Dishevelled2在鼻咽癌順鉑耐藥中的作用研究*

羅　科，顧秀輝，彭遼天，曾國丹，劉　靜，張　坤，朱力

1.成都醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院(成都　610500)；2.成都醫(yī)學院 生物醫(yī)學系(成都　610500)；3.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(成都　610500)

Dishevelled2在鼻咽癌順鉑耐藥中的作用研究*

羅科1，顧秀輝1，彭遼天2，曾國丹2，劉靜2，張坤2，朱力3△

1.成都醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院(成都610500)；2.成都醫(yī)學院 生物醫(yī)學系(成都610500)；3.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(成都610500)

【摘要】目的探討散亂蛋白2(Dishevelled2，DVL2)對鼻咽癌順鉑化療敏感性的影響，為進一步研究DVL2在腫瘤化療耐藥中的作用機制奠定前期基礎。方法轉染pcDNA3.1-DVL2至鼻咽癌細胞5-8F，并用不同濃度(0，1，2，4，8，10，20 μmol/L)的順鉑處理細胞，MTT檢測過轉染DVL2對5-8F順鉑抑制率及半數抑制濃度(IC50)的影響，流式檢測DVL2高表達對順鉑的5-8F細胞凋亡的影響，Western blotting檢測DVL2對Wnt/β-catenin信號的影響。結果過表達DVL2明顯降低了順鉑對5-8F的抑制率，提高了其IC50，同時過表達DVL2明顯降低了順鉑誘導的5-8F細胞的凋亡，進一步研究顯示，過表達DVL2明顯增加了β-catenin及其靶基因P-gp和Survivin的蛋白表達。結論過表達DVL2可通過上調Wnt/β-catenin信號增強耐藥相關蛋白P-gp、Survivin的表達，從而誘發(fā)鼻咽癌順鉑耐藥。

【關鍵詞】散亂蛋白2；順鉑；鼻咽癌；耐藥性

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，多數鼻咽癌分化差，95%為低分化鱗癌，惡性程度高[1]。目前，鼻咽癌的臨床治療主要以放療和化療為主，5年生存率約50%～70%[2]。順鉑是鼻咽癌臨床化療的一線用藥，但在化療過程中常誘發(fā)鼻咽癌耐藥，嚴重影響鼻咽癌的治療效果及預后[3]。因此，探明鼻咽癌順鉑耐藥的機制，提高鉑類藥物的療效，是鼻咽癌治療的研究熱點。

散亂蛋白(Dishevelled，DVL)是Wnt/β-catenin信號通路中位于中上游的一個非常關鍵的正向調節(jié)因子。在Wnt/β-catenin信號通路中，活化后的DVL可促使β-catenin在胞質內積聚和核轉移，從而激活轉錄因子TCF/LEF誘導靶基因的表達[4-5]。研究[6-8]發(fā)現，DVL蛋白在乳腺癌、間皮瘤和腦膠質瘤中高表達并參與其惡性行為。 目前，國內外鮮有關于DVL家族各成員的表達與鼻咽癌細胞對順鉑化療耐藥的研究報道。因此，本研究旨在探明DVL2對鼻咽癌順鉑耐藥的影響，為進一步研究DVL2在腫瘤化療耐藥中的具體作用機制及為有效逆轉鼻咽癌耐藥奠定前期基礎。

1材料與方法

1.1材料

人鼻咽癌5-8F細胞株購自長沙贏潤生物技術有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Lipofectamine3000購自美國Invitrogen公司；順鉑(cisplatin)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；鼠抗人單克隆抗體DVL2、鼠抗人單克隆抗體β-catenin、兔抗人單克隆抗體P-gp和兔抗人單克隆抗體Survivin均購自美國SANTA CRUZ公司；兔抗小鼠單克隆抗體GAPDH、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和Annexin-V/PI凋亡試劑盒均購自中國碧云天公司；PVDF膜、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒均購自美國Millipore公司；質粒pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2由本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)5-8F細胞接種于含10%FBS、1%青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、飽和濕度95%、體積分數5%CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞融合度達80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2細胞轉染和分組轉染前1 d消化收集對數生長期的5-8F細胞，以每孔7×105個細胞接種于細胞培養(yǎng)六孔板中，用不含抗生素的正常培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，24 h內細胞融合度達80%左右時進行轉染。參照Liopfectamine3000產品說明書，分別將質粒pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2轉染至5-8F細胞中。根據轉染質粒不同分為：未轉染質粒組(Mock組)，陰性對照組轉染質粒pcDNA3.1 (pcDNA3.1組)，過表達組轉染質粒pcDNA3.1-DVL2(pcDNA3.1-DVL2組)。

