玉米芯半纖維素水解液中抑制物對丁醇發(fā)酵的影響

顧春凱王根宇劉宏娟王革華吳劍榮張建安

（1. 江南大學生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2. 清華大學核能與新能源技術研究院，北京 100084）

玉米芯半纖維素水解液中抑制物對丁醇發(fā)酵的影響

顧春凱1，2王根宇2劉宏娟2王革華2吳劍榮1張建安2

（1. 江南大學生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2. 清華大學核能與新能源技術研究院，北京 100084）

半纖維素水解液抑制物對微生物細胞的毒性限制了其在丁醇發(fā)酵中的應用，旨在探討其對產丁醇共生體系TSH06的抑制作用并為其應用于丁醇發(fā)酵奠定基礎。通過稀酸水解半纖維素制得水解液，采用P2培養(yǎng)基稀釋的半纖維素水解液為底物，分別利用NaOH和氨水調節(jié)培養(yǎng)基pH值，結合實時熒光定量PCR方法來研究水解液對產丁醇共生體系TSH06的抑制作用。以NaOH調節(jié)pH抑制菌體的生長，氨水調節(jié)pH菌體可生長發(fā)酵。產丁醇菌株TSH06可以在50%稀釋度以下的水解液中發(fā)酵生長，并且能夠耐受并降解抑制物糠醛與5-羥甲基糠醛，最終丁醇產量達到4.16-5.16 g/L，低于P2培養(yǎng)基中的丁醇產量（8.83 g/L）。稀釋水解液中，48 h之后乙酸濃度在3.18-4.16 g/L，遠大于P2培養(yǎng)基中的乙酸濃度（低于2 g/L）。相對于P2培養(yǎng)基，在50%水解液中培養(yǎng)的TSH06有機酸生成途徑關鍵基因的基因轉錄水平明顯提高，而有機酸返耗途徑以及丁醇生成途徑的關鍵基因的基因轉錄水平則明顯下降。水解液中過多的乙酸抑制了產酸期到產溶劑期的轉化，而酸的累積使得菌體在底物被完全消耗之前就趨于衰退死亡，從而造成丁醇產量的降低與底物的不完全利用。

半纖維素水解液；抑制物；丁醇發(fā)酵；代謝相關基因

全球能源危機和環(huán)境惡化引起了對可再生生物能源的研究熱潮，生物丁醇具有熱值高、蒸汽壓力低、與汽油配伍性好、腐蝕性較小，可以直接應用于發(fā)動機而無需對發(fā)動機進行改造等優(yōu)點，不僅是理想的可再生生物能源，而且是優(yōu)良的有機溶劑、重要的化工原料，被廣泛應用于化工、塑料、有機合成、油漆等工業(yè)［1-3］。傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵以糧食作物如玉米作為主要原料，存在“與人爭糧”的問題，采用糖蜜、木薯作為生產原料可以避免上述問題，但是其來源有限，同時還受季節(jié)的限制，這些都嚴重影響了丁醇工業(yè)化規(guī)模生產。

