柚皮素對缺血再灌注損傷心肌保護作用的機制研究

梅繁勃，王文妍，李冬梅，尹菲菲

柚皮素對缺血再灌注損傷心肌保護作用的機制研究

梅繁勃a，王文妍a，李冬梅b，尹菲菲c*

武警總醫(yī)院a.干一科，b.藥劑科，c.婦產(chǎn)科，北京 100039

[摘要]目的探討柚皮素(NAR)對心肌缺血再灌注(MI/R)損傷的保護作用及其作用機制。方法通過結(jié)扎左冠脈前降支30 min，再灌注120 min，建立MI/R大鼠模型，隨機分為NAR高、中、低劑量組(100、50、25 mg/kg)，假手術(shù)組，模型組，各10只。各組于術(shù)前1周開始腹腔注射給藥，1次/d。再灌注后取血清，采用比色法測定肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性，ELISA法測定腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白介素-1β (IL-1β)水平；取心臟，染色法測定心肌梗死面積；取心肌勻漿，測定髓過氧化物酶(MPO)活力。結(jié)果NAR高劑量組可使心肌梗死面積縮小至32.91%，與模型組(39.78%)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NAR各劑量組血清CK、LDH活性均降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；NAR各劑量組心肌MPO活力均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；NAR高、中劑量均可降低血清TNF-α和IL-1β水平(P<0.05或P<0.01)，低劑量亦可降低血清IL-1β水平(P<0.05)。結(jié)論NAR預(yù)處理可保護MI/R所致心肌損傷，其機制與抑制中性粒細胞浸潤、減少炎性細胞因子的釋放等有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]柚皮素；心肌缺血再灌注損傷；大鼠；中性粒細胞浸潤；炎癥反應(yīng)

0引言

柚皮素(Naringenin，NAR)屬于類黃酮類化合物，廣泛存在于枳實、化橘紅、桃葉、菝葜等植物中，具有多種生物學(xué)活性和重要的藥用價值，如降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等[1-2]，在醫(yī)藥、保健等方面的應(yīng)用前景廣闊。近年研究證實，NAR對心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷的心肌組織具有保護效應(yīng)[3-4]，但機制尚不明確。本研究擬探討NAR保護心肌的作用機制，以期為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2藥品和試劑NAR(純度98%)購自Sigma-Aldrich公司，用1%二甲基亞砜(DMSO)配成所需濃度。氯化硝基四氮唑藍(NBT)、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒、肌酸激酶(CK)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β (IL-1β) ELISA檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1造模參照文獻[5]采用冠脈結(jié)扎法建立MI/R大鼠模型。取大鼠，術(shù)前12 h禁食不禁水，戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定，四肢連接ECG-1350P型十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機。頸部分離氣管，插入氣管插管，連接DW-3000型動物人工呼吸機(呼吸頻率60次/min，潮氣量2 mL/100 g)。順肋間隙方向于胸骨左旁第3、4肋間開胸，分別在第3、4肋上環(huán)繞1根0號手術(shù)線，牽拉手術(shù)線使肋骨撐開，暴露心臟，沿左心耳下緣冠脈前降支起始部3～4 mm處用4-0帶線縫合針穿過，進針深度控制在0.1 cm左右，將一小段直徑1.5 mm的乳膠管置于結(jié)扎線下，收緊結(jié)扎線以造成心肌缺血，約30 min后(冠脈結(jié)扎成功的標(biāo)志：心電圖ST段明顯抬高或T波高聳)，松開結(jié)扎線再灌注120 min (再灌注成功的標(biāo)志：抬高的ST段下降1/2以上或高聳的T波下降)。結(jié)扎前心電圖不正常者，未到觀察終點而死亡者及造模不成功者剔除。

1.3.2分組給藥將成模大鼠隨機分為NAR高、中、低劑量組(100、50、25 mg/kg)[3]及模型組，每組10只。另取10只大鼠，開胸但不結(jié)扎冠脈，作為假手術(shù)組。各組于術(shù)前1周開始腹腔注射給藥，1次/d，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積1% DMSO。

