聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛對(duì)蘇木精伊紅染色及熒光原位雜交檢測(cè)乳腺癌HER-2基因影響的比較

陳志強(qiáng)，王 瑩，米賢軍，陳 昂，鐘守軍，黃華勇，鄧文同，劉超凡，徐秀梅，代新珍

南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛(ài)醫(yī)院病理科，廣東 中山528400

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聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛對(duì)蘇木精伊紅染色及熒光原位雜交檢測(cè)乳腺癌HER-2基因影響的比較

陳志強(qiáng)，王 瑩，米賢軍，陳 昂，鐘守軍，黃華勇，鄧文同，劉超凡，徐秀梅，代新珍

南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛(ài)醫(yī)院病理科，廣東 中山528400

［摘要］背景與目的：適當(dāng)?shù)慕M織固定、透明脫蠟是蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色及熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測(cè)乳腺癌HER-2基因一個(gè)重要的步驟。該研究旨在對(duì)比環(huán)保固定液聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛固定制作的組織切片HE染色優(yōu)良率，熒光原位雜交檢測(cè)兩者固定制作的乳腺癌組織切片的HER-2基因擴(kuò)增陽(yáng)性率，探討其替代傳統(tǒng)固定液4%中性緩沖甲醛的可行性。方法：收集中山市博愛(ài)醫(yī)院2011年3月—2015年1月門(mén)診及住院部送檢的乳腺癌69例、乳腺纖維腺瘤41例、子宮平滑肌瘤40例、宮頸組織25例、胎盤(pán)組織25例，各取材2塊，每例標(biāo)本的2塊組織用抽簽法隨機(jī)分2組，一組采用4%中性緩沖甲醛固定制作HE切片200張，另一組采用聚羥基丙烯酸固定制作HE切片200張。依據(jù)切片染色情況判定切片等級(jí)，采用SPSS 19.0比較兩者HE染色優(yōu)良率；兩組乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織再各制作切片69張，采用SPSS 19.0比較FISH技術(shù)檢測(cè)的HER-2基因擴(kuò)增率。結(jié)果：① 聚羥基丙烯酸、4%中性緩沖甲醛固定組組織切片HE染色優(yōu)質(zhì)片分別為155張、166張，優(yōu)良片41張、33張，中等片3張、1張，差片1張、0張，染色優(yōu)良率分別為98.0%、99.5%，兩組間優(yōu)良率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.33，P=0.25)。② 聚羥基丙烯酸、4%中性緩沖甲醛固定組組織切片F(xiàn)ISH陽(yáng)性率分別為26.09%、23.19%，兩組間陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.50，P＞0.05)。結(jié)論：聚羥基丙烯酸固定制作的組織切片HE染色效果及熒光原位雜交檢測(cè)乳腺癌HER-2基因擴(kuò)增效果跟傳統(tǒng)固定液4%中性緩沖甲醛相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，符合環(huán)保要求，有推廣使用的可能。

［關(guān)鍵詞］聚羥基丙烯酸；甲醛；組織切片；蘇木精伊紅染色；乳腺癌；HER-2基因；熒光原位雜交

Correspondence to: CHEN Zhiqiang E-mail: 765228687@qq.com

甲醛固定組織制作蠟塊是蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色及熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測(cè)乳腺癌HER-2基因必不可少的步驟。但甲醛具有刺激性，并增加周?chē)巳好庖呒膊『桶┌Y的風(fēng)險(xiǎn)［1］。隨著人們環(huán)保意識(shí)的提高，甲醛的危害性逐漸讓人們產(chǎn)生能否尋求作為病理學(xué)固定“金標(biāo)準(zhǔn)”試劑［2］-4%中性緩沖甲醛環(huán)保替代品的想法。事實(shí)上，在過(guò)去的20年中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直在嘗試使用各種新型環(huán)保固定劑替代甲醛應(yīng)用于病理工作的研究。本研究旨在探討環(huán)保試劑替代傳統(tǒng)試劑在HE染色、FISH技術(shù)中的可行性，為摸索出綠色病理所需之環(huán)保產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑及儀器