木質纖維素生物質原料來源豐富，成本低廉，它主要包括纖維素、半纖維素和木質素［4，5］。纖維素是D-葡萄糖基以β-糖苷鍵聯(lián)結而成的鏈狀高分子化合物，半纖維素是無定型的生物高聚物，它們含有六碳糖與五碳糖等不同糖基［6］，通過氫鍵與纖維素的微纖絲結合，形成細胞壁骨架的網絡結構［7，8］。纖維素和半纖維素經過酸水解處理可降解為能發(fā)酵的戊糖和己糖，但同時又會產生乙酸、糠醛，5-羥甲基糠醛等抑制物［9，10］，這些抑制物的存在對微生物發(fā)酵丁醇有抑制作用，所以必須對其進行脫毒處理［11-14］，但同時這又會增加成本。單獨抑制物的存在，如糠醛類物質在丙酮丁醇發(fā)酵中對菌體生長并不一定起到抑制作用［15，16］。但是，單獨的一種抑制物并不能代表水解液，在水解液的應用中，也很難把各種抑制物分開。因此，本研究以自行篩選獲得的產丁醇共生體系TSH06（包括丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum TSH1，芽孢桿菌Bacillus sp.TSH1）［17］為丁醇發(fā)酵菌株，利用酸水解處理的玉米芯半纖維素水解液為底物，探討水解液中抑制物對丁醇發(fā)酵的抑制作用，旨在為利用半纖維素水解液發(fā)酵丁醇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米芯半纖維素水解液的制備 粉碎的玉米芯與稀酸溶液，其中混合酸：0.5%（M/V）H2SO4，1.5%（M/V）H3PO4）以1∶3（M/V）的比例進行混合，高溫高壓（130℃）處理1 h，對所有固形物進行擠壓抽濾，抽濾的同時加入稀酸溶液兩倍體積的去離子水即得半纖維素水解液。水解液中糖濃度為：葡萄糖5 g/L，木糖30 g/L。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基 菌種：產丁醇共生體系TSH06，由本室分離并保存。種子培養(yǎng)基：玉米醪（6%）煮沸15 min，115℃滅菌15 min。P2培養(yǎng)基：按照水解液中糖的成分配制；葡萄糖 5.6 g/L，木糖 30.1 g/L，酵母粉 1 g/L。115℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：將玉米芯半纖維素水解液與糖含量相同的P2培養(yǎng)基以不同比例混合，使其總糖達到35 g/L，pH調至7.0，115℃滅菌15 min。營養(yǎng)液1：MgSO420 g/L，MnSO41 g/L，FeSO41 g/L，NaCl 1 g/L，對氨基苯甲酸 0.1 g/L，硫胺素 0.1 g/L，生物素 0.001 g/L。營養(yǎng)液2：KH2PO450 g/L，K2HPO450 g/L，CH3COONH4220 g/L。

1.2 方法

1.2.1 玉米芯半纖維素水解液的稀釋 對上述水解液按照表 1所示比例進行不同程度的稀釋，水解液的含量分別為35%-60%。

表1 玉米芯半纖維素水解液不同稀釋濃度

1.2.2 培養(yǎng)基pH的調節(jié) 用氨水或NaOH溶液調節(jié)pH至7.0，裝入100 mL搖瓶，裝液量為60 mL，115℃滅菌15 min。對每一稀釋度的水解液做3個平行實驗。

1.2.3 培養(yǎng)方法 種子復蘇：甘油凍存的菌株TSH06接種于玉米培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至氣泡產出。種子培養(yǎng)：將種子液 以7%的接種量接種于100 mL三角瓶（裝液量60 mL）的P2培養(yǎng)基中，并添加裝液量1%的溶液1與溶液2，37℃靜置培養(yǎng)至產生均勻氣泡。發(fā)酵玉米芯半纖維素水解液：將TSH06種子液以7%的接種量接種于100 mL三角瓶（裝液量60 mL）的玉米芯半纖維素水解液與P2培養(yǎng)基對照組中，并添加1%的溶液1與溶液2，37℃靜置培養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)基中Na+與的添加 P2培養(yǎng)基中已加入裝液量1%的溶液1與溶液2，故培養(yǎng)基中含有0.17 mmol/L的NaCl以及28.54 mmol/L CH3COONH4，以普通P2培養(yǎng)基為對照，向已加入1%的溶液1與溶液2的P2培養(yǎng)基中分別添加NaCl以及NH4Cl至如下濃度（表2）。

表2 P2培養(yǎng)基中Na+與NH濃度

表2 P2培養(yǎng)基中Na+與NH濃度

培養(yǎng)基 濃度Na+濃度/（mmol·L-1） NH4+濃度/（mmol·L-）P2 0.17 28.54 P2+NH4Cl 0.17 57.08 P2+NH4Cl 0.17 114.16 P2+NH4Cl 0.17 228.32 P2+NaCl 0.34 28.54 P2+NaCl 0.68 28.54 P2+NaCl 1.36 28.5

1.2.5 菌體RNA的提取以及實時熒光定量（real time）PCR 分析 分別提取TSH06接種P2培養(yǎng)基和50%水解液培養(yǎng)基24 h后的菌體總RNA（Kit名稱，OMEGA），電泳檢測樣品完整性，并測定樣品濃度，RNA反轉錄生成 cDNA補充反轉錄體系。采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）進行real time PCR，反應體系為20 μL，包括：2×SYBR Premix Ex Taq II 10 μL；引物×2（10 μmol/L）0.8 μL；cDNA模板（＜100 ng）；無菌蒸餾水補齊至20 μL。采用三步法進行反應：95℃預變性1 min；95℃變性10 s，50℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。每個樣品做3個平行。熒光定量PCR采用相對定量方法中的2-△△Ct，其中△△Ct=（待測組目的基因平均Ct值 - 待測組管家基因平均Ct值）-（對照組目的基因平均Ct值 - 對照組管家基因平均Ct值），以16S RNA基因作為內參，計算mRNA的轉錄水平。

