槲皮素對(duì)腎性高血壓大鼠的降壓作用及機(jī)制研究

侯國(guó)軍，秦小江，侯曉敏，趙曉園，趙良淵

槲皮素對(duì)腎性高血壓大鼠的降壓作用及機(jī)制研究

侯國(guó)軍1，秦小江2，侯曉敏2，趙曉園3，趙良淵2

1.武警太原市支隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)(太原 030024)；2.山西醫(yī)科大學(xué)；3.天津大學(xué)

摘要：目的探討槲皮素對(duì)腎性高血壓大鼠的降壓作用及其機(jī)制。方法將30只腎性高血壓大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。空白對(duì)照組：正常喂養(yǎng)；槲皮素組：正常喂養(yǎng)+槲皮素30 mg/(kg·d)；維拉帕米組：正常喂養(yǎng)+維拉帕米30 mg/(kg·d)。喂養(yǎng)8周，每?jī)芍鼙容^一次3組大鼠的血壓；8周后，采用離體微血管環(huán)張力記錄儀，觀察各組大鼠的腎動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)KCl及生理性刺激劑血栓素A2類似物(U-46619)的收縮反應(yīng)，并急性分離大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，采用激光共聚焦觀察各組大鼠的腎動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞對(duì)KCl的反應(yīng)，比較其熒光密度比率。結(jié)果膳食補(bǔ)充槲皮素能夠降低腎性高血壓大鼠的血壓，與空白對(duì)照組相比，血壓下降了(15.9±3.4)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白對(duì)照組相比，槲皮素組的腎動(dòng)脈血管環(huán)，對(duì)60 mmol/L KCl和10-7mol/L U46619的收縮幅度均明顯降低，分別降低了(32.6±4.7)%和(26.8±3.2)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白對(duì)照組相比，槲皮素組的腎動(dòng)脈血管環(huán)平滑肌細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子熒光密度比率下降了(20.4±3.5)% ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論黃酮類化合物槲皮素能降低腎性高血壓大鼠的血壓；其機(jī)制與降低腎動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腎性高血壓；槲皮素；鈣離子；維拉帕米；血管平滑肌細(xì)胞

黃酮類化合物槲皮素廣泛分布于植物中，能夠治療多種疾病，如關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌感染、哮喘、癌癥等[1-4]。有研究報(bào)道，槲皮素能夠舒張離體大鼠的腸系膜動(dòng)脈、主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈[5-7]，可降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[8]，但對(duì)腎性高血壓大鼠的降壓作用卻鮮見報(bào)道。本課題通過(guò)膳食補(bǔ)充槲皮素，觀察槲皮素對(duì)腎性高血壓大鼠的降壓作用，并進(jìn)一步通過(guò)腎動(dòng)脈血管環(huán)和腎動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1藥品與試劑槲皮素(純度≥98%)、血栓素A2類似物(U-46619)、EGTA、HEPES、白蛋白、木瓜蛋白酶、二硫丁四醇、膠原蛋白F、膠原蛋白H：均為Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性腎性高血壓大鼠30只，體重150g～170 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組10只。對(duì)照組給予正常喂養(yǎng)；槲皮素組在正常喂養(yǎng)的前提下，加喂槲皮素30 mg/(kg·d)；維拉帕米組在正常喂養(yǎng)的前提下，加喂維拉帕米30 mg/(kg·d)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器多通道動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)：南京德寶生化器材有限公司；微血管張力記錄儀：丹麥DMT公司；激光共聚焦顯微鏡：日本Olympus公司。

1.4多通道動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量基本實(shí)驗(yàn)程序?qū)⑶逍褷顟B(tài)的大鼠置于加熱箱內(nèi)，將尾部固定于連接裝置上，預(yù)熱10 min后測(cè)量其平均動(dòng)脈壓，連續(xù)測(cè)量3次，取其平均值。

1.5離體腎動(dòng)脈血管環(huán)的制備及實(shí)驗(yàn)程序大鼠麻醉后，放血，迅速取其腎臟，置于4 ℃且氧氣飽和的磷酸緩沖鹽溶液(PSS)中。解剖顯微鏡下鈍性分離其腎動(dòng)脈，找到三級(jí)分支，然后剪成長(zhǎng)度約為2 mm的腎動(dòng)脈血管環(huán)。將血管環(huán)通過(guò)兩根直徑為40 μm的鋼絲固定于微血管張力記錄儀上。浴槽內(nèi)的PSS液維持37 ℃恒溫。調(diào)整腎動(dòng)脈血管環(huán)的前負(fù)荷到80 mmHg，平衡1 h后開始正式試驗(yàn)。用60 mmol/L KCl收縮血管環(huán)達(dá)坪臺(tái)，連續(xù)刺激血管環(huán)3次，當(dāng)3次的收縮幅度相差不超過(guò)10%時(shí)，認(rèn)為血管反應(yīng)良好，選取收縮張力達(dá)到2 mN的腎動(dòng)脈血管環(huán)進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。觀察各組大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)60 mmol/L KCl及10-7mol/L U46619的收縮反應(yīng)[7，9-10]。

1.6大鼠腎動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離過(guò)程用兩步酶解法分離得到大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞。先將腎動(dòng)脈血管環(huán)浸入Ⅰ號(hào)酶解液：低鈣(0.1 mmol/L CaCl2)的HEPES液，含1 mg/mL白蛋白，0.5 mg/mL木瓜蛋白酶和1 mg/mL二硫丁四醇孵育30 min。然后將腎動(dòng)脈血管環(huán)浸入Ⅱ號(hào)酶解液：無(wú)鈣HEPES液，含有1 mg/mL白蛋白，0.5 mg/mL膠原蛋白F和0.5 mg/mL膠原蛋白H，孵育約15 min。用吸管將單個(gè)細(xì)胞從血管環(huán)骨架上輕輕吹打下來(lái)，1 000 r/min離心3 min，分離好的腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞用于激光共聚焦實(shí)驗(yàn)。