聚羥基丙烯酸固定液由廣州市艾發(fā)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)工程有限公司生產(chǎn)(單純固定液，工作液是純?nèi)芤?，固定速度? mm/h，第一類(lèi)醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)登記證號(hào)：20090363，10～30 ℃溫度下保存)。甲醛溶液為廣州市東紅化工廠生產(chǎn)，蘇木精染液(哈瑞氏)、伊紅染液(醇溶性)由中國(guó)上海宏茲實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。SAKURA Tissue Tek Vip-5全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)、DRS-2000J-D2全自動(dòng)染色機(jī)均為日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社生產(chǎn)。Thermo HM325輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)為德國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，切片厚度2～3 μm。BJ43-PAS8000病理圖像分析儀由北京市中西集團(tuán)公司生產(chǎn)。OLYMPUSBx51熒光顯微鏡由日本奧林巴斯株式會(huì)社生產(chǎn)。探針：TERC探針由中國(guó)北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供，為GLP HER-2/CSP17探針。

1.1.2 標(biāo)本來(lái)源

中山市博愛(ài)醫(yī)院2011年3月—2015年1月門(mén)診及住院部送檢的各種組織標(biāo)本200例，分別固定在4%中性緩沖甲醛液及聚羥基丙烯酸溶液中12 h。其中大標(biāo)本有：乳腺癌69例、乳腺纖維腺瘤41例、子宮平滑肌瘤40例、胎盤(pán)組織25例，同一病變部位各取材2塊，組織按照標(biāo)準(zhǔn)取材大?。?.0 cm×1.0 cm×0.2 cm）切取。小標(biāo)本有宮頸組織25例，同一病變部位各取材2塊，按照0.5 cm×0.3 cm×0.2 cm大小取材。69例乳腺癌患者均為女性，年齡33～76歲，平均(54.2±2.5)歲。術(shù)前未行任何輔助治療(內(nèi)分泌治療、放療、化療)，病理診斷均為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。各標(biāo)本均見(jiàn)明顯的腫瘤。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織處理

活體組織分別直接置于聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛液中，量是標(biāo)本體積的10倍，標(biāo)本固定12 h后取材。置于全自動(dòng)組織脫水機(jī)中進(jìn)行脫水、透明和浸蠟等處理。詳細(xì)步驟如下：聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛液分別固定2 h，75%、80%、85%、90%、95%、100%、100%乙醇分別固定1 h、1 h、1 h、1 h、50 min、50 min、45 min，二甲苯×2各50 min，石蠟×4各45 min，次日上午7:30包埋、切片厚2～3 μm，裱片于防脫片載玻片上。

1.2.2 傳統(tǒng)HE染色

兩組切片分別經(jīng)二甲苯×3各5 min，100%、95%、80%、75%乙醇各3 min，流水洗，蘇木精染12 min，流水洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水洗，1%氨水返藍(lán)1 min，流水洗，1%醇溶性伊紅染1 min，70%、95%乙醇各30 s，100%乙醇×2各2 min，二甲苯×2各2 min，中性樹(shù)膠封固。每張組織切片的HE染色均在相同的條件下進(jìn)行，以保證結(jié)果的客觀性和可信度。

1.2.3 HE結(jié)果的判斷與評(píng)分

對(duì)常規(guī)病理切片染色結(jié)果的評(píng)定借助BJ43-PAS8000圖像采集分析儀采用的標(biāo)準(zhǔn)是色度分析，依據(jù)中國(guó)常規(guī)病理切片質(zhì)控中心推薦的質(zhì)控評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［3］，評(píng)議內(nèi)容包括：脫蠟度、透明度、著色度和顏色鮮亮度情況等。評(píng)議結(jié)果分為4級(jí)：優(yōu)質(zhì)、優(yōu)良、中等、差。具體標(biāo)準(zhǔn)是：