1.2.3Western Blotting實驗轉染后48 h消化收集細胞，加入RIPA裂解液，充分裂解30 min，4 ℃， 13 800×g，離心15 min，收集上清液為細胞總蛋白。嚴格按照蛋白定量試劑盒操作說明進行蛋白定量，并取樣本加入上樣緩沖液，100 ℃變性10 min， 然后進行免疫印跡分析。順序按SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、分別加入一抗(鼠抗人單克隆抗體DVL2、鼠抗人單克隆抗體β-catenin、兔抗人單克隆抗體P-gp、兔抗人單克隆抗體Survivin和兔抗小鼠單克隆抗體GAPDH)4 ℃過夜、二抗室溫孵育90 min、ECL顯色。以GAPDH為內參。

1.2.4MTT實驗消化收集對數生長期的5-8F細胞，以每孔3×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，并同時將質粒pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2分別轉染至5-8F細胞中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分組同1.2.2。24 h后，各組細胞均分別加入順鉑，并調整其終濃度為(0，1，2，4，8，10，20 μmol/L)，順鉑處理48 h后，每孔分別加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)， 繼續(xù)孵育4 h后棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于震蕩儀上震蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀上選擇波長492 nm，檢測各孔OD值，計算細胞抑制率(IR)。抑制率(IR)={1-[(藥物組-空白對照組)/(陰性對照組-空白對照組)]}×100%。以藥物作用濃度與相應抑制百分數作散點圖，得到濃度-抑制率擬合曲線，通過線性回歸分析求出抑制率為50%細胞所需的藥物濃度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.2.5流式細胞分析消化收集對數生長期的5-8F細胞，以每孔2×105個細胞接種于12孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別將質粒pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2轉染至5-8F細胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入順鉑(終濃度10 μmol/L)作用24 h后，消化收集細胞，4 ℃ PBS 洗2次，離心棄上清。按試劑盒說明書要求，加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，調節(jié)細胞密度約為1×106個/mL。在細胞懸液中加入5 μL Annexin V和5 μL碘化丙錠溶液(PI)雙染，避光反應10 min左右，1 h內進行流式細胞術檢測細胞凋亡。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

2.1pcDNA3.1-DVL2質粒在5-8F細胞中的表達鑒定

與pcDNA3.1組相比，5-8F轉染pcDNA3.1-DVL2后，DVL2的蛋白含量明顯增加，提示：pcDNA3.1-DVL2在5-8F細胞中過表達成功(圖1)。

圖1Western Blotting鑒定過表達DVL2在5-8F細胞中的表達效應

注：5-8F細胞轉染pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2 48 h后收集細胞總蛋白，Western Blotting檢測DVL2蛋白表達變化

2.2DVL2降低鼻咽癌細胞對順鉑的敏感性

不同濃度順鉑(0，1，2，4，8，10，20 μmol/L)處理5-8F細胞后，MTT檢測結果顯示：順鉑對5-8F細胞的抑制率隨濃度增加而增加，而轉染pcDNA3.1-DVL2后，順鉑對5-8F細胞的抑制率明顯降低(圖2)。與pcDNA3.1組相比(IC50=6.11 μmol/L)，轉染pcDNA3.1-DVL2后的順鉑對5-8F細胞的IC50增加到14.55 μmol/L(表1)。

2.3DVL2降低順鉑誘導的5-8F細胞凋亡

流式細胞檢測結果發(fā)現：0 μmol/L順鉑誘導的未轉染質粒的5-8F細胞的凋亡率為(0.10±0.04)%(圖3A)；10 μmol/L順鉑誘導的未轉染質粒的5-8F

細胞的凋亡率為(43.37±0.57)%(圖3B)；轉染pcDNA3.1后，10 μmol/L順鉑誘導的5-8F細胞的凋亡率為(45.70±0.95)%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.059)(圖3C)；而轉染pcDNA3.1-DVL2后，10 μmol/L順鉑誘導的5-8F細胞的凋亡率減少到(28.37±1.20)%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007)(圖3D)。

