大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種NPY基因的DNA和cDNA克隆及序列分析

劉浩白俊杰李勝杰

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種NPY基因的DNA和cDNA克隆及序列分析

劉浩1，2白俊杰1李勝杰1

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

神經(jīng)肽Y（Neuropeptide Y，NPY）在機(jī)體的攝食活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，是哺乳動(dòng)物最重要的一種內(nèi)源性促食欲因子。為了解大口黑鱸（Micropterus salmoide）NPY基因的結(jié)構(gòu)及進(jìn)一步研究該基因在大口黑鱸中的功能作用，采用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆了大口黑鱸北方亞種（M. salmoides salmoides）和佛羅里達(dá)亞種（M. salmoides floridanus）NPY基因cDNA序列，結(jié)果表明兩亞種NPY cDNA均包括一個(gè)編碼99個(gè)氨基酸的ORF框和長(zhǎng)度為52 bp的5'非編碼區(qū)（5'-UTR）；采用PCR和基因組步移技術(shù)獲得了長(zhǎng)度分別為3 561 bp和3 565 bp的大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種NPY基因DNA序列。序列分析結(jié)果表明，大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種NPY基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。經(jīng)MATINSPECTOR軟件預(yù)測(cè)，在北方亞種和佛羅里達(dá)亞種啟動(dòng)子序列分布有TATA框、CAAT框、CCAAT-Box、GATA-Box等基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。實(shí)驗(yàn)在大口黑鱸兩亞種NPY DNA序列間發(fā)現(xiàn)了6個(gè)單個(gè)位點(diǎn)堿基差異，與大口黑鱸北方亞種相比佛羅里達(dá)亞種啟動(dòng)子區(qū)域出現(xiàn)一個(gè)4個(gè)堿基的插入。不同物種間NPY基因的序列同源性分析表明大口黑鱸與鱖魚和石斑魚的NPY基因核苷酸同源性最高，達(dá)90%和88%，氨基酸同源性分別為93%和95%。

大口黑鱸；亞種；食欲；NPY基因

神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）是一種含36個(gè)氨基酸的單鏈多肽，通過(guò)不同的受體將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物作用，對(duì)脊椎動(dòng)物的攝食起到重要的促進(jìn)作用［1］。1982年，Tatemoto等首先從豬腦中提取一種多肽，結(jié)構(gòu)與YY肽（PYY）、胰多肽（YY）相似，具有發(fā)卡樣的三維結(jié)構(gòu)，所以命名為神經(jīng)肽Y。研究發(fā)現(xiàn)NPY在進(jìn)化過(guò)程中非常保守，人、大鼠、小鼠以及家雞NPY氨基酸序列完全一樣，魚類神經(jīng)肽Y與哺乳動(dòng)物神經(jīng)肽Y也具有較高的同源性［2］。

NPY是已發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)有力的攝食刺激因子，饑餓時(shí)下丘腦弓狀核神經(jīng)原合成NPY增多，傳遞給室旁核，作用于飽食中樞，進(jìn)而刺激進(jìn)食［3-5］。NPY在魚類攝食中的研究已有相關(guān)報(bào)道，例如，金魚腦室注射NPY可增加攝食量［6］；禁食后的金魚下丘腦有大量的NPY mRNA表達(dá)［7］。研究表明，食物缺乏將會(huì)使金魚、銀大麻哈魚和印第安大馬哈魚下丘腦中NPY的mRNA表達(dá)含量增加，復(fù)投餌后產(chǎn)生相反的影響［6-9］。目前，已有草魚、鱖魚、歐洲狼鱸、斑馬魚［10］、鯉魚、斑點(diǎn)叉尾鮰［11］、虹鱒［12］、褐牙鲆［13］及斜帶石斑魚［14］等的NPY cDNA序列或者NPY基因組序列被克隆。

本研究報(bào)道了大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種NPY基因cDNA的克隆與序列分析，克隆得到兩亞種NPY基因的全DNA序列；并采用生物信息學(xué)方法對(duì)其啟動(dòng)子上的作用元件進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)大口黑鱸兩亞種NPY基因的差異進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究大口黑鱸的NPY基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用大口黑鱸佛羅里達(dá)亞種和北方亞種成魚體重約400 g，取自珠江水產(chǎn)研究所肇慶高要養(yǎng)殖基地；Trizol RNA提取試劑盒、RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、膠回收試劑盒和pMD19-T vectors system 購(gòu)自TaKaRa公司；RACE試劑盒和Genome Walker Universal Kit購(gòu)自Clontech公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 腦組織總RNA的提取 按照TaKaRa公司Trizol試劑盒提供的方法分別提取大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種腦組織總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。