① 優(yōu)質(zhì)：脫蠟好、透明度好、著色適中、顏色鮮亮的切片；② 優(yōu)良：測(cè)試片中所有組織染色都很好，但是有些背景；③ 中等：測(cè)試片中所有組織染色普遍較弱，或出現(xiàn)大量背景；④ 差：測(cè)試片中所有組織染色非常弱，或根本不染色。切片優(yōu)良率=(優(yōu)良片數(shù)+優(yōu)質(zhì)片數(shù)）/總切片數(shù)。

1.2.4 乳腺癌樣本玻片F(xiàn)ISH預(yù)處理程序

將組織切片置于65 ℃過(guò)夜烘烤，老化玻片。將組織切片浸于二甲苯中脫蠟、復(fù)水。50 ℃下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 g/L酸性亞硫酸鈉處理組織切片20～30 min。90 ℃下用水處理組織切片30 min。室溫下于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5 min。將組織切片浸泡在200 μg/mL蛋白酶K工作液中，37 ℃下溫育5～30 min，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5 min。室溫下于聚羥基丙烯酸和4%中性緩沖甲醛固定液中分別固定10 min。室溫下將組織切片玻片依次置于梯度乙醇脫水，加熱玻片至56 ℃。

1.2.5 標(biāo)本準(zhǔn)備及變性玻片和探針混合液

在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的甲酰胺/2×SSC變性液中，溫度72～74 ℃變性5 min，-20 ℃預(yù)冷的70%、85%和100%乙醇梯度脫水各3 min，玻片自然干燥，置于45～50 ℃烤片機(jī)上預(yù)熱2～5 min后與探針雜交。

1.2.6 探針與樣本雜交

將變性后的探針混合液10 μL滴于玻片雜交區(qū)域，將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42 ℃保溫箱中過(guò)夜雜交。

1.2.7 玻片洗滌

將玻片置于3瓶50%甲酰胺/2×SSC溶液中，各漂洗10 min；將玻片置于2×SSC溶液中，漂洗10 min；將玻片置于0.1% NP-40/2×SSC溶液中，漂洗5 min；將玻片室溫浸泡在70%乙醇中，漂洗3 min。

1.3 結(jié)果觀察

首先在HE染色切片上確認(rèn)癌細(xì)胞區(qū)域，然后在10倍物鏡下，在FISH標(biāo)本上找到與HE染色切片上相同的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，仔細(xì)觀察信號(hào)。在40倍物鏡下掃描整張切片，觀察是否存在HER-2表達(dá)的異質(zhì)性，以及標(biāo)本的質(zhì)量，滿(mǎn)意的標(biāo)本應(yīng)在75%以上。癌細(xì)胞核中都有雜交信號(hào)，在100倍物鏡下觀察癌細(xì)胞核的FISH結(jié)果并進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)和比值計(jì)算［4］。計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值(Ratio值=30個(gè)細(xì)胞核中紅信號(hào)總數(shù)/30個(gè)細(xì)胞核中綠信號(hào)總數(shù))。

1.4 結(jié)果分析

計(jì)數(shù)細(xì)胞必須是各通道信號(hào)均清晰可辨的細(xì)胞，細(xì)胞核輪廓不清或有重疊的不分析，雜交不均勻的區(qū)域不分析。背景深影響信號(hào)判斷的區(qū)域不分析。在分析石蠟切片時(shí)，分析的區(qū)域應(yīng)在腫瘤細(xì)胞集中的部位(需由病理科醫(yī)師認(rèn)定)。如果超過(guò)25%的細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)太弱，則該區(qū)域不進(jìn)行分析。如果超過(guò)10%的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有信號(hào)，則該區(qū)域不進(jìn)行分析。