表1　　　　順鉑在Mock、pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2

注：pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2的組間數據運用獨立樣本方差分析，pcDNA3.1-DVL2與pcDNA3.1相比，P=0.001,*P<0.01

注： 在5-8F細胞中轉染pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2，24 h后加入不同濃度的順鉑(0,1,2,4,8,10,20 μmol/L)處理48 h后，MTT檢測順鉑對細胞抑制率(在相同順鉑濃度下，pcDNA3.1-DVL2組與pcDNA3.1組相比：順鉑1 μmol/L，P=0.001；順鉑2 μmol/L，P=0.003；順鉑4 μmol/L，P=0.006；順鉑8 μmol/L，P=0.005；順鉑10 μmol/L，P=0.006；順鉑20 μmol/L，P=0.009)

圖3Annexin V/PI雙染色流式細胞檢測DVL2對順鉑誘導的5-8F細胞凋亡的影響

注：5-8F細胞中轉染pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2，24 h后加入順鉑(10 μmol/L)，繼續(xù)作用24 h后利用Annexin V/PI雙染色流式細胞檢測細胞凋亡率。 A: 0 μmol/L順鉑；B: 10 μmol/L順鉑；C: pcDNA3.1+10 μmol/L順鉑；D: pcDNA3.1-DVL2+ 10 μmol/L順鉑

2.4DVL2增強P-gp及Survivin的蛋白表達

轉染pcDNA3.1-DVL2后，5-8F細胞中Wnt/β-catenin信號下游重要靶基因P-gp和Survivin的蛋白表達明顯上調(圖4)。

圖4Western Blotting分析過表達DVL2對5-8F細胞中P-gp及Survivin蛋白水平的影響

注：5-8F細胞轉染pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2 48 h后收集細胞總蛋白，Western Blotting檢測P-gp及Survivin蛋白表達變化

2.5DVL2增強β-catenin的蛋白表達轉染pcDNA3.1-DVL2后，5-8F細胞中β-catenin的蛋白表達明顯上調(圖5)。

圖5Western Blotting分析過表達DVL2對5-8F細胞中β-catenin蛋白水平的影響

注：5-8F細胞轉染pcDNA3.1與pcDNA3.1-DVL2 48h后收集細胞總蛋白，Western Blotting檢測β-catenin蛋白表達變化

3討論

鼻咽癌是一種多基因遺傳性腫瘤，在中國南方發(fā)病率和死亡率均居頭頸部惡性腫瘤之首，嚴重危害當地群眾生命健康?；熓悄壳爸委煴茄拾┲匾氖侄沃?，但在化療過程中鼻咽癌常會對化療藥物產生拮抗，導致化療失敗。因此，化療耐藥是鼻咽癌現階段治療中難以取得實質性進展的主要障礙。鼻咽癌耐藥主要分為先天性耐藥和獲得性耐藥，前者表現為腫瘤細胞對化療藥物的天然不敏感性；后者是腫瘤細胞因抗癌藥物誘導或其他因素的激活而產生的耐藥性[9]。目前，鼻咽癌耐藥的具體分子機制尚不完全清楚。

Wnt/β-catenin信號通路是調控細胞生長發(fā)育和分化的關鍵通路之一。其信號傳導通路的主要成員包括細胞外因子(Wnt蛋白)、跨膜受體(frizzled)、DVL、β連環(huán)蛋白(β-catenin)及核內轉錄因子(TCF/LEF)等[10-11]。研究[11-12]發(fā)現，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。目前，在人和小鼠中已鑒定3個DVL基因(DVL1、DVL2和DVL3)，3者均包含高度保守的DIX、PDZ和DEP結構域。DVL是Wnt/β-catenin信號通路中位于β-catenin上游的正向調節(jié)因子，對該通路激活具有關鍵調控作用。無論有無Wnt信號情況下，活化后的DVL均可阻斷GSK3β/β-catenin毀滅復合物形成，促使β-catenin在細胞內積累并與轉錄因子TCF/LEF結合，從而激活Wnt下游靶基因的轉錄[13]。

