三疣梭子蟹腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（ANT）基因的克隆與分析

李冰玥 朱冬發(fā) 邱錫爾 周彥琦 柳志業(yè) 謝熙

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

三疣梭子蟹腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（ANT）基因的克隆與分析

李冰玥 朱冬發(fā) 邱錫爾 周彥琦 柳志業(yè) 謝熙

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（Adenine nucleotide translocase，ANT）是線粒體內(nèi)膜上負(fù)責(zé)能量分子傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在能量代謝中起著關(guān)鍵作用。為了研究ANT基因在甲殼動(dòng)物蛻皮中的作用，采用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE技術(shù)）克隆得到三疣梭子蟹ANT基因的序列全長(zhǎng)（GenBank登錄號(hào)：KM921660），該序列全長(zhǎng)1 414 bp，包括132 bp的5'端非編碼區(qū)，352 bp的3'段非編碼區(qū)，具有930 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼309個(gè)氨基酸。將該ANT基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列與已公布的其他物種ANT序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹ANT基因與其他甲殼動(dòng)物ANT基因聚為一支，其中與擬穴青蟹ANT一致性高達(dá)96%。通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹ANT序列具有3個(gè)保守的線粒體穿膜功能結(jié)構(gòu)域，是形成能量分子傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)通道，催化細(xì)胞質(zhì)中ADP和線粒體內(nèi)ATP間進(jìn)行跨膜交換。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析三疣梭子蟹ANT基因的組織差異表達(dá)，結(jié)果表明ANT基因在三疣梭子蟹肌肉（Ms）中的表達(dá)量最高，在其他組織中表達(dá)量均較低，具顯著差異（P<0.05）；在三疣梭子蟹蛻皮周期中，肌肉中ANT基因的表達(dá)量A期最高（P<0.05），然后下降，至C期最低，隨后又逐漸上升至D1期，在D1期出現(xiàn)第2個(gè)峰值后再逐漸下降。研究結(jié)果說明ANT基因與三疣梭子蟹肌肉活動(dòng)密切相關(guān)，可能在蛻皮調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

三疣梭子蟹；腺苷酸轉(zhuǎn)移酶；克?。荒芰哭D(zhuǎn)運(yùn)；表達(dá)水平

腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（Adenine nucleotide translocase，ANT）屬于真核細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員［1-3］，作為代謝物載體參與線粒體的各種活動(dòng)［2，4，5］。ANT在線粒體內(nèi)膜上分布最為豐富，約占細(xì)胞線粒體總蛋白的1%-10%［6］，其主要功能是催化細(xì)胞質(zhì)中ADP和線粒體內(nèi)ATP間進(jìn)行跨膜交換，是保持細(xì)胞內(nèi)能量平衡的關(guān)鍵成分［7］。近年來的研究表明，ANT 在線粒體內(nèi)膜的穿膜孔洞的形成和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)過程中起重要作用［8-10］，是各種細(xì)胞凋亡因子或凋亡抑制因子的作用靶位［11-14］。生物體大約1/3-1/2的基礎(chǔ)電子傳遞由ANT催化，它是保持細(xì)胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵蛋白［15，16］，另也有研究表明，ANT 參與了腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［17］。

ANT 蛋白通過兩個(gè)分別含有ATP/ADP 結(jié)合位點(diǎn)的亞基的構(gòu)象變化來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中ADP和線粒體內(nèi)ATP 間的跨膜交換［18］，是生物體內(nèi)能量產(chǎn)生和消耗的重要連接［19］。大多數(shù)真核生物至少有2個(gè)不同的ANT基因［16］，目前已從凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）等甲殼動(dòng)物中克隆到其同源基因，它們?cè)谶M(jìn)化上高度保守。但至今尚未見三疣梭子蟹ANT基因的相關(guān)報(bào)道。