1.2.6 分析方法 溶劑（乙醇、丙酮、丁醇）測定方法：采用氣相色譜儀（GC，島津公司2010）進樣檢測。根據氣相色面積信息對溶劑進行定性和定量分析。糖類、有機酸及抑制物的測定方法：采用高效液相色譜法（HPLC，島津公司LC-20A）測定，根據液相色譜保留時間和峰面積信息對糖類、有機酸及抑制物進行定性和定量分析［18］。生物量測定方法：生物量測定采用比濁法［19］，采用分光光度計在600 nm 處測定其OD600值。

表3 R-eal time PCR引物

2 結果

2.1 不同pH調節(jié)物質對TSH06在玉米芯半纖維素水解液生長 的影響

酸處理的玉米芯半纖維素水解液中葡萄糖濃度為5.6 g/L，木糖濃度30.1 g/L，根據這一比例配制P2培養(yǎng)基，并以此P2培養(yǎng)基對水解液進行稀釋，對50%稀釋度的水 解液分別利用NaOH和氨水進行pH的調節(jié)，接種TSH06。結果（表 4）表明，利用NaOH進行pH調節(jié)的水解液在發(fā)酵過程中并未出現菌體生長和發(fā)酵產氣的現象，葡萄糖和木糖沒有消耗。利用氨水進行pH調節(jié)的水解液中，出現了發(fā)酵液大量產氣的現象，葡萄糖與木糖都有一定程度的消耗，發(fā)酵產生了丁醇。

表4 不同pH調節(jié)物質對發(fā)酵的影響

2.2 P2培養(yǎng)基中Na+與濃度對TSH06生長情況的影響

為探究培養(yǎng)基中Na+與濃度對TSH06生長的影響，在向已加入1%的溶液1與溶液2的P2培養(yǎng)基中分別添加NaCl 以及NH4Cl。TSH06生長情況，如圖1所示。

圖1 P2培養(yǎng)基中Na+與NH濃度對TSH06生長情況的影響

以半合成培養(yǎng)基P2作為對照，在整個培養(yǎng)過程中，添加有NaCl的P2培養(yǎng)基中OD600值變化很小，也沒有出現產氣的現象，證明兩倍于普通P2培養(yǎng)基中Na+濃度，即濃度達到0.34 mmol/L已經對TSH06的生長產生了抑制作用。而添加有NH4Cl的P2培養(yǎng)基中，雖然對數生長期TSH06的生長情況相對于普通P2培養(yǎng)基中差異不大，但當菌株生長達到穩(wěn)定期以及衰亡期時，其生物量都大于普通P2培養(yǎng)基中的生物量，證明的加入對TSH06的生長在一定程度上起到了一定促進作用。

2.3 TSH06對稀釋玉米芯半纖維素水解液中抑制物的耐受程度

為探究TSH06對水解液中抑制物的耐受濃度，將水解液與相同糖濃度P2培養(yǎng)基以稀釋比分別為10∶0、6∶4、5∶5進行混合稀釋，得到100%、60%、50%的水解液培養(yǎng)基。初始玉米芯半纖維素水解液中糖類與抑制物濃度如表5所示。在100%與60%的水解液中，接種后48 h都沒有出現菌體生長且產氣的現象，也沒有糖的消耗與丁醇等溶劑的產生，而在50%及以下的水解液中，菌株能夠生長發(fā)酵丁醇。

