胸腺肽α1對膿毒癥大鼠心肌的保護(hù)作用＊

張　明，林欽漢，陳　軍，溫振杰，劉建凌

?

胸腺肽α1對膿毒癥大鼠心肌的保護(hù)作用＊

張明，林欽漢，陳軍，溫振杰，劉建凌

[摘要]目的探討胸腺肽α1對膿毒癥大鼠心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別是對照組，假手術(shù)組，膿毒癥組及胸腺肽治療組。采用盲腸結(jié)扎穿刺法制造膿毒癥模型，胸腺肽治療組予胸腺肽干預(yù)，其他組予生理鹽水對照。通過心臟彩超觀察大鼠心功能變化，取心肌組織分別檢測各組激活p38分裂原激活的蛋白激酶（p38 MAPK）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（NO）水平，組織切片行HE染色觀察組織形態(tài)。結(jié)果膿毒癥組心肌細(xì)胞磷酸化的p38 MAPK表達(dá)水平較對照組及假手術(shù)組上調(diào)，TNF-α、NO水平增高。胸腺肽α1能抑制膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞磷酸化的p38 MAPK、TNF-α、NO水平的增高，改善心臟EF值。結(jié)論胸腺肽α1可能通過抑制p38 MAPK途徑對膿毒癥心肌損害具有一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]胸腺肽α1；膿毒癥；大鼠；心肌損害

膿毒癥自20世紀(jì)70年代以來一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)，其發(fā)病率、病死率居高不下。膿毒癥導(dǎo)致的心肌損害極其常見、影響巨大，往往直接加重患者病情。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膿毒癥合并心功能障礙使膿毒癥患者病死率由不合并心功能障礙的30％增長到70％，其致病機(jī)制仍未明確，治療、監(jiān)測手段均極其匱乏[1]。

越來越多證據(jù)認(rèn)為，膿毒癥心肌損害的主要致病因素是過度的全身炎癥反應(yīng)造成的炎癥因子的大量釋放，激活p38分裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK），顯著增加腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的表達(dá)，TNF可直接或通過一氧化氮（nitric oxide，NO）間接抑制心肌細(xì)胞功能。因此針對某單一靶點(diǎn)的特異性治療可能很難奏效，免疫調(diào)節(jié)治療可能具有更大優(yōu)勢。胸腺肽α1作為主要的免疫調(diào)節(jié)藥物之一，能降低血清中TNF-α的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，但至今未見該藥物在膿毒癥心肌損害中的相關(guān)研究。該研究主要評估胸腺肽α1對膿毒癥大鼠心肌損害的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1動物分組及模型制作成年雄性SD大鼠40只，體重180～220 g，其來源于廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證：粵SCXK 2013-0002。將其隨機(jī)分為4組，分別是對照組（A組），假手術(shù)組（B組），膿毒癥組（C組）及胸腺肽治療組（D組）。大鼠適應(yīng)環(huán)境后禁食12h。C組及D組大鼠通過盲腸結(jié)扎穿孔法制造膿毒癥模型：采用水合氯醛予大鼠腹腔注射麻醉，在側(cè)腹開切口，暴露部分盲腸，在回盲腸連接處結(jié)扎，用注射器針頭將盲腸刺穿兩次，擠壓盲腸并將盲腸送回腹腔。B組的大鼠開腹后僅把盲腸取出并回納后關(guān)閉腹腔。術(shù)后給予足夠的水及營養(yǎng)支持。D組大鼠皮下注射胸腺肽α1（日達(dá)仙，購自美國賽生藥品公司）每次0.18mg/kg，共2次，A、B、C組皮下注射等劑量生理鹽水作為對照。

1.2心臟超聲檢測心功能開始用藥36h后，將各組大鼠分別水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定、備皮，使用Agilent Sonos 5500型彩色多普勒超聲（美國Philips公司）12 MHZ探頭行心臟彩超，檢測心功能，測定射血分?jǐn)?shù)（EF），左室短軸縮短率（FS）指標(biāo)。