1.5 結(jié)果判斷

Ratio值＜1.8為陰性結(jié)果，提示該樣本無(wú)HER-2基因擴(kuò)增；Ratio值＞2.2為陽(yáng)性結(jié)果，提示樣本中HER-2基因發(fā)生擴(kuò)增；Ratio值介于1.8~2.2之間時(shí)，可以選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè)，或重做FISH實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷最終結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。切片HE染色優(yōu)良率、FISH結(jié)果符合率的差異均用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

兩組固定液制片HE色彩鮮艷，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對(duì)比分明(圖1、2)。聚羥基丙烯酸、4%中性緩沖甲醛固定組組織切片HE染色優(yōu)質(zhì)片分別為155張、166張，優(yōu)良片41張、33張，中等片3張、1張，差片1張、0張。染色優(yōu)良率分別為98.0%、99.5%，兩組間優(yōu)良率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.33，P=0.25)。

圖1　聚羥基丙烯酸固定后宮頸組織HE染色結(jié)果Fig.1 The results of HE staining in cervical tissues fixed by poly hydroxy acrylic acid

圖2　4%中性緩沖甲醛固定后宮頸組織HE染色結(jié)果Fig.2 The results of HE staining in cervical tissues fixed by 4% neutral buffered formaldehyde

2.2 FISH檢測(cè)結(jié)果

兩組固定液制片，采用FISH檢測(cè)乳腺癌HER-2表達(dá)，熒光顯微鏡下均發(fā)出可被肉眼識(shí)別的熒光信號(hào)，背景清晰(圖3、4)。聚羥基丙烯酸、4%中性緩沖甲醛固定組組織切片F(xiàn)ISH陽(yáng)性率分別為26.09%、23.19%，兩組間陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.50，P=0.5，表1)。

表1　兩組固定液制片乳腺癌HER-2基因FISH檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Detection results of HER-2 gene by FISH with two groups of fixative solution in producing section

圖3　聚羥基丙烯酸固定后乳腺癌HER-2基因檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of HER-2 gene in breast cancer tissues fixed by poly hydroxy acrylic acid

圖4　4%中性緩沖甲醛固定后乳腺癌HER-2基因檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of HER-2 gene in breast cancer tissues fixed by the 4% neutral buffered formaldehyde fixative solution

3 討 論

優(yōu)質(zhì)的HE切片仍是臨床的病理診斷最根本的依據(jù)。其制作需經(jīng)過(guò)一系列技術(shù)流程，其中最關(guān)鍵的就是組織固定，組織標(biāo)本常用4%中性緩沖甲醛固定。乳腺癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，HER-2是浸潤(rùn)性乳腺癌的重要臨床生物標(biāo)志物，HER-2受體陽(yáng)性與乳腺癌不良預(yù)后有關(guān)，并認(rèn)為是獨(dú)立于其他因素之外的指標(biāo)，其意義不亞于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響。HER-2狀態(tài)應(yīng)該在所有新診斷和復(fù)發(fā)性乳腺癌中確定［5-7］。Shirsat等［8］指出乳腺癌靶向基因FISH檢查可作為HER-2基因狀態(tài)常規(guī)管理的一個(gè)低成本篩查。

將組織浸入某些化學(xué)試劑，使組織、細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡量保持其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置，這一過(guò)程稱(chēng)為固定［9］。恰當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簯?yīng)該在一定的溫度下，能省時(shí)省力又能確保效果。固定不當(dāng)?shù)臉?biāo)本，細(xì)胞的通透性降低，對(duì)染料的物理化學(xué)作用減弱，附著力降低，生物染料的發(fā)色團(tuán)和助色團(tuán)很難與被染物結(jié)合，造成在組織切片染色定位不佳，模糊不清，甚至沒(méi)著色等現(xiàn)象，直接延誤病理診斷［10-12］。