1.3.3檢測血清心肌酶活性和細胞因子水平再灌注結(jié)束后，各組動物由股動脈采血，2 500 r/min離心10 min分離血清，采用比色法測定OD值，計算CK、LDH活性；采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β的表達水平，具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.3.4檢測心肌梗死面積取心臟，用PBS緩沖液洗后，在冠脈結(jié)扎線下，從心尖起將心室平行切成厚度相等的5片，放入0.1% NBT溶液中，37 ℃染色15 min。梗死心肌呈灰白色，正常心肌則呈藍色，圖像采集后，通過軟件ImagePro Plus 7.0測算梗死區(qū)面積和心室總面積，計算心肌梗死面積(%)[6]。

1.3.5檢測心肌MPO活力取部分心臟制成勻漿，3 500 r/min離心10 min得上清，采用比色法測定OD值，并計算MPO活力，具體步驟按試劑盒說明書進行。

2結(jié)果

2.1各組心肌梗死面積比較假手術(shù)組梗死面積為0，未納入統(tǒng)計學(xué)比較；模型組大鼠心肌梗死面積達39.78%，NAR高劑量組心肌梗死面積縮小至32.91%，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1　各組心肌梗死面積比較(n=10)

2.2各組心肌酶活性比較假手術(shù)組大鼠血清CK、LDH活性分別為179.30、596.90 U/L，模型組大鼠血清CK和LDH活性分別升至809.45、2 034.56 U/L，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；NAR高、中、低劑量組血清CK、LDH活性分別降至621.89、650.12、658.03 U/L和1 326.97、1 506.27、1 543.08 U/L，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

圖2　各組血清CK、LDH活性比較(n=10)

2.3各組中性粒細胞浸潤比較假手術(shù)組大鼠心肌MPO活力為53.76 U/g，MI/R損傷模型組大鼠心肌MPO活力升至423.9 U/g，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；NAR各劑量組心肌MPO活力分別降至330.54、322.74、280.64 U/g，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

圖3　各組心肌MPO活力比較(n=10)

2.4各組血清炎性細胞因子比較假手術(shù)組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平分別為41.55、90.94 pg/mL，模型組血清TNF-α、IL-1β的表達水平分別升至158.32、500.78 pg/mL，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，NAR高劑量組血清TNF-α、IL-1β水平降至120.10、400.14 pg/mL (P<0.01)，NAR中劑量組降至125.87、409.87 pg/mL (P<0.05)，NAR低劑量組血清IL-1β水平降至420.91 pg/mL (P<0.05)。見圖4。

圖4　各組血清TNF-α和IL-1β的表達水平比較(n=10)

3討論

采用“藥物預(yù)處理”防治MI/R損傷已成為近年來的研究熱點。藥物預(yù)處理通過促使機體釋放生物活性物質(zhì)或直接激活內(nèi)源性保護機制，增強心臟對缺血、缺氧的耐受[7]。本研究采用預(yù)處理的方式觀察NAR對MI/R損傷大鼠的影響，結(jié)果表明，NAR (100 mg/kg)能顯著縮小心肌梗死面積(P<0.05)。有研究表明，作為存在于心肌細胞中的蛋白酶，血清CK、LDH水平與心肌壞死程度呈正相關(guān)[8]，可作為反映MI/R損傷程度的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[9]。本研究結(jié)果表明，NAR預(yù)處理可顯著抑制血清CK、LDH活性，提示NAR可通過提高細胞膜的穩(wěn)定性而發(fā)揮心肌保護作用。

以中性粒細胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)是造成缺血再灌注損傷的重要因素之一[10]，抑制中性粒細胞有可能成為防治MI/R損傷的有效措施[11]。MI/R發(fā)生時，激活的中性粒細胞聚集到心肌組織，通過一系列病理機制造成心肌細胞的損傷和功能的喪失，如：釋放炎性介質(zhì)、細胞毒性產(chǎn)物，直接損傷心??；黏附于微循環(huán)，阻塞毛細血管，造成“無復(fù)流現(xiàn)象”；釋放氧自由基，增強脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙等[12]。本研究顯示，大鼠MI/R心肌組織的中性粒細胞含量較正常心肌組織顯著升高，且在再灌注120 min時達到峰值[13]。MPO酶為中性粒細胞所特有，通過分析該酶的活力，可判斷中性粒細胞浸潤的程度。本研究結(jié)果表明，缺血再灌注后MPO活性顯著升高，提示中性粒細胞浸潤明顯；NAR預(yù)處理可使心肌MPO活性明顯下降(P<0.05或P<0.01)，提示NAR可通過抑制心肌內(nèi)中性粒細胞浸潤、減輕炎癥反應(yīng)來保護受損的心肌組織。