1.3TNF-α、NO和p38 MAPK表達(dá)檢測快速取出心臟用冷生理鹽水沖洗后，取心尖周圍組織約40mg用磷酸鹽緩沖液制備組織勻漿，離心后收集上清。TNF-α和NO含量測定用ELISA法（試劑盒購自南京建成生物工程研究所），嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明；Western blot法測定p38 MAPK表達(dá)：將心肌組織洗滌，加入細(xì)胞裂解液靜置后離心，取上清，經(jīng)SDSPAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。封閉后加入抗p38及磷酸化-（Phosphorylated-，p-）p38抗體（購自Sigma公司），顯色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果，計(jì)算灰度比值，以表示目的蛋白激活相對含量。

1.4形態(tài)學(xué)觀察取出心尖組織，立刻甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)形態(tài)改變。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)方差齊性，方差齊組間多重比較采用LSD法，方差不齊采用Dunnett's T3法，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況A組和B組大鼠一般情況好，精神好，活動多，主動進(jìn)食進(jìn)水，呼吸平穩(wěn)，四足溫暖。C組和D組大鼠精神差，胃口差，呼吸促，C組四足發(fā)紺，懶動更加明顯，3只因?yàn)l臨死亡提前結(jié)束觀察并取材。D組大鼠四足僅輕度發(fā)紺。

2.2心臟超聲檢查結(jié)果各組大鼠心臟超聲結(jié)果提示，A、B兩組EF、FS無明顯差異；C、D組較A組EF值降低，C組EF值顯著低于D組（P=0.041），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C、D組FS值無顯著性差異（P= 0.075），見表1。

表1　各組大鼠心臟超聲結(jié)果（x±s,％）

2.3各組大鼠心肌勻漿的TNF-α和NO含量A組和B組大鼠的TNF-α和NO含量無顯著性差異，C、D組TNF-α和NO含量顯著高于A、B組，C組TNF-α和NO含量顯著高于D組（P值分別為0.032和0.027），見表2。

表2　各組大鼠TNF-α和NO含量變化（±s）

表2　各組大鼠TNF-α和NO含量變化（±s）

注：與A組比較，＊P＜0.05，與C組比較，#P＜0.05

?

2.4p38 MAPK表達(dá)測定C組p-p38/p38灰度值比值（0.72±0.15），顯著高于A組（0.37±0.10）及B組（0.38±0.08），D組灰度比值（0.54±0.12）較C組下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019），見圖1。

圖1　各組p-p38/總p38的灰度比值

2.5各組大鼠心肌形態(tài)學(xué)觀察大鼠光鏡下結(jié)果比較，A、B組大鼠心肌肌纖維結(jié)構(gòu)排列緊密、無水腫、充血及滲出。C組心肌肌纖維結(jié)構(gòu)排列疏松，帶狀空泡化，細(xì)胞核腫脹，間質(zhì)水腫、充血。D組心肌肌纖維結(jié)構(gòu)有點(diǎn)狀空泡化改變、間質(zhì)水腫、充血程度同C組比較明顯減輕，見圖2。

圖2　光鏡下觀察各組心肌組織病理改變

3　討論

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)，是重癥患者主要死亡原因之一，其發(fā)病機(jī)制及治療方法的研究始終是重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。但是，膿毒癥的發(fā)病率和病死率居高不下，全球每年增加的數(shù)百萬膿毒癥患者中，病死者超過25％[2]。尤其是當(dāng)膿毒癥患者出現(xiàn)心肌損害，患者的氧輸送能力進(jìn)一步下降，其病情往往迅速惡化，預(yù)后更差。集束化治療概念的推廣和廣譜抗菌藥物的不斷開發(fā)，未能顯著改善膿毒癥患者的預(yù)后，這是令人失望的事實(shí)。膿毒癥瀑布式的炎癥反應(yīng)，是造成器官損害的直接原因之一，如果能早期阻斷炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，理論上可能保護(hù)重要臟器功能，改善患者預(yù)后。近年來，免疫治療的重要性正逐漸被人認(rèn)識，人們期望通過平衡患者體內(nèi)的抗炎和促炎反應(yīng)水平，提高患者的免疫功能，但至今未取得重要的臨床依據(jù)和廣泛共識[3-5]，仍有待進(jìn)一步探索。