表5 玉米芯半纖維素水解液原料的底物及抑制物濃度

2.4 TSH06在稀釋玉米芯半纖維素水解液中的丁醇發(fā)酵過程

由于抑制物的毒性，使得產丁醇菌株不能直接利用半纖維素水解液，脫毒處理去除抑制物后可以進行丁醇發(fā)酵，但會增加脫毒成本。因此，本實驗利用相同糖濃度的P2培養(yǎng)基與水解液按一定比例混合，得到35%-50%的水解液培養(yǎng)基，探討以部分水解液作為底物的可行性。通過氨水調節(jié)pH，以P2培養(yǎng)基作對照，接種TSH06進行發(fā)酵，發(fā)酵結束后測得各種產物的濃度及丁醇得率（表6），TSH06在P2培養(yǎng)基和各種稀釋水解液中，均能生長發(fā)酵，并產生乙醇、丙酮、丁醇（圖2）。在相同糖濃度的P2發(fā)酵液中，糖幾乎完全被消耗，丁醇濃度達8.84 g/L，在35%-50%稀釋水解液中，糖均有10 g以上的剩余，丁醇產量有不同程度降低。在35%的水解液中（圖2-B），丁醇濃度為5.17 g/L，在40%-50%的水解液中，丁醇濃度為4.2 g/L左右（圖2-C，2-D，2-E），而水解液中乙醇與丙酮產量與P2培養(yǎng)基對照中的差別不大。到48 h，P2發(fā)酵液中丁醇達4 g/L左右，之后在72 h達到最大（圖2-A）。而在35%-45%的稀釋水解液中，48 h丁醇濃度也達4 g/L，之后略有升高，但變化不大；在50%的稀釋水解液中，48 h丁醇濃度為2.74 g/L，之后繼續(xù)升高，在72 h達到最大值4.22 g/L。

在P2發(fā)酵液中，乙酸和丁酸的濃度在發(fā)酵開始后升高，48 h達到最高，乙酸、丁酸分別為1.61 g/L、1.44 g/L；到發(fā)酵結束，略有下降，乙酸、丁酸分別為1.40 g/L，1.26 g/L（圖2-A）。從生長曲線看（圖 3），在對數生長期，P2培養(yǎng)基與稀釋水解液中TSH06的生長情況差異不大，在24 h的稀釋水解液培養(yǎng)中沒有檢測糠醛和5-羥甲基糠醛（圖2），說明稀釋后水解液中的少量糠醛和5-羥甲基并未抑制菌體本身的生長。得到稀釋水解液TSH06生長過程中所達到的最大的生物量均低于P2培養(yǎng)基中的水平，在菌株生長進入衰亡期后，水解液中TSH06的衰亡速率明顯快于P2培養(yǎng)基，至發(fā)酵結束，最終生物量也低于P2培養(yǎng)基中的水平。

表6 溶劑濃度、丁醇得率及有機酸濃度峰值

圖2 P2培養(yǎng)基及35%-50%水解液發(fā)酵生產丁醇

圖3 P2培養(yǎng)基及35%-50%水解液中TSH06生長曲線

稀釋水解液中，乙酸起始濃度在1-2 g/L之間，之后隨著產酸期的進行，乙酸濃度繼續(xù)升高，達 4 g/L左右，遠高于P2中乙酸的濃度（圖 4）。在35%-45%的稀釋水解液中，48 h乙酸以及丁酸濃度幾乎達最大，之后略有波動，變化不大。在50%的稀釋水解液中，48 h乙酸濃度為4.16 g/L，丁醇濃度2.45 g/L，之后乙酸濃度下降，丁醇濃度上升，到72 h，乙酸、丁醇濃度分別為3.86 g/L、4.22 g/L。發(fā)酵結束時，各稀釋水解液中乙酸濃度相似，為P2中乙酸濃度的2.34-2.58倍（圖4，圖5）。在稀釋水解液中，丁酸濃度在48 h達最大，之后略有降低，至發(fā)酵結束，仍較P2發(fā)酵液高42%-78%（圖5）。