1.2.2 基因組DNA的提取 取大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種背部肌肉30 mg，按照天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒的方法進(jìn)行。

1.2.3 大口黑鱸兩亞種NPY基因cDNA序列的擴(kuò)增和克隆 參照GenBank中已登錄的大黃魚（Larimichthys crocea）、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）、翹嘴鱖（Siniperca chuatsi ）、 花 鱸（Lateolabrax japonicus）、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）等魚的NPY基因的cDNA序列，在同源保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)上游引物p1：5'-AGGGATACCCAGTGAAACCG-3'，上游引物p2：5'-AGAGCTGCTGCTGAAGGA-3'和一個(gè)下游引物p3：5'-TCTTGACTGTGGAAGCGTGT-3'；引物委托廣州吉格生物科技有限公司合成，大口黑鱸兩亞種NPY基因的cDNA和基 因組克隆均使用相同的引物進(jìn)行相關(guān)擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒上的步驟進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后采用p1和上述試劑盒中提供的下游引物M13 Primer M4：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：Primer Star Mix：10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用引物p1和p3進(jìn)行巢式擴(kuò)增得到開放閱讀框（ORF）序列，然后用p2和反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的oligo dT Adaptor primer進(jìn)行3'RACE，PCR反應(yīng)程序同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆送上海英駿公司測(cè)序；使用Vector NTI 10.3軟件將上述序列進(jìn)行拼接得到ORF框和3'非編碼區(qū)。

1.2.4 NPY基因內(nèi)含子的擴(kuò)增和克隆 根據(jù)已獲得的大口黑鱸NPY基因的cDNA序列，參照近源物種NPY基因內(nèi)含子的位置設(shè)計(jì)3對(duì)引物：F1：5'-GCATTGTTATTTTACGGGTTTGTT-3'，R1：5'-AGAGGTAGTCGCCTACTCTGTCTT-3'；F2：5'-GGCGCCCTAACGGAGGGATACCC-3'，R2：5'-CCTTCAGCAGCAGCTCTGAGACC-3'；F3：5'-ATGGAAAGAGGTCTAGTCCTGAG-3'，R3：5'-CAATTATACAATACAATCAACATGC-3'。分別以大口黑鱸兩亞種基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取內(nèi)含子序列；PCR體系同1.2.3中反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 2 min；94℃ 35 s，57℃ 30 s，72℃32 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)后挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.5 NPY基因5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)序列的擴(kuò)增和克隆 根據(jù)Genome Walker Universal Kit試劑盒的操作步驟，分別使用EcoR V酶切大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種基因組DNA后，與試劑盒中的接頭連接建庫(kù)。為了擴(kuò)增5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)序列，按要求進(jìn)行兩次遞減PCR，第一次PCR的引物為AP1（試劑盒提供）：5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'和NPYGSP1：5'-TAGTACTTGGCTAGCTCGTCCGC-3'，先進(jìn)行4個(gè)循環(huán)94℃ 15 s，72℃ 2 min，再進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，94℃ 25 s，65℃ 3 min，最后進(jìn)行一個(gè)循環(huán)65℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為模板，以AP2（試劑盒提供）：5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'和NPYGSP2：5'- CAGGAACCCCAGAGTCCCCAGCC-3'為引物進(jìn)行巢式擴(kuò)增，反應(yīng)程序同1.2.4，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，再挑選陽(yáng)性克隆菌株送生物公司測(cè)序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 將上述獲得的序列用Vector NTI軟件進(jìn)行比對(duì)拼接，得到大口黑鱸兩亞種NPY基因的DNA序列，序列同源性分析采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST程序。使用Matlnspector在線軟件對(duì)啟動(dòng)子上的調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用MEGA 5.0軟件采用NJ法構(gòu)建NPY的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 腦組織總RNA的提取

將從大口黑鱸兩亞種腦部中提取的總RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）顯示28S、18S rRNA條帶完整，濃度比約為2∶1，說(shuō)明提取的總RNA完整性較好，符合RT-PCR和RACE-PCR擴(kuò)增要求。

