein expression in ductal carcinomas of the breast ［J］.Cell Biol Int， 2008， 32（6）： 698-707.

［14］LAL P， TAN L K， CHEN B.Correlation of HER-2 status with estrogen and progesterone receptors and histologic features in 3，655 invasive breast carcinomas ［J］.Am J Clin Pathol，2005， 123（4）： 541-546.

Association between HER-2 gene polymorphism and protein expression in breast cancer

SU Yonghui，JIANG Yongdong， XIE Jingjing， PANG Da （Department of Breast Cancer Surgery， Harbin Medical University Cancer Hospital， Harbin 150081， Heilongjiang Province， China）

［Key words］Breast cancer； HER-2 gene； Gene polymorphism； rs2517954； rs2517955

［Abstract］Background and purpose: Pathogenic gene polymorphism may affect the function of gene，leading to the difference of individual tumor susceptibility and heterogeneity of bioactive substances in individuals.The purpose of this study was to investigate the interrelationship between HER-2 gene polymorphism and its protein expression， and to evaluate their association with the clinicopathological characteristics of breast cancer.Methods: The data from a total number of 303 female breast cancer patients of Han ethnicity were collected.The MassARRAY platform was used to examine HER-2 gene rs2517954 and rs2517955 single nucleotide polymorphisms.Meanwhile immunohistochemistry was used to detect HER-2 protein expression and corresponding estrogen receptor （ER），progesterone receptor （PR）， P53 and Ki-67 expressions in breast cancer tissues.Pearson chi-square test was used to study the relationship of the two loci and the protein expression， and their correlation with clinicopathological features of breast cancer was analyzed.Results: Under the codominant model， HER-2 gene rs2517954 and rs2517955 loci polymorphisms were associated with its protein expression （χ2=9.613, P=0.008； χ2=9.613, P=0.008）.And under the dominant model， HER-2 gene rs2517955 loci TT homozygous and CT heterozygous mutant was associated with its protein expression （χ2=8.894, P=0.003）.There were no significant correlations between HER-2 gene rs2517954， and rs2517955 loci polymorphisms， and breast cancer patients’ clinical stage， tumor size， histological grade， lymph node metastasis， ER， PR， Ki-67 and P53 expressions （P>0.05).Conclusion: HER-2 gene rs2517955 loci polymorphism is correlated with its protein expression.Further studies may be helpful to elucidate the mechanism of HER-2 protein expression in breast cancer.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.004

中圖分類號：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-3639(2016)02-0140-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81202075）；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)“中俄”合作醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化基金（CR201402）。

通信作者：龐達(dá) E-mail：pangdasir@163.com

收稿日期：（2015-01-04 修回日期：2015-06-07）