胸腺肽α1是目前主要的免疫調(diào)理藥物之一，臨床上容易獲得，研究基礎(chǔ)扎實(shí)，被認(rèn)為可以較好地調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能[6]，還具有內(nèi)源性調(diào)節(jié)固有免疫和獲得性免疫的作用[7]。近期，管向東等的研究指出，胸腺肽α1在聯(lián)合傳統(tǒng)藥物治療的基礎(chǔ)上，使患者具有更高的mHLA-DR水平，能改善免疫系統(tǒng)功能，對改善臨床預(yù)后可能是有效的[5]。但是，作為重要的損害靶器官，心肌是否能獲益于胸腺肽α1的免疫保護(hù)作用，至今仍無研究涉及。筆者針對這一問題，設(shè)計(jì)了該項(xiàng)隨機(jī)對照的動物實(shí)驗(yàn)，以探討胸腺肽α1對膿毒癥心肌損害的保護(hù)作用。

目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，膿毒癥心肌損害的致病通路是：細(xì)菌的脂多糖成分激活p38 MAPK，使其磷酸化，并協(xié)同核轉(zhuǎn)錄因子κb，顯著增加TNF-α的表達(dá)。TNF-α是至關(guān)重要的炎癥因子。研究表明，心肌組織分布的巨噬細(xì)胞可表達(dá)大量的TNF-α，它可促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放其他炎癥因子誘導(dǎo)心肌炎癥反應(yīng)[8]，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[9]，并可直接導(dǎo)致心肌收縮力下降[10，11]。此外，TNF-α可以誘導(dǎo)NO的表達(dá)，并通過NO依賴途徑對心肌細(xì)胞進(jìn)行損傷[12]。因此，本研究選擇該條通路上的幾個(gè)主要靶點(diǎn)作為標(biāo)志物（p38 MAPK、TNF-α及NO），來衡量胸腺肽α1對該條通路的調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，胸腺肽α1可以抑制p38 MAPK的磷酸化和激活，抑制TNF-α的表達(dá)，且抑制NO的合成。理論上推測，胸腺肽α1可以通過抑制上述通路的炎癥反應(yīng)，對膿毒癥心肌損害起到保護(hù)作用。這一推測，通過心臟彩超檢查及組織病理學(xué)觀察結(jié)果得到證實(shí)。EF值是超聲評估大鼠心功能的首要指標(biāo)[13]，本研究發(fā)現(xiàn)，胸腺肽α1干預(yù)后大鼠心EF值較膿毒癥組明顯提高，大鼠心收縮功能改善。病理觀察也顯示，胸腺肽α1使心肌組織損害程度減輕。總之，本研究初步闡明胸腺肽α1可能通過抑制p38 MAPK途徑對膿毒癥大鼠心肌損害具有一定的保護(hù)作用，希望為臨床應(yīng)用提供理論支持。

參考文獻(xiàn)

[1]杜虹，閆照虹，李璟.膿毒性心肌功能障礙[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，15（3）：538-542.

[2]Dellinger RP，Levy MM，Rhodes A，et al. Surviving sepsis campaign：international guidelines for management of severe sepsis and septic shock，2012[J]. Intensive Care Med，2013，39（2）：165-228.

[3]Alejandria MM，Lansang MA，Dans LF，et al. Intravenous immunoglobulin for treating sepsis，severe sepsis and septic shock[J]. Cochrane Database Syst Rev，2013，9（16）：CD001090.

[4]Karnad DR，Bhadade R，Verma PK，et al. Intravenous administration of ulinastatin（human urinary trypsin inhibitor）in severe sepsis：a multicenter randomized controlled study[J]. Intensive Care Med，2014，40（6）：830-838.