圖1 大口黑鱸腦部總RNA

2.2 NPY基因cDNA的克隆和序列分析

將擴(kuò)增獲得核心序列與3'端非編碼區(qū)片段經(jīng)Vector NTI軟件比對(duì)拼接后，分析得到大口黑鱸兩亞種NPY的cDNA序列，結(jié)果（圖2）表明兩亞種NPY cDNA均包括ORF框和長(zhǎng)52 bp的5'非編碼區(qū)（5'-UTR）以及一個(gè)3'非編碼區(qū)（3'-UTR）；分析發(fā)現(xiàn)大口黑鱸兩亞種NPY基因ORF框序列完全相同，長(zhǎng)300 bp，編碼99個(gè)氨基酸，即prepro-NPY。經(jīng)在線軟件預(yù)測(cè)，NPY前體包括28個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽、36個(gè)氨基酸組成的成熟 NPY以及 32個(gè)氨基酸組成的由 Gly-Lys-Arg指示的 NPY C 端肽。cDNA序列中沒(méi)發(fā)現(xiàn)加尾信號(hào)（AATAAA），但在距3'-UTR末端13 bp處發(fā)現(xiàn)一段序列ATTAAA。

2.3 大口黑鱸NPY基因cDNA與其他物種的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析

NPY基因的保守性較高，大口黑鱸NPY cDNA與GenBank中其他動(dòng)物的NPY cDNA相比，Blast結(jié)果（表1）顯示與鱖魚和石斑魚NPY基因cDNA核苷酸同源性最高，達(dá)90%和88%，氨基酸同源性分別為93%和95%，與其他魚類NPY基因cDNA的同源性為77%-87%，氨基酸的同源性為63%-96%，與兩棲類非洲爪蟾的核苷酸同源性為76%，氨基酸同源性為58%，與哺乳動(dòng)物（人、鼠、豬、雞、 綿羊、家牛、獼猴）核苷酸同源性達(dá)72%-79%，氨基酸同源性為63%-66%。

根據(jù)大口黑鱸NPY基因的ORF框序列推測(cè)的氨基酸序列與其他物種NPY基因編碼的氨基酸序列，利用Mega5.0軟件以NJ法構(gòu)建氨基酸進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3）顯示，這20個(gè)不同物種分成兩個(gè)大的分支，一支為魚類；另一支為哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物。大口黑鱸在魚類分支中，與同為鱸形目的青鳉魚和花鱸緊密結(jié)合為一個(gè)分支，進(jìn)化樹顯示與歐洲狼鱸的親緣關(guān)系也較近，這與傳統(tǒng)分類學(xué)的觀點(diǎn)相符。

圖2 大口黑鱸NPY基因cDNA序列及氨基酸序列

表1 大口黑鱸NPY基因與其他動(dòng)物NPY基因同源性比較

2.4 大口黑鱸兩亞種NPY基因的序列分析及差異比較

根據(jù)所獲得的大口黑鱸NPY基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增NPY基因的內(nèi)含子，拼接得到大口黑鱸兩亞種NPY基因的DNA序列（GenBank登錄號(hào)分別為KR914669和KR914670），結(jié)果（圖4）顯示大口黑鱸兩亞種NPY基因包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。內(nèi)含子均以GT開始，以AG結(jié)束，符合內(nèi)含子組成的GT-AG法則，其內(nèi)含子位置與鱖魚、花鱸等非常相似。與其他脊椎動(dòng)物一樣，大口黑鱸NPY基因的第2個(gè)內(nèi)含子較長(zhǎng)，第3個(gè)內(nèi)含子較短（圖5）。大口黑鱸第1個(gè)外顯子為一個(gè)5'非編碼區(qū)（5'-

UTR）。第2個(gè)外顯子編碼一個(gè)完整的信號(hào)肽和大部分的NPY主體。第3個(gè)外顯子包含指示NPY C端肽的G-K-R氨基酸和C-末端將在加工階段被剪切的氨基酸殘基。第4個(gè)外顯子包擴(kuò)編碼6個(gè)屬于C側(cè)翼肽段的氨基酸殘基的片段以及3'非編碼區(qū)（3'-UTR）。大口黑鱸兩亞種NPY基因的各外顯子和內(nèi)含子雖然長(zhǎng)度相等，但測(cè)序結(jié)果表明兩亞種NPY序列間存在一定的差異，北方亞種NPY基因第一個(gè)內(nèi)含子的69 bp處為堿基G，第2內(nèi)含子的325 bp處為堿基G，3'非編碼區(qū)85 bp處為堿基A，而佛羅里達(dá)亞種NPY基因?qū)?yīng)位置堿基分別為C、A和C。

2.5 大口黑鱸兩亞種NPY基因5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)的分析根據(jù)特異引物NPYGSP1和NPYGSP2，采用Genome Walker技術(shù)擴(kuò)增了大口黑鱸兩亞種NPY基因5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)，測(cè)序結(jié)果顯示獲得北方亞種5'端片段1 394 bp，獲得佛羅里達(dá)亞種5'端片段1 398 bp，其中佛羅里達(dá)亞種在距啟動(dòng)子上游814 bp處為堿基T，距啟動(dòng)子上游711 bp處為堿基C，距啟動(dòng)子上游184 bp處為堿基T，而北方亞種對(duì)應(yīng)位置堿基分別為C、T和A；另外，南方亞種距啟動(dòng)子上游174 bp處其后有一GTTT的片段，而北方亞種對(duì)應(yīng)位置則缺失該片段（圖6）。