4%中性緩沖甲醛固定液一直是病理界固定的權(quán)威試劑，近年來(lái)隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，人們發(fā)現(xiàn)甲醛暴露可導(dǎo)致蛋白質(zhì)生理和病理功能的修改，干擾基因正常表達(dá)［13］。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定甲醛是環(huán)境污染物，主要模式是DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的形成，使細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡增加，特別是作用于造血干細(xì)胞上［14］，引起鼻咽癌、白血?。?5］，使孕期的胎兒患腎母細(xì)胞瘤風(fēng)險(xiǎn)增加［16］。在馬德里召開(kāi)的第二次國(guó)際科學(xué)會(huì)議討論了甲醛遺傳毒性，大量新的科學(xué)數(shù)據(jù)表明甲醛主要影響外源性和內(nèi)源性生物DNA的形成［17］。

環(huán)保試劑近幾年來(lái)一直是國(guó)內(nèi)外大醫(yī)院極力推薦的試劑，國(guó)外已有使用無(wú)害化學(xué)試劑替代4%中性緩沖甲醛固定液進(jìn)行病理制片的相關(guān)報(bào)道［18-20］，國(guó)內(nèi)董愉等［21］報(bào)道乙醚酒精固定液固定的冷凍切片HE染色效果最佳。張麗榮等［22］研究證實(shí)FineFix固定液與福爾馬林液固定的組織進(jìn)行對(duì)比，經(jīng)FineFix固定的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，尤其在提取DNA和RNA的質(zhì)和量上具有明顯的優(yōu)越性。汪偉等［23］研究顯示PB-FA混合固定液，經(jīng)PAS染色后基底膜得到更加清晰的顯示，從而提高了腎活檢穿刺病理診斷的準(zhǔn)確性。裴希等［24］用FAA固定液處理后的眼球，能使纖維組織較多偏硬的鞏膜得到軟化，易脫水、浸蠟和切片。田玉旺等［25］應(yīng)用GS環(huán)保試劑HE染色，色彩鮮艷，核漿對(duì)比分明，與傳統(tǒng)HE染色結(jié)果相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

以熒光標(biāo)記DNA進(jìn)行FISH對(duì)檢測(cè)乳腺癌石蠟組織HER-2原癌基因的核苷酸序列技術(shù)方法而言是公認(rèn)的比較成熟的、比較權(quán)威的方法［26］。Rosa等［27］研究證實(shí)人HER-2在20%~30%的原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌中有基因擴(kuò)增和蛋白的過(guò)表達(dá)。Lee等［28］對(duì)971例浸潤(rùn)性乳腺癌HER-2基因的FISH圖像文件進(jìn)行回顧性分析指出組織前固定可能會(huì)影響到HER-2基因擴(kuò)增狀態(tài)的結(jié)果。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)家Portier等［29］指出延遲固定時(shí)間1~3 h通過(guò)FISH對(duì)HER-2檢測(cè)雜交信號(hào)有明顯影響。王瑩［30］嘗試應(yīng)用環(huán)保型GS試劑取代傳統(tǒng)試劑，并應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)HPVL1殼蛋白的表達(dá)，探討GS環(huán)保試劑對(duì)HPVL1殼蛋白檢測(cè)的影響。張進(jìn)華等［31］應(yīng)用GS環(huán)保試劑制作的石蠟切片提取DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量VCR技術(shù)擴(kuò)增，并與常規(guī)方法制作的石蠟切片進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)GS液能較好地保存組織中的DNA。Fischer等［32］用非醛固定液固定組織，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞HER-2免疫組化抗原正常表達(dá)。