圖4 不同培養(yǎng)基中乙酸濃度

圖5 發(fā)酵結束時不同培養(yǎng)基中丁醇濃度以及發(fā)酵過程中乙酸與丁酸濃度峰值

2.5 發(fā)酵過程中關鍵基因的轉錄情況

為了探討抑制物對關鍵酶基因表達的影響，通過real time PCR，檢測發(fā)酵代謝通路中，乙酸生成的關鍵酶磷酸乙酰轉移酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ack）、丁酸生成的關鍵酶基因磷酸丁酰轉移酶基因（ptb）和丁酸激酶基因（buk）、酸返耗的關鍵酶CoA轉移酶基因（ctf）和3個丁醇生成的關鍵酶醇脫氫酶基因（adhE、bdhA和bdhB）的mRNA表達水平。選取以稀釋度最高的50%的稀釋水解液為研究對象，以P2培養(yǎng)基為對照，取24 h發(fā)酵液，進行分析。結果（圖6）表明，丁酸生成途徑的關鍵酶基因buk和ptb的mRNA在水解液中水平分別為P2培養(yǎng)基的1.12和1.45倍；而在乙酸生成途徑中，pta和ack mRNA在水解液中為P2培養(yǎng)基的1.75和7.45倍；同時水解液中，丁酸、乙酸向丁酰輔酶A以及乙酰輔酶A轉化的關鍵基因ctf mRNA只有P2培養(yǎng)基的0.21倍。而TSH06乙醇、丁醇生成途徑的adhE、bhdA、bdhB的mRNA水平分別是在P2培養(yǎng)基中的0.09、0.83及0.44倍。這些結果表明乙酸、丁酸合成途徑關鍵酶表達水平上升，而返耗途徑關鍵酶表達受到抑制，這種變化導致了乙酸、丁酸的積累。丁醇和乙醇生成途徑關鍵酶基因表達水平的下降，導致丁醇合成受阻，使得最終水解液中丁醇產量降低。

3 討論

本研究通過用用氨水或NaOH溶液調節(jié)培養(yǎng)基pH發(fā)現，培養(yǎng)基中添加Na+會抑制TSH06的生長，而用氨水調節(jié)pH可為菌株的生長提供氮源，有利于菌株的生長。

TSH06在體積比等于或低于50%的酸水解液，抑制物糠醛與5-羥甲基糠醛在接種24 h后可被TSH06代謝，菌株生長并發(fā)酵產丁醇，最終丁醇產量只有P2培養(yǎng)基的一半左右，而乙酸濃度明顯高于P2發(fā)酵液。張杰［20］在以木質纖維素為原料發(fā)酵生產丙酮丁醇的過程以及科學機理研究中說明，丁醇的發(fā)酵分為產酸期和產溶劑期。產酸期主要產物是乙酸和丁酸，隨著酸的累積，pH下降，細胞代謝向產溶劑期轉化，產酸期形成的乙酸和丁酸在CoA轉移酶的作用下，分別生成乙酰CoA和丁酰CoA，又進入代謝通路，參與溶劑的生成，因此，乙酸和丁酸有一個先升高再降低的過程。48 h之前，在P2發(fā)酵液和稀釋水解液中，乙酸都逐漸升高。P2發(fā)酵液的乙酸濃度維持在2 g/L以下；而在稀釋水解液中，乙酸的起始濃度為1.5-2 g/L，在此濃度下，TSH06可以生長進行丁醇發(fā)酵，但乙酸、丁酸的濃度也隨著升高，到48 h時，乙酸達最大為3.78-4.16 g/L以上，大于同類發(fā)酵中乙酸濃度的最高值。Lu等［21］的研究表明，拜氏梭菌在稀釋水解液發(fā)酵過程中乙酸初始濃度在2 g/L以上，最高濃度未超過2.9 g/L。而在48 h時，在35%-45%的水解液中，丁醇濃度也達最大，此時，盡管糖還有15 g/L左右，但也只產生少量或不再產丁醇，糖也只有少量消耗，發(fā)酵結束，糖濃度還有12 g/L以上。在水解液中，糠醛，5-羥甲基糠醛在24 h內已經被代謝消耗完全，不會抑制菌體生長。Qureshi［22］研究發(fā)現，拜氏梭菌在未脫毒水解液發(fā)酵，乙酸初始濃度達到6.5 g/L，發(fā)酵過程中乙酸最高濃度13.3 g/L，菌體丙酮乙醇丁醇總量只有1.7 g/L，幾乎不發(fā)酵，說明高的有機酸濃度，尤其是乙酸濃度可能使菌體受到抑制，發(fā)酵停止。