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我國沿海的重要經(jīng)濟(jì)蟹類，蛻皮是甲殼動(dòng)物蛻去舊的外骨骼，個(gè)體增大后新甲殼迅速硬化為外骨骼的過程。但是，到目前為止，對(duì)其蛻皮發(fā)生的機(jī)制仍然不是很清楚，特別是其蛻皮周期的分子調(diào)控機(jī)理。因此，本研究克隆了三疣梭子蟹ANT的cDNA序列，并對(duì)其組織差異表達(dá)和蛻皮周期中的表達(dá)變化進(jìn)行了分析，旨在對(duì)闡明三疣梭子蟹蛻皮的分子調(diào)控機(jī)理提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)取材的三疣梭子蟹暫養(yǎng)于寧波市寧?？h得水育苗場(chǎng)。采用形態(tài)觀察法將三疣梭子蟹的蛻皮周期分為蛻皮后期（A期和B期）、蛻皮間期（C期）、蛻皮前期（D0、D1、D2、D3和D4亞期）和蛻皮期（E期）4個(gè)階段［20］。解剖取C期三疣梭子蟹大顎器、Y器、肌肉、腦、心臟、眼柄、胸神經(jīng)節(jié)、腸、表皮和肝胰腺用于組織表達(dá)差異性分析，采集各期（除E期外）三疣梭子蟹肌肉組織進(jìn)行蛻皮周期中ANT基因的表達(dá)差異變化分析。蛻皮周期各期均選取4只螃蟹做平行實(shí)驗(yàn)，由于E期的時(shí)間較短不利于采集到適合做統(tǒng)計(jì)分析的樣本，故只采集了其他各期的樣本。解剖獲得的新鮮組織暫時(shí)浸泡于RNA保護(hù)液（生工生物工程（上海）有限公司）中，置于-20℃暫存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 將保存在RNA保護(hù)液中的樣品轉(zhuǎn)移至Trizol（生工生物工程（上海）有限公司）溶液中，按說明書所述步驟提取各個(gè)樣品中的總RNA。

1.2.2 cDNA的合成 取Ms組織提取的總RNA，按 照 PrimeScriptRTreagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）試劑盒說明書步驟，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA。3'-RACE擴(kuò)增所需的3'-RACE-cDNA以AP（表1）為接頭引物，參照上述方法反轉(zhuǎn)錄獲得；5'-RACE擴(kuò) 增 所 需 的5'-RACE-cDNA按 照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書合成。cDNA均置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 三疣梭子蟹ANT基因核心片段的擴(kuò)增 根據(jù)NCBI已公布的甲殼動(dòng)物ANT核苷酸序列，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)引物ANT-F，ANT-R（表1）。以第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（體系為25 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 50 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s，34個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳、瓊脂糖凝膠回收并純化，與pMD18-T載體連接再轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過菌落PCR檢測(cè)后挑選陽性克隆菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后將菌液送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.2.4 三疣梭子蟹ANT基因3'RACE和5' RACE的擴(kuò)增 根據(jù)已測(cè)得的核心序列和AP接頭分別設(shè)計(jì)特異性引物ANT-3F1、ANT-3F2、ANT-3F3和3'outer、3'inner（表1），進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增。第一輪PCR以3'RACE-cDNA為 模 板，ANT-3F1、ANT-3F2和3'outer為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（體系為25 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 50 s，56℃ 50 s，72℃ 50 s，34個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束）。第二輪以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為cDNA模板，ANT-3F2、ANT-3F3和3'inner為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（體系為25 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 50 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s，34個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束）。

3'RACE產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 說明合成5' RACE-cDNA并設(shè)計(jì)下游特異性引物ANT-5R1、ANT-5R2、ANT-5R3，以5'outer、5'inner（表1）為上游引物，同理進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。后續(xù)操作參照1.2.3。

表1 PCR引物序列

1.2.5 序列分析 利用Vector NTI 10.0測(cè)序軟件將核心序列和3'RACE和5'RACE的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得三疣梭子蟹ANT基因的cDNA全長(zhǎng)。利用NCBI 在線ORF Finder工具確定ANT基因的開放閱讀框（ORF）序列，并翻譯成氨基酸序列；利用ClustalX軟件將該氨基酸序列與已公布的ANT氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用ExPASy Proteomics Server（http://ca.expasy.org/）所提供的ProtParam tool蛋白質(zhì)分析軟件分析氨基酸序列；使用Signal 3.0 Server（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測(cè)信號(hào)肽，TMHMM在 線 工 具 （http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）預(yù)測(cè)氨基酸跨膜區(qū)域。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR） 取需要的組織利用與1.2.1相同的 Trizol 法抽取總RNA后，取1.0 μg RNA用 PrimeScript Rtreagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù) ANT cDNA 全長(zhǎng)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物ANTYG-F1和ANTYG-F2（表1）檢測(cè)ANT基因在不同組織中的表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參。qRT-PCR的反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95℃ 5 s，55.3℃ 20 s，68℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，55℃ 15 s，升溫25 min，95℃ 15 s。用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 三疣梭子蟹ANT基因cDNA全長(zhǎng)與序列分析