縱觀國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，并未見(jiàn)報(bào)道聚羥基丙烯酸、甲醛對(duì)HE染色優(yōu)良率及對(duì)FISH檢測(cè)乳腺癌HER-2基因擴(kuò)增陽(yáng)性率的差異比較，且上述報(bào)道并未對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本研究組織前固定時(shí)間為12 h，從取材到制成HE切片時(shí)間控制在24 h內(nèi)符合病理規(guī)章制度要求，作者應(yīng)用新型環(huán)保固定液聚羥基丙烯酸組織固定硬組織如乳腺纖維腺瘤，軟組織如胎盤(pán)組織，大組織如乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織，小組織如宮頸組織，質(zhì)地致密組織如乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織，質(zhì)地疏松組織如絨毛組織，良性組織如乳腺纖維腺瘤組織，惡性組織如乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌這種對(duì)固定質(zhì)量要求比較高的組織。最后大體觀察：無(wú)因固定不當(dāng)造成的組織皺縮、變硬、切片不完整、龜裂等現(xiàn)象；從放大40~200倍鏡下所見(jiàn)：色彩鮮艷，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對(duì)比分明，分裂相染色體表現(xiàn)黑藍(lán)色，各種成分層次分明。切片HE染色片的優(yōu)良率控制在98%以上，符合病理科醫(yī)療質(zhì)量與安全考核方案的規(guī)定：標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)石蠟包埋HE染色片的優(yōu)良率(優(yōu)質(zhì)、優(yōu)良切片所占的比例)不低于95%，優(yōu)級(jí)率(甲級(jí)切片所占的比例)不低于35%，與傳統(tǒng)試劑4%中性緩沖甲醛固定液制作的HE染色結(jié)果優(yōu)良率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

甲醛固定組織的主要作用機(jī)制是醛基與氨基基團(tuán)形成可逆的羥甲基衍生物和穩(wěn)定的亞甲基橋從而使甲醛和蛋白質(zhì)發(fā)生廣泛的交聯(lián)，可能使甲醛改變?cè)S多生物分子，包括核酸和蛋白質(zhì)［33］。聚羥基丙烯酸固定組織的主要作用機(jī)制可能是羥基和羧基基團(tuán)發(fā)生可逆的酯化反應(yīng)，羧基和氨基集團(tuán)中和反應(yīng)，前者生成穩(wěn)定的酯化物、硬化組織，后者維系穩(wěn)定的反應(yīng)條件，從而使聚羥基丙烯酸和蛋白質(zhì)發(fā)生廣泛的交聯(lián)［34］。

本研究中聚羥基丙烯酸固定乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織，切片HER-2基因FISH陽(yáng)性率為26.09%，4%中性緩沖甲醛固定乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織，切片HER-2基因FISH陽(yáng)性率為23.19%，與劉秋雨等［35］報(bào)道的44例乳腺癌FISH檢測(cè)HER-2基因，陽(yáng)性10例，陽(yáng)性率為23%，基本一致。

綜上所述，應(yīng)用聚羥基丙烯酸無(wú)毒、無(wú)揮發(fā)、固定效率高，減少了甲醛對(duì)環(huán)境的污染，改用新型環(huán)保組織固定液具有環(huán)保與學(xué)術(shù)價(jià)值。然而，迄今為止，因在質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)化、成本價(jià)格和毒力試驗(yàn)等方面原因，沒(méi)有哪個(gè)環(huán)保固定液替代品能撼動(dòng)4%中性緩沖甲醛的地位，環(huán)保固定液應(yīng)用在組織前固定只停留在試驗(yàn)階段：HE染色組織形態(tài)好，但由于本研究并沒(méi)囊括病理科所有標(biāo)本種類(lèi)的固定，作為一種新型環(huán)保試劑問(wèn)世時(shí)間短，遠(yuǎn)期效果還有待在多種組織大樣本量去驗(yàn)證。FISH檢測(cè)乳腺癌HER-2基因效果佳，雖然與4%中性緩沖甲醛相比較陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但到底以哪個(gè)陽(yáng)性率為準(zhǔn)會(huì)對(duì)后期指導(dǎo)個(gè)體化治療產(chǎn)生不同的后果。如果結(jié)合檢測(cè)同一標(biāo)本使用2種固定液的HER-2的免疫組化染色，以初步確定不同的陽(yáng)性率是聚羥基丙烯酸固定產(chǎn)生的假陽(yáng)性還是4%中性緩沖甲醛固定產(chǎn)生的假陰性又或是存在手工操作存在差異的可能，效果可能會(huì)更佳。