圖3 依據(jù)不同動(dòng)物NPY氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

圖4 大口黑鱸NPY基因結(jié)構(gòu)示意圖

克隆得到的兩亞種NPY基因的啟動(dòng)子經(jīng)在線軟件分析，結(jié)果（圖5）表明存在的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件有TATA框、AP-1（肌動(dòng)蛋白）、CCAAT框、GATA框（GATA結(jié)合蛋白）、CCAAT蛋白增強(qiáng)因子、八聚體結(jié)合因子-1（Oct-1）。另外，在大口黑鱸5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)還發(fā)現(xiàn)了cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding，CREB），兩個(gè)與瘦素基因有關(guān)元件（STAT binding site）及5個(gè)糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄元件（GRE）。

3 討論

本研究首次報(bào)道了大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種NPY的DNA序列，實(shí)驗(yàn)獲得3 561 bp大口黑鱸北方亞種NPY基因的DNA序列和3 565 bp佛羅里達(dá)亞種NPY基因的DNA序列；同時(shí)克隆獲得了大口黑鱸兩亞種NPY基因的cDNA序列。序列分析表明兩cDNA所編碼氨基酸完全一樣，這與NPY基因的結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中的高度保守性相符；此外，Blomqvist等［15］研究表明，金魚與大鼠的蛋白質(zhì)序列有3個(gè)氨基酸不同，電鰻與大鼠的蛋白質(zhì)序列有5個(gè)氨基酸不同，人與鯊魚亦只有3個(gè)氨基酸不同；因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中大口黑鱸兩亞種NPY編碼氨基酸序列完全一致符合該基因氨基酸序列組成特性。與其他物種NPY基因的結(jié)構(gòu)相同，大口黑鱸NPY基因也含有4個(gè)外顯子以及3個(gè)內(nèi)含子，且起始密碼子在外顯子2上。

圖5 大口黑鱸北方亞種NPY基因序列

NPY與Y肽（PYY）、胰多肽（PY）序列最大的差別在于它們成熟肽中的第14個(gè)氨基酸殘基。研究表明除鱒魚的NPY成熟肽中第14個(gè)是蘇氨酸殘基外，其余都是丙氨酸殘基；而PYY和YY一般都是脯氨酸殘基［16，17］；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大口黑鱸兩亞種NPY成熟肽中第14個(gè)為丙氨酸殘基。另外，大口黑鱸兩亞種NPY基因第2個(gè)內(nèi)含子（1 166 bp）與第3個(gè)內(nèi)含子（78 bp）長(zhǎng)度之比為14，鱖魚NPY基因的該比值也為14，石斑魚、青鳉魚、大黃魚、斑馬宮麗魚等其他鱸形目的魚該比值也均在4.5-11之間，而在斑馬魚和脊椎動(dòng)物的NPY基因第2個(gè)內(nèi)含子與第3個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度之比一般小于4［12］，提示了大口黑鱸NPY基因的結(jié)構(gòu)與鱖魚最為接近，這同它們都是鱸形目魚類相符，同時(shí)也說(shuō)明了大口黑鱸NPY的結(jié)構(gòu)與斑馬魚或人類的不同。