MI/R損傷是一個包括中性粒細胞活化、多種細胞因子過度表達、伴有多種炎性介質(zhì)參與的復(fù)雜過程。TNF-α是MI/R炎癥連鎖反應(yīng)中的一個關(guān)鍵性介質(zhì)，心肌細胞在缺血后再灌注的刺激下可合成和分泌大量TNF-α[14]。TNF-α本身具有細胞毒作用，可通過不同途徑導(dǎo)致心肌細胞受損，甚至溶解、死亡；TNF-α能刺激血管內(nèi)皮細胞和中性粒細胞表達黏附分子，反之，黏附分子促進中性粒細胞聚集并釋放活性氧和蛋白水解酶等物質(zhì)，導(dǎo)致心肌微血管阻塞，加重MI/R心肌損傷的程度[15]。研究顯示，大鼠MI/R損傷早期心肌組織及血清中TNF-α明顯表達，峰值出現(xiàn)在再灌注2～4 h[16]。IL-1β作為一種急性炎癥因子，廣泛參與感染、應(yīng)激及缺血再灌注等過程。IL-1β處于炎癥級聯(lián)反應(yīng)上游，MI/R損傷早期即有IL-1β產(chǎn)生[17]；IL-1β同樣能刺激血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，加重缺血組織的炎癥反應(yīng)；抑制IL-1β的產(chǎn)生和釋放，則可減輕MI/R損傷的程度[18]。在大鼠MI/R模型中應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過度表達IL-1β受體拮抗劑，可減輕心肌組織的炎癥浸潤和細胞凋亡[19]，證明IL-1β參與MI/R過程中的炎癥反應(yīng)和心肌細胞凋亡。本研究結(jié)果表明，冠脈結(jié)扎30 min再灌注120 min后，血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高，提示其參與了MI/R損傷的過程，加重心肌組織的灌注障礙；NAR高、中劑量組血清TNF-α、IL-1β水平及NAR低劑量組血清IL-1β水平較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，提示NAR預(yù)處理可減少炎性細胞因子的生成，抑制MI/R損傷中的炎癥反應(yīng)。

綜上，NAR預(yù)處理對MI/R損傷的心肌保護作用是通過抑制中性粒細胞浸潤、下調(diào)炎性細胞因子釋放、緩解MI/R過程中的炎癥反應(yīng)等途徑實現(xiàn)的。

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Protective mechanisms of naringenin against myocardial ischemia/reperfusion injury

MEI Fan-boa,WANG Wen-yana,LI Dong-meib,YIN Fei-feic*

(a.Department of Cadre Ward,b.Department of Pharmacy,c.Department of Gynaecology and Obstetrics,General Hospital of Armed Police Forces,Beijing 100039,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective mechanisms of naringenin (NAR) against myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury.MethodsRat model of MI/R injury was established by coronary artery ligation for 30 min followed by 120 min reperfusion.Then rats were divided randomly into 5 groups (n=10):sham group,model group and NAR groups (100,50 and 25 mg/kg).NAR was administered by intraperitoneal injection once daily for 7 d before operation.The activities of CK and LDH and levels of TNF-α and IL-1β were examined by colorimetric and ELISA method respectively after reperfusion.The area of myocardial infarction was calculated and MPO activity in heart homogenate was detected.ResultsHigh dose of NAR significantly reduced the area of myocardial infarction to 32.91%,which was better than that of model group (39.78%).The activities of CK and LDH in NAR groups were lower than those of model group (P<0.05 or P<0.01).NAR evidently reduced the MPO activity in heart homogenate (P<0.05 or P<0.01).The levels of TNF-α and IL-1β in NAR groups (100,50 mg/kg) were lower than those of model group (P<0.05 or P<0.01),and 25 mg/kg of NAR inhibited the IL-1β level in serum too(P<0.05).ConclusionThe effect of NAR pretreatment on MI/R injury appears to be associated with the inhibition of neutrophil infiltration and expression of inflammatory cytokines.

Key words：Naringenin;Myocardial ischemia/reperfusion injury;Rat;Neutrophil infiltration;Inflammation reaction

收稿日期：2015-09-01

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605004