基于ANT基因的同源核苷酸序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)兩對(duì)引物ANT-F和ANT-R進(jìn)行PCR克隆得到1 091 bp的核心序列。3'RACE 以ANT-3F1、ANT-3F2、ANT-3F3和 3'outer、3'inner為 引物，擴(kuò)增獲得903 bp的3'端片段；5'RACE以ANT-5R1、ANT-5R2、ANT-5R3和5'outer、5'inner為引物，擴(kuò)增得535 bp的5'端片段。通過拼接后獲得總長(zhǎng)為1 414 bp的ANT序列cDNA全長(zhǎng)，GenBank登錄號(hào)：KM921660。5'端非編碼區(qū)為132 bp，3'端非編碼區(qū)為352 bp，開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為930 bp，編碼309個(gè)氨基酸。利用ExPASy網(wǎng)站在線ProtParam tool預(yù)測(cè)其分子式為C4185H6958N1414O1752S351，分子量大小約為116 368.7 Da，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為4.98，富含Gly（27.9%）、Cys（24.8%）、Thr（23.8%）、和Ala（23.5%）等。不穩(wěn)定系數(shù)為42.42，說明三疣梭子蟹ANT蛋白并不穩(wěn)定。該氨基酸親水性總和G RAVY（Gran d average of hydropathicity）為0.765，屬于親水性蛋白。

在線Signal軟件（http:// www.cbs.dtu.dk/ser vices/ SignalP）對(duì)其編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行分析，未 發(fā)現(xiàn)有信號(hào)肽，說明三疣梭子蟹ANT不屬于分泌蛋白。在線TMHMM工具分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列沒有跨膜結(jié)構(gòu)。NCBI在線Conserved Domain Search工具對(duì)氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)ANT蛋白具有3個(gè)重復(fù)的同源的線粒體跨膜結(jié)構(gòu)域，分別在第148-441位、466-756位、754-1044位（圖1）。在NCBI上將該序列編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，BLAST結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與已公布的其他物種ANT氨基酸序列相比，PtANT與擬穴青蟹（S. paramamosain）的ANT一致性最高，達(dá)到96%，與凡納濱對(duì)蝦（L. vannamei）、斑節(jié)對(duì)蝦（P. monodon）和日本囊對(duì)蝦（M. japonicus）的ANT也均達(dá)到90%左右，與昆蟲和脊椎動(dòng)物的ANT也有較高的一致性，達(dá)到68%以上（圖2）。從NCBI蛋白序列數(shù)據(jù)庫中選取具有代表性的甲殼動(dòng)物、昆蟲和脊椎動(dòng)物ANT氨基酸序列，用MEGA 4.0軟件的鄰位法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置重復(fù)次數(shù)（Replications）為1 000。從進(jìn)化樹結(jié)果（圖3）來看，三疣梭子蟹與擬穴青蟹親緣關(guān)系最近，而后與凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、日本囊對(duì)蝦等甲殼動(dòng)物聚為一支；肩突硬蜱（Ixodes scapularis）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）等昆蟲聚為一大支后與脊椎動(dòng)物的ANT1、ANT2、ANT3三種亞型聚為一大支，最后脊椎動(dòng)物的ANT4亞型單獨(dú)聚為一支，符合生物進(jìn)化上的地位關(guān)系。

圖1 三疣梭子蟹ANT全長(zhǎng)cDNA核苷酸序列和編碼區(qū)氨基酸序列

2.2 ANT基因在三疣梭子蟹不同組織中的表達(dá)差異分析

采用熒光定量PCR檢測(cè)了三疣梭子蟹ANT基因在心臟、肝胰腺、表皮、胸腺神經(jīng)節(jié)、腦、肌肉、Y器、眼柄、大顎器和腸共10個(gè)組織中的表達(dá)相對(duì)量。結(jié)果（圖4）顯示，該基因在肌肉（Ms）中的表達(dá)量最高（P<0.05），大顎器等9種組織中的表達(dá)量均較低。