[5]Wu J，Zhou L，Liu J，et al. The efficacy of thymosin alpha 1 for severe sepsis（ETASS）：a multicenter，single-blind，randomized and controlled trial[J]. Crit Care，2013，17（1）：R8.

[6]Shao C，Tian G，Huang Y，et al. Thymosin alpha-1-transformed

Bifidobacterium promotes T cell proliferation and maturation in mice by oral administration[J]. Int Immunopharmacol，2013，15 （3）：646-653.

[7]Pierluigi B，D'Angelo C，F(xiàn)allarino F，et al. Thymosin alpha1：the regulator of regulators[J]. Ann N Y Acad Sci，2010（1194）：1-5.

[8]Padfield GJ，Din JN，Koushiappi E，et al. Cardiovascular effects of tumour necrosis factor α antagonism in patients with acute myocardial infarction：a first in human study[J]. Heart，2013，99（18）：1330-1335.

[9]Saraste A，Pulkki K，Kallajoki M，et al. Apoptosis in human acute myocardial infarction[J]. Circulation，1997，95（2）：320-323.

[10]Grandel U，F(xiàn)ink L，Blum A，et al. Endotoxin-induced myocardial tumor necrosis factor-alpha synthesis depresses contractility of isolated rat hearts：evidence for a role of sphingosine and cyclooxygenase-2-derived thromboxane production[J]. Circulation，2000，102（22）：2758-64.

[11]Asgeri M，Pourafkari L，Kundra A，et al. Dual effects of tumor necrosis factor alpha on myocardial injury following prolonged hypoperfusion of the heart[J]. Immunol Invest，2015，44（1）：23-35.

[12]Schulz R，Panas DL，Catena R，et al. The role of nitric oxide in cardiac depression induced by interleukin-1 beta and tumour necrosis factor-alpha[J]. Br J Pharmacol，1995，114（1）：27-34.

[13]Sabatini CF，O'Sullivan ML，Valcour JE，et al. Effects of injectable anesthetic combinations on left ventricular function and cardiac morphology in Sprague-Dawley rats[J]. J Am Assoc Lab Anim Sci，2013，52（1）：34-43.

[2015-11-10收稿，2015-12-09修回]

[本文編輯：韓仲琪]

醫(yī)學(xué)信息研究

Protective effect of thymosin α1 against myocardial damage in septic rats

ZHANG Ming，LIN Qin-han，CHEN Jun，et al. Department of Intensive Care Unit，Qingyuan People's Hospital，Qingyuan，Guangdong 511500，China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the possible mechanism of the protective effect of thymosin α1 against myocardial damage in septic rats. Methods Forty male rats were randomized into four groups：the control group，sham group，septic group and thymosin group. Cecal ligation and puncture operation were performed on the four groups to establish animal model of sepsis. Echocardiography was performed to evaluate the related indexes of cardiac function. The tissues of myocardium were harvested and the tissular concentration of the activated p38 mitogen-activated protein kinases，tumor necrosis factor-α and nitric oxide were measured. After HE staining，tissue sections were observed to evaluate the change of histomorphology. ResultsThe concentration of the activated p38 mitogen-activated protein kinases，tumor necrosis factor α and nitric oxide in the septic group were higher than that in the control group and sham group. Thymosin α1 attenuated the expression of the activated p38 mitogen-activated protein kinases，tumor necrosis factor α and nitric oxide，and augmented the EF value of hearts. Conclusion Thymosin α1 may prevent myocardial damage from sepsis through inhibiting the p38 MAPK pathway.

[Key words]Thymosin α1；Sepsis；Rat；Myocardial damage

[中圖分類號]R542.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.05.019

[基金項(xiàng)目]廣東省清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015B030）

[作者單位]511500廣東清遠(yuǎn)，清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（張明，林欽漢，陳軍，溫振杰，劉建凌）