圖6 50%水解液以及P2培養(yǎng)基中TSH06關鍵基因轉錄水平的對比

由發(fā)酵結果可知，在50%稀釋水解液中，有機酸尤其是乙酸濃度較P2發(fā)酵液顯著提高，而丁醇產量明顯降低（圖3），故通過Real-time PCR，根據Lütke-Eversloh等［23］的研究表明，檢測發(fā)酵代謝通路中，乙酸生成的關鍵酶磷酸乙酰轉移酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ack）、丁酸生成的關鍵酶基因磷酸丁酰轉移酶基因（ptb）和丁酸激酶基因（buk）、酸返耗的關鍵酶CoA轉移酶基因（ctf）和3個丁醇生成的關鍵酶醇脫氫酶基因（adhE、bdhA、bdhB）的mRNA表達水平。選取以稀釋度最高的50%的稀釋水解液為研究對象，以P2培養(yǎng)基為對照，取24 h發(fā)酵液，進行分析。結果顯示，生成乙酸與丁酸途徑的關鍵基因轉錄水平的提高，而返耗途徑的ctf基因轉錄水平的降低，是造成乙酸和丁酸的大量積累的原因。在水解液中，醇生成的關鍵酶基因表達受到影響，進而會影響丁醇的產量。這些結果為TSH06在水解液發(fā)酵中大量產酸，阻滯丁醇發(fā)酵以及菌體生長提供了分子生物學依據。

4 結論

利用含糖培養(yǎng)基對半纖維素水解液進行稀釋，研究了抑制物對產丁醇共生體系TSH06生長發(fā)酵的抑制作用，發(fā)現產 TSH06在60%及以上稀釋度的水解液中不能生長進行丁醇發(fā)酵，合適的稀釋濃度為50%及以下。利用NaOH或氨水調節(jié)稀釋水解液的pH值，菌體的生長存在差異，用NaOH調節(jié)pH值會抑制菌體的生長，而利用氨水調節(jié)pH值有利于菌體生長，且發(fā)酵丁醇。稀釋水解液中的糠醛和5-羥甲基糠醛不會對TSH06產生抑制作用。但是在水解液中生長的產丁醇菌株TSH06相對于P2培養(yǎng)基有機酸生成途徑關鍵基因的轉錄水平明顯提高，有機酸返耗途徑以及丁醇生成途徑關鍵基因的轉錄水平明顯下降，而有機酸尤其是乙酸濃度對TSH06丁醇發(fā)酵有明顯的抑制作用。

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（責任編輯 馬鑫）

Effects of Inhibitors in Corncob Hemicellulose Hydrolysate on Butanol Fermentation

GU Chun-kai1，2WANG Gen-yu2LIU Hong-juan2WANG Ge-hua2WU Jian-rong1ZHANG Jian-an2
（1. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology（Ministry of Education），School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. Institute of Nuclear and New Energy Technology，Tsinghua University，Beijing 100084）

Due to the toxicity of inhibitors in hemicellulose hydrolysate to microorganism，hemicellulose hydrolysate cannot be directly used as substrate for butanol fermentation. The effects of inhibitors to non-anaerobic butanol-producing symbiotic system TSH06 was studied，aiming at laying the foundation for the butanol fermentation using hydrolysate without detoxification. Hemicellulose hydrolysate of corncob diluted with P2 medium was used as substrate in butanol fermentation. The pH of culture media was adjusted to be neutral with NaOH and ammonia respectively. The inhibition effect of the hydrolysate on TSH06 was studied by qPCR with gene primes of key enzymes. Results showed that the existence of Na+inhibited the growth of TSH06. Furthermore，TSH06 grew and fermented in 50% or lower degrees of diluted hemicellulose hydrolysate，tolerated and degraded the furfural and 5-HMF，and the ultimate butanol concentration reached 4.16-5.16 g/L，lower than that in P2 medium（butanol concentration of 8.83 g/L）. In diluted hemicellulose hydrolysate，acetic acid concentration remained above 3.18 to 4.16 g/L after 48 h，much higher than that in P2 medium（＜2 g/L）. Compared with P2 medium，the transcription ratio of key genes in the organic acid production pathway rose significantly while TSH06 in the 50% hemicellulose hydrolysates and declined significantly in the organic acid reflux pathway and butanol production pathway. In conclusion，excessive acetic acid in the hemicellulose hydrolysate might damage cells and block the transition from acidogenesis phase to solventogenesis phase. As the accumulation of acid，bacterial cells tend to decline and death before the substrate is completely consumed，leading to the reduction of butanol production and the substrate is not fully utilized.

hemicellulose hydrolysate；inhibitor；butanol fermentation；metabolism related genes

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.026

2015-09-24

國家自然科學基金項目（21176141），清華大學自主科研項目（2012THZ02289），國家能源局項目（20131448926）

顧春凱，男，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵；E-mail：guchunkai314@163.com

張建安，男，博士，研究方向：生物化工；E-mail：zhangja@tsinghua.edu.cn

吳劍榮，男，博士，研究方向：生化工程；E-mail：kinowu76@163.com