文中在研究Minimax算法的基礎(chǔ)上，通過將Minimax算法轉(zhuǎn)化為可以求解的非線性規(guī)劃問題對(duì)多口徑多波束反射面天線進(jìn)行賦形。為說明問題，設(shè)定參數(shù)建模設(shè)計(jì)了一個(gè)四口徑多波束天線，將口徑面的相位值作為優(yōu)化對(duì)象，由口徑場(chǎng)法根據(jù)口徑面的電場(chǎng)值和設(shè)定的相位值，求得遠(yuǎn)區(qū)場(chǎng)的場(chǎng)值。將其中的邊緣波束增益和副瓣電平值作為目標(biāo)函數(shù)，通過優(yōu)化得到賦形后的口徑面相位值，然后離散化反射面得到賦形后反射面上任一點(diǎn)的位置信息，得到重構(gòu)后的反射面，從而達(dá)到提高天線C/I值的目的。賦形后的反射面其C/I值相比于賦形前提高2 dB，達(dá)到了比較好的目的，具有一定的工程應(yīng)用的價(jià)值。

2.3 ANT基因在蛻皮周期的表達(dá)水平分析

組織表達(dá)結(jié)果顯示，ANT基因在三疣梭子蟹Ms中表達(dá)量最高，所以選擇Ms為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行ANT基因在蛻皮周期中的表達(dá)水平變化分析。qRT-PCR的結(jié)果（圖5）表明三疣梭子蟹Ms中的ANT基因在整個(gè)蛻皮周期中均有表達(dá)，在蛻皮A期最高，降低至C期最低，再逐漸升高在D1期達(dá)到第二個(gè)小高峰，隨后又逐漸下降，最終在D4期降至最低。

圖2 三疣梭子蟹與其它物種ANT氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果

3 討論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要的ATP生產(chǎn)中心，ANT在催化細(xì)胞質(zhì)中ADP和線粒體內(nèi)ATP進(jìn)行跨膜交換時(shí)起著重要的作用，是保持細(xì)胞內(nèi)能量平衡的關(guān)鍵成分。本實(shí)驗(yàn)克隆得到了三疣梭子蟹ANT的全長(zhǎng)cDNA序列（PtANT），該序列全長(zhǎng)1 414 bp，包含一個(gè)930 bp的開放閱讀框（ORF），編碼309個(gè)氨基酸。PtANT主要由3個(gè)同源的線粒體跨膜結(jié)構(gòu)域組成，分別在其第6-104位、113-209位和208-305位，每個(gè)結(jié)構(gòu)域含2個(gè)跨膜區(qū)。這與目前已知許多物種的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶具有相似的結(jié)構(gòu)功能域。BLAST結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與已公布的其他物種ANT氨基酸序列相比，PtANT與擬穴青蟹的ANT一致性最高，達(dá)到96%，與凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦的ANT也均達(dá)到90%左右，與昆蟲和脊椎動(dòng)物的ANT也有較高的一致性，達(dá)到68%以上。該結(jié)果表明各物種間的ANT具有良好的一致性，各物種ANT可能具有相似的功能。值得注意的是，進(jìn)化樹結(jié)果顯示哺乳動(dòng)物的ANT4單獨(dú)聚為一大支，而其他ANT亞型則與甲殼及昆蟲的ANT聚在一起，這說明本研究克隆得到的PtANT以及現(xiàn)有甲殼動(dòng)物及昆蟲的ANT應(yīng)該不屬于ANT4，但PtANT究竟屬于其他一種ANT還有待進(jìn)一步研究。

圖3 三疣梭子蟹ANT氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 ANT基因在三疣梭子蟹各組織中的相對(duì)表達(dá)水平

組織表達(dá)結(jié)果顯示PtANT在三疣梭子蟹各個(gè)組織中均有表達(dá)，其在肌肉中表達(dá)量最高，顯著高于其他各個(gè)組織。這可能與肌肉對(duì)線粒體提供的能量需求較大有關(guān)，再一次表明了ANT在保持細(xì)胞內(nèi)能量平衡時(shí)的重要作用。該結(jié)果與孫文文等［20］在研究斑節(jié)對(duì)蝦ANT（PmANT）的結(jié)果相似。但斑節(jié)對(duì)蝦中PmANT在心臟中也有很高的表達(dá)，擬穴青蟹的ANT也在心臟中表達(dá)量最高，而本研究中PtANT在心臟中表達(dá)水平較低，這表明本研究克隆獲得的PtANT與斑節(jié)對(duì)蝦及擬穴青蟹的ANT在功能上可能并不一致。