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Comparison of the role that poly hydroxy acrylic acid plays in the detection of HER-2 gene in breast cancer by hematoxylin and eosin staining and fluorescence in situ hybridization with that of 4% neutral buffered formaldehyde

CHEN Zhiqiang， WANG Ying， MI Xianjun， CHEN Ang， ZHONG Shoujun， HUANG Huayong， DENG Wentong LIU Chaofan， XU Xiumei， DAI Xinzhen （Department of Pathology， Zhongshan Boai Hospital Affiliated to Southern Medical University， Zhongshan 528400，Guangdong Province， China）

［Key words］Poly hydroxyl acrylic acid； Formaldehyde； Tissue section； Hematoxylin eosin staining； Breast cancer； HER-2 gene； Fluorescence in situ hybridization

［Abstract］Background and purpose: Adequate tissue fixation， transparent dewaxing is an important step of hematoxylin eosin （HE） staining and fluorescence in situ hybridization （FISH） in detection of breast cancer HER-2 gene.The purpose of this study was to make a comparison between poly hydroxyl acrylic acid which is an environmentally friendly fixation liquid and 4% neutral buffered formaldehyde in tissue fixation for HE staining and FISH to detect the HER-2 gene in the breast cancer tissue sections.The study aimed to evaluate the feasibility of replacing 4% buffered formaldehyde， a traditional fixation liquid， with the poly hydroxyl acrylic acid， an environmentally friendly fixationfluid.Methods: This project was performed on tissue samples collected from 69 cases of breast cancer， 41 cases of breast fibroadenoma， 40 cases of uterine leiomyoma， 25 cases of cervical tissue， 25 cases of placenta obtained from the outpatient and inpatient departments of Zhongshan Boai Hospital from Mar.2011 to Jan.2015， from each of which two samples were drawn and two blocks of each specimen were divided into two groups randomly.Then one group was fixed with 4% neutral buffered formaldehyde and made into 200 sections by HE while the other group was fixed with poly hydroxyl acrylic acid and made into another 200 sections.The slice level of the two groups was determined by the staining condition of the sections， and SPSS 19.0 was employed to compare the excellent and good rate of HE staining.Additional 69 sections were produced with two groups of breast invasive ductal carcinoma tissues， and SPSS 19.0 was used to detect the amplification of HER-2 gene by FISH.Results: First， the number of best-quality slices stained with HE fixed separately by poly hydroxyl acrylic acid and 4% neutral buffered formaldehyde was 155 and 166， respectively.The number of excellent pieces was 41 and 33， respectively， while the number of mediocre pieces was 3 and 1 with bad pieces being 1 and 0， respectively.The excellent and good rates of HE staining were 98% and 99.5%， respectively.There was no significant difference between the two groups （χ2=1.33， P＞0.05）.Second， the positive rates of the tissue slices by FISH fixed separately by poly hydroxyl acrylic acid and 4% neutral buffered were 26.09% and 23.19%，respectively.There was no significant difference between the two groups （χ2=0.50， P>0.05).Conclusion: The results obtained with HE staining and FISH using poly hydroxyl acrylic acid as a fixation liquid are not significantly different from those using 10% neutral buffered formaldehyde.Therefore， poly hydroxyl acrylic acid meets the requirements of environmental protection， and thus has the potential to be promoted and widely used.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.2.001

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639(2016)2-0121-07

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項(xiàng)課題（A2011746）；中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目重大專(zhuān)項(xiàng)（20113A004）；中山市局立項(xiàng)課題（2014J128）。

通信作者：陳志強(qiáng) E-mail：765228687@qq.com

收稿日期：（2015-06-18 修回日期：2015-09-13）