圖6 大口黑鱸兩亞種NPY基因啟動(dòng)子序列差異比較

瘦素是一種肽類激素，作為一種飽食信號(hào)，可抑制下丘腦弓狀核中NPY基因的表達(dá)［18，19］，從而引起食欲減退；在大鼠NPY序列中，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與瘦素基因有關(guān)序列（STAT binding site-like element），研究證實(shí)這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)樣組件對(duì)小鼠NPY基因調(diào)控瘦素的翻譯與表達(dá)、以及神經(jīng)中樞的調(diào)控例如食物的吸收具有關(guān)鍵作用［20，21］。我們?cè)诖罂诤邝|兩亞種NPY基因的5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)找到了3個(gè)瘦素起始結(jié)合位點(diǎn)STAT，說(shuō)明瘦素基因可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)大口黑鱸NPY基因的表達(dá)。研究表明，在虹鱒的視前區(qū)［22］，皮質(zhì)醇對(duì)CRF及NPY mRNA的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用，而CRF mRNA的表達(dá)也受到促糖皮質(zhì)激素受體的調(diào)節(jié)［23］；我們?cè)诖罂诤邝|NPY的5'側(cè)翼找到5個(gè)糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄元件GRE，說(shuō)明通過(guò)GRE，糖皮質(zhì)激素可直接介導(dǎo)NPY的轉(zhuǎn)錄，揭示了糖皮質(zhì)激素對(duì)NPY mRNA的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)在大口黑鱸兩亞種5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)瘦素表達(dá)相關(guān)元件及5個(gè)糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄元件，進(jìn)一步證明了通過(guò)瘦素及皮質(zhì)醇對(duì)下丘腦NPY基因的調(diào)控可介導(dǎo)魚類的食欲。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大口黑鱸兩亞種NPY基因序列間存在一定的差異。差異位點(diǎn)處均不直接編碼氨基酸，但有可能通過(guò)調(diào)控基因的前期轉(zhuǎn)錄而影響其在兩亞種中的表達(dá)量。北方亞種啟動(dòng)子1 224 bp處存在一個(gè)八聚體結(jié)合因子，而佛羅里達(dá)亞種該處由于多出一個(gè)GTTT的片段，形成了一段叉頭蛋白區(qū)域，叉頭蛋白在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、糖類和脂類代謝、生物老化和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用［24］，因此推測(cè)大口黑鱸兩亞種間NPY基因啟動(dòng)子的該位置突變可能影響到兩亞種對(duì)于人工飼料的攝食以及利用；大口黑鱸佛羅里達(dá)亞種相對(duì)于北方亞種更易受外界環(huán)境影響，表現(xiàn)出攝食行為較為謹(jǐn)慎，易受驚嚇等，推測(cè)可能是由于兩亞種序列上的部分差異對(duì)NPY基因表達(dá)量的影響所致。另外，兩亞種間NPY基因啟動(dòng)子上長(zhǎng)度為4 bp的插入缺失部分經(jīng)擴(kuò)大群體驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)只存在于種間，種內(nèi)不具多態(tài)性，因此該片段的插入缺失具有作為鑒別大口黑鱸兩亞種的分子標(biāo)記的潛在價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆了大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種NPY基因的cDNA序列；并在此基礎(chǔ)上，結(jié)合基因組步移技術(shù)獲得了長(zhǎng)度分別為3 561 bp和3 565 bp的大口黑鱸北方亞種和佛羅里達(dá)亞種NPY基因的DNA序列。序列分析表明大口黑鱸兩亞種NPY基因都有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，兩亞種NPY 的DNA序列間存在6處單個(gè)堿基差異，與大口黑鱸北方亞種相比佛羅里達(dá)亞種啟動(dòng)子區(qū)域出現(xiàn)了一段長(zhǎng)4 bp的插入。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Analysis of DNA and cDNA Sequence in NPY Gene of Northe rn and Florida Subspecies of Largemouth Bass

LIU Hao1，2BAI Jun-jie1LI Sheng-jie1
（1. Pearl River Fisheries Research Institute，CAFS/Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510380；2. College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Neuropeptide Y（NPY）plays an important role in the activity of body feeding，and is the most potent endogenic orexigenic factor in mammals. In order to understand the structure and the function of NPY gene in the largemouth bass（Micropterus salmoide），the NPY’s cDNA of northern and Florida subspecies of largemouth bass were cloned by RT-PCR and RACE techniques. The result revealed that the NPY’s cDNA in two subspecies all contained an ORF encoding 99 amino acids and 5′-UTR of 52 bp. Using PCR and genomewalker technology，a 3 561 bp and a 3 565 bp DNA sequence of of NPY gene were acquired from northern and Florida subspecies of largemouth bass respectively. Sequence analysis indicated that gene from both subspecies contained 4 exons and 3 introns. By bioinformatics analysis with MATINSPECTOR，the basic transcriptional regulatory elements such as TATA Box，CAAT Box，CCAAT Box，and GATA Box were found in the promoters of both subspecies. Six single-site base differences between the two genomic NPY DNA sequences of 2 subspecies were discovered，4-base insert segments were identified in promoter sequence of Florida subspecies compared with the northern one. The homology of NPY genes with other species was also compared，the largemouth bass shared the highest nu cleotide homology with mandarin fish and grouper，reached 90% and 88% respectively，and the amino acid homology were 93% and 95%.

largemouth bass；subspecies；appetite；NPY gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.013

2015-07-28

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD26B03），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201985），“948”計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011-G12）

劉浩，男，碩士研究生，研究方向：水生生物遺傳育種；E-mail：liuhaoshuichan@163.com

白俊杰，男，研究員，研究方向：水產(chǎn)生物技術(shù)與魚類遺傳育種；E-mail：jjbai@163.net