將細(xì)胞用Fluo-4-AM染色，測(cè)量加入40 mmol/L KCl 后，3組大鼠腎動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。使用激光共聚焦顯微鏡，首先觀察并記錄靜息狀態(tài)下離體大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，然后用40 mmol/L KCl灌流細(xì)胞，記錄當(dāng)熒光軌跡達(dá)到坪臺(tái)時(shí)的熒光強(qiáng)度。

2結(jié)果

2.1槲皮素對(duì)腎性高血壓大鼠血壓的影響8周內(nèi)，空白對(duì)照組腎性高血壓大鼠的血壓仍在不斷升高，從開始的163 mmHg±3 mmHg升高到194 mmHg±5 mmHg。槲皮素組8周后大鼠的血壓從165 mmHg±5 mmHg降低到163 mmHg±7 mmHg，與空白對(duì)照組相比，8周末的血壓降低了(15.9±3.4)%。維拉帕米組的血壓從164 mmHg±4 mmHg降低到148 mmHg±4 mmHg。詳見圖1。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

圖1槲皮素對(duì)腎性高血壓大鼠血壓的影響

2.2各組大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)KCl和U46619的收縮反應(yīng)60 mmol/L KCl可引起各組腎性高血壓大鼠的腎動(dòng)脈血管環(huán)發(fā)生收縮，其最大收縮幅度：空白對(duì)照組為4.3 mN±0.8 mN，槲皮素組為2.9 mN±0.4 mN，維拉帕米組為2.7 mN±0.6 mN。槲皮素喂養(yǎng)后，明顯降低了60 mmol/L KCl對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)的收縮效果，與空白對(duì)照組相比，其最大收縮幅度下降了(32.6±4.7)%。詳見圖2。

10-7mol/L U46619可引起各組腎性高血壓大鼠的腎動(dòng)脈血管環(huán)發(fā)生收縮，其最大收縮幅度：空白對(duì)照組為4.1 mN±0.3 mN，槲皮素組為3.0 mN±0.5 mN，維拉帕米組為2.6 mN±0.4 mN。槲皮素喂養(yǎng)后，明顯降低了10-7mol/L U46619對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)的收縮效果，與空白對(duì)照組相比，其最大收縮幅度下降了(26.8±3.2)%。詳見圖3。

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05。

圖2KCl對(duì)各組腎性高血壓大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)的收縮效果

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05。

圖3U46619對(duì)各組腎性高血壓大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)的收縮效果

2.3加入KCl后各組大鼠腎動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子熒光密度靜息狀態(tài)下，各組大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度接近。當(dāng)用40 mmol/L KCl灌流細(xì)胞時(shí)，3組大鼠的腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度均發(fā)生一定程度的升高，當(dāng)熒光軌跡達(dá)到坪臺(tái)時(shí)，各組細(xì)胞的熒光密度比率(F/F0)：空白對(duì)照組為2.5±0.1，槲皮素組為2.0±0.2，維拉帕米組為1.5±0.2。與空白對(duì)照組相比，槲皮素組腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的熒光密度比率下降了(20.4±3.5)%。詳見圖4。

注：與空白對(duì)照組相比，*P< 0.05。

圖3各組腎性高血壓大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的

熒光密度比率。

3討論

槲皮素存在于多種水果、蔬菜中，如葡萄、蘋果、沙棘、番茄、洋蔥等，屬于黃酮類化合物。西方人的每日飲食中，大約含有13.82 mg槲皮素[11]。

有研究報(bào)道，槲皮素可以降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[8]，本課題中，給腎性高血壓大鼠膳食補(bǔ)充槲皮素，喂養(yǎng)8周期間，大鼠血壓發(fā)生了一定程度下降，在喂養(yǎng)8周末，與空白對(duì)照組相比，槲皮素組大鼠的血壓下降了(15.9±3.4)%。

為了進(jìn)一步研究其降血壓機(jī)制，本研究觀察了KCl和U46619對(duì)3組大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)的收縮效果，發(fā)現(xiàn)膳食補(bǔ)充槲皮素組大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)這兩種收縮劑的反應(yīng)均發(fā)生了一定程度的下降。KCl使細(xì)胞膜發(fā)生去極化，通過(guò)激活L-型電壓依賴性鈣通道引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，血管收縮[12-13]。U46619為血栓素A2類似物，可引起腎動(dòng)脈血管環(huán)發(fā)生收縮。補(bǔ)充槲皮素后，與空白對(duì)照組相比，60 mmol/L KCl對(duì)腎動(dòng)脈血管環(huán)的收縮幅度下降了(32.6±4.7)%，10-7mol/L U46619對(duì)腎動(dòng)脈血管環(huán)的收縮幅度下降了(26.8±3.2)%。鈣離子通過(guò)L-型電壓依賴性鈣通道進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而引起動(dòng)脈發(fā)生收縮[14]。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)可以反映細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)充槲皮素組的腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，在加入KCl后，其熒光密度比率低于空白對(duì)照組，降低了(20.4±3.5)%。提示膳食補(bǔ)充槲皮素能夠一定程度上降低腎性高血壓大鼠的血壓，其機(jī)制與降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度有關(guān)，為了進(jìn)一步探究其深層次的降壓機(jī)制，今后將采用全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察槲皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上相關(guān)通道電流的影響。

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(本文編輯郭懷印)

通訊作者：趙良淵，E-mail：sxykdxyxy@126.com

中圖分類號(hào)：R544.1R255.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．02．009

文章編號(hào)：1672-1349(2016)02-0137-03

(收稿日期：2015-06-19)