DVL蛋白在多種腫瘤中高表達并參與其惡性行為[6-8]。但目前該基因與腫瘤耐藥的相關性鮮有報道。在鼻咽癌細胞5-8F中轉染pcDNA3.1-DVL2表達質粒后發(fā)現，過表達DVL2明顯降低了順鉑對5-8F細胞的抑制率，提示DVL2與順鉑耐藥相關。此外，過表達DVL2也降低了順鉑誘導的細胞凋亡，提示DVL2可以通過細胞抗凋亡途徑來上調順鉑耐藥。

為分析DVL2誘發(fā)5-8F細胞順鉑耐藥的原因，本研究檢測了過表達DVL2對5-8F細胞中多藥耐藥蛋白(P-gp)、抗凋亡蛋白(Survivin)的影響。P-gp是一種依賴ATP具有跨膜轉運功能的糖蛋白，它通過外排化療藥物，降低藥物在細胞內聚集而導致細胞耐藥[14-15]。本研究發(fā)現，過表達DVL2后P-gp的蛋白表達量明顯上調，提示DVL2可能通過上調P-gp的表達來促進順鉑外排產生耐藥。既往研究[16-17]提示，腫瘤耐藥不僅受藥物外排機制調控，而且與細胞抗凋亡作用密切相關。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成員,具有強大的抗凋亡活性，在許多惡性腫瘤組織中發(fā)現有Survivin的表達增高。抑制Survivin的表達可以增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[18]。本研究檢測了DVL2對Survivin的影響，結果發(fā)現，Survivin蛋白表達隨DVL2的含量增高而增高，提示DVL2可以通過上調Survivin的表達增強鼻咽癌抗凋亡作用。以上結果提示，DVL2可通過上調P-gp和Survivin的表達來降低鼻咽癌對順鉑化療的敏感性從而增強其耐藥。

研究[19-20]發(fā)現，Wnt/β-catenin信號通路的下游重要靶基因P-gp、Survivin參與了腫瘤化療耐藥的外排化療藥物、抗凋亡過程。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵調控因子。為進一步探明DVL2是如何調控P-gp及Survivin的蛋白表達，本研究通過Western blotting檢測過表達DVL2后5-8F細胞中β-catenin的蛋白表達變化。結果表明，過表達DVL2明顯上調β-catenin的蛋白表達，提示DVL2可通過上調β-catenin增強P-gp、Survivin的表達。

以上研究結果表明，DVL2表達增高可增強鼻咽癌對順鉑的耐受，抑制順鉑誘導的細胞凋亡。一方面可能是因為其活化Wnt/β-catenin信號上調P-gp的表達，導致化療藥物外排；另一方面通過活化Wnt/β-catenin信號上調Survivin的表達，減少細胞發(fā)生凋亡。綜上所述，DVL2的表達量與鼻咽癌順鉑耐藥成正相關，這為解決鼻咽癌順鉑耐藥問題提供了新視野。

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The Role of Dishevelled2 in Cisplatin-based Chemotherapy in Nasopharyngeal Carcinoma

LuoKe1,GuXiuhui1,PengLiaotian2,ZengGuodan2,LiuJing2,ZhangKun2,ZhuLi3△.

1.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;2.SchoolofBiomedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;3.DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,TheFirstAffiliatedofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of Dishevelled2(DVL2) on chemotherapy sensitivity of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells to cisplatin,and provide a basis for the research on the mechanism of DVL2 in tumor resistance.MethodsThe 5-8F cells were transfected by pcDNA3.1-DVL2 and then treated by various concentration of cisplatin.The effects of DVL2 on the cisplatin-mediated inhibition and apoptosis of 5-8F cells were detected by MTT and Flow cytometric assays respectively.The effects of DVL2 on Wnt/β-catenin signaling was examined by Western blotting assay. ResultsThe results showed that the cisplatin-mediated inhibition and apoptosis of 5-8F cells were decreased by overexpression of DVL2, and that the protein levels of β-catenin,P-gp and Survivin were increased by overexpression of DVL2.ConclusionThe overexpression of DVL2 enhances the resistance of nasopharyngeal carcinoma to cisplatin via upregulation of P-gp and Survivin by Wnt/ β-catenin signaling.

【Key words】Dishevelled2；Cisplatin；Nasopharyngeal carcinoma；Drug resistance

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.001

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(No:81301919)；四川省科技廳應用基礎研究基金(No:2015JY0256)

通信作者：△朱力，E-mail:1968403299@qq.com

【中圖分類號】R739.63

【文獻標志碼】A

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160406.1542.014.html

·論著·