圖5 Ms中ANT基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的相對(duì)表達(dá)差異

肌肉中的ANT基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達(dá)也有所差異。三疣梭子蟹ANT在蛻皮A期轉(zhuǎn)錄水平最高，這可能與三疣梭子蟹剛完成蛻皮過程有關(guān)。三疣梭子蟹蛻皮時(shí)肌肉消耗了大量能量；另一方面在蛻皮后仍需要繼續(xù)吸水增大體積［21］，還要消耗較多的能量，腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量也就相對(duì)較高。而在蛻皮間期（C期），三疣梭子蟹體內(nèi)的含水量下降，營養(yǎng)物質(zhì)開始積累，為下一次的蛻皮做物質(zhì)準(zhǔn)備，此時(shí)因?yàn)樾卤砥み€沒有形成，能量消耗較少，所以ANT的表達(dá)量最低。D0期時(shí)，新殼開始分泌但還未成形，ANT的表達(dá)量開始逐漸升高，并保持在一個(gè)較高水平，從D1到D3，都處于新殼在不斷分泌的過程，所以腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)表達(dá)量都較C期有所升高，為新表皮的生成提供所需的能量。

4 結(jié)論

本研究克隆了三疣梭子蟹ANT基因的cDNA全長(zhǎng)，其氨基酸序列與擬穴青蟹的同源性最高。該基因在三疣梭子蟹心臟、肝胰腺、表皮、胸腺神經(jīng)節(jié)、大腦、肌肉、Y器、眼柄、大顎器、腸組織中均有表達(dá)，在肌肉組織中的表達(dá)量最高。ANT基因在蛻皮后期A期中表達(dá)量最高，在蛻皮間期C期中表達(dá)量最低。說明ANT基因可能在蛻皮周期的能量轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要的作用。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Analysis of Gene for Adenine Nucleotide Translocase in Portunus trituberculatus

LI Bing-yue ZHU Dong-fa QIU Xi-er ZHOU Yan-qi LIU Zhi-ye XIE Xi
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211）

Adenine nucleotide translocase（ANT）is a transport protein responsible for the conduction of energy molecules in the inner membrane of mitochondria，playing a vital role in the energy metabolism. In order to study the role of ANT gene in the molting of crustacean，a full-length cDNA of ANT gene（GenBank access number：KM921660）was cloned from Portunus trituberculatus using RT-PCR and RACE. Sequence analysis showed that it was 1 414 bp long，including a 132 bp 5' non-coding region，a 352 bp 3' non-coding region，and a 930 bp coding region，and encoded 309 amino acids. The phylogenetic comparison of ANT gene sequence between P. trituberculatus and other species revealed that ANT gene from P. trituberculatus and other species clustered as one same branch，and the similarity with Scylla paramamosain was up to 96%. Amino acid alignment proved that it had 3 conserved mitochondrial transmembrane domains，forming a channel for the conduction of energy molecules，and catalyzing transmembrane exchange between ATP in mitochondria and ADP in cytoplasm. Real-time PCR results indicated that ANT gene expressed in all 10 different tissues with the highest expression in muscle，while quite low in all other tissues，and there were significant differences among the expressions of the tissues（P<0.05）. During the whole molting process，the level of ANT in muscle reached the maximum at postmolt（stage A），then began to decline until the least during intermolt（stage C），and then gradually rose until the second peak at stage D1，then declined again. The combined result indicated that ANT gene was closely correlated with the activity of muscle of P. trituberculatus，and might play an essential role in the molting.

Portunus trituberculatus；ADP/ATP translocases（ANT）；clone；energy transportation；expression level

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.016

2015-06-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41376152），浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY13C190006）

李冰玥，女，研究方向：甲殼動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)；E-mail：15757828736@163.com

朱冬發(fā)，男，博士，教授，研究方向：甲殼動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)；E-mail：zhudongfa@nbu.edu.cn