caspase-3限制小鼠腦卒中恢復(fù)期齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖

朱西民　戴義芹　徐昊辰　孫春剛　范文英　趙冰樵△

(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點實驗室,2復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心　上海　200032)

caspase-3限制小鼠腦卒中恢復(fù)期齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖

朱西民1,2▲戴義芹1,2▲徐昊辰1,2孫春剛1,2范文英1,2趙冰樵1,2△

(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點實驗室,2復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心上海200032)

【摘要】目的探討caspase-3對腦卒中恢復(fù)期海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)神經(jīng)前體細胞(neuronal precursor cells,NPCs)增殖的作用。方法構(gòu)建小鼠大腦中動脈遠端堵塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)缺血模型,取缺血手術(shù)后第7天缺血側(cè)DG進行體外細胞培養(yǎng)。研究分為對照組和給藥組(caspase-3抑制劑給藥組);采用Western blot、免疫細胞化學(xué)、流式細胞儀和TUNEL染色檢測DG NPCs中caspase-3的表達及NPCs的凋亡和增殖情況。在小鼠腦卒中后第14天,采用免疫組織化學(xué)方法檢測caspase-3抑制對DG NPCs增殖的影響。結(jié)果體外培養(yǎng)的源自腦缺血后DG的神經(jīng)球NPCs大量表達激活型caspase-3,但是超過87%的caspase-3陽性細胞與TUNEL陽性沒有共定位關(guān)系。caspase-3限制了DG NPCs的自我更新,但并未參與細胞的凋亡過程。抑制caspase-3可促進腦卒中恢復(fù)期DG NPCs的增殖。結(jié)論caspase-3 可通過細胞凋亡之外的途徑調(diào)控缺血性腦損傷后的神經(jīng)再生。

【關(guān)鍵詞】腦卒中;神經(jīng)再生;caspase-3;齒狀回;神經(jīng)前體細胞;小鼠

腦卒中以其高發(fā)病率和高致殘率的特點成為當前嚴重威脅人類健康的重大疾病[1]。腦卒中往往引起神經(jīng)細胞的死亡和多種神經(jīng)功能的退化與喪失,并且可導(dǎo)致患者的運動、感覺、語言和認知等功能受到不同程度的損害[2]。然而對于腦卒中所造成的神經(jīng)功能障礙,臨床上至今尚無有效的治療手段。

在哺乳動物的側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)的顆粒細胞層(subgranular zone,SGZ)一直存在著神經(jīng)發(fā)生。這一再生功能伴隨于整個生命過程,對于腦結(jié)構(gòu)和功能的可塑性以及記憶的形成具有重要影響。研究表明,腦缺血損傷可以刺激SVZ和DG區(qū)域神經(jīng)細胞的增殖。新生的神經(jīng)細胞遷移至損傷區(qū)周邊或海馬DG的SGZ,分化為成熟的神經(jīng)元后參與腦組織的自我修復(fù)過程[3-8]。深入研究腦缺血損傷后神經(jīng)細胞再生的機制,進而更好地促進神經(jīng)元的有效新生,將為解決腦卒中后神經(jīng)功能再塑的關(guān)鍵問題提供重要的理論依據(jù)。

caspase是一組在細胞凋亡中起核心作用的半胱氨酸蛋白酶,caspase-3 是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一。caspase-3能夠裂解大量特定的底物,激活核酸內(nèi)切酶,最終導(dǎo)致細胞表現(xiàn)出染色質(zhì)濃縮和核內(nèi)DNA斷裂等細胞凋亡的典型特征[9-11]。caspase-3還具有細胞凋亡以外的多種重要生物學(xué)功能,例如調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性和T淋巴細胞的增殖以及參與單核細胞、成骨細胞、紅細胞、角化細胞和造血干細胞等的分化過程[12-15]。國內(nèi)外已有許多研究證實急性腦缺血或腦外傷引起激活型caspase-3在凋亡細胞中大量表達,而caspase-3基因敲除或caspase-3抑制劑對急性腦損傷均有非常明顯的保護作用,急性腦損傷可以通過激活caspase-3的方式誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡[16-17]。然而,caspase-3在腦缺血損傷后DG的神經(jīng)再生修復(fù)中起著何種作用,目前尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)caspase-3是缺血性腦卒中后調(diào)控DG神經(jīng)再生的一種關(guān)鍵內(nèi)源性分子,抑制caspase-3活性可促進腦卒中引起的DG神經(jīng)前體細胞(neuronal precursor cells,NPCs)增殖。這些發(fā)現(xiàn)將有可能為促進腦卒中后的神經(jīng)再生提供理論基礎(chǔ),并為開發(fā)腦卒中的治療藥物提供潛在的研究靶點。

材 料 和 方 法

實驗動物C57BL/6J實驗小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。小鼠為8～10周齡,雄性,體質(zhì)量為25～30 g,飼養(yǎng)于室溫(22±2)℃、濕度55%±5%的清潔級環(huán)境中,12 h交換照明,小鼠自由進水進食。動物飼養(yǎng)及動物實驗方案均嚴格按照復(fù)旦大學(xué)動物倫理委員會動物實驗規(guī)范執(zhí)行。

試劑和儀器BrdU和DMSO購自美國Sigma公司;4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) 購自美國Vector Laboratories公司;caspase-3抑制劑(Z-DEVD-fmk)購自美國Merck Millipore公司;TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司;Annexin V-FITC試劑盒購自美國BD Bioscience公司;鼠抗BrdU,兔抗激活型caspase-3購自英國Abcam公司;兔抗β-actin購自美國Cell Signaling Technology公司;山羊抗doublecortin(DCX)購自美國Santa Cruz公司;二抗購自美國Invitrogen公司。蛋白電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司;流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司;冰凍切片機購自德國Leica公司;激光共聚焦掃描顯微鏡購自日本Olympus公司。

小鼠腦缺血模型的建立動物實驗得到復(fù)旦大學(xué)動物倫理委員會批準。參照文獻[18-19]建造小鼠大腦中動脈遠端堵塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)缺血模型。小鼠經(jīng)水合氯醛(360 mg/kg,腹腔注射)麻醉,仰臥位固定,行頸正中切口,鈍性分離右側(cè)頸總動脈。小鼠左側(cè)臥,打開顱骨,挑開硬腦膜,暴露大腦中動脈,電凝大腦中動脈跨越嗅束后的遠端。血管夾阻斷右側(cè)頸總動脈15 min,監(jiān)測小鼠體溫并維持在(37±0.5)℃。

caspase-3抑制劑注射小鼠腦缺血手術(shù)前10天,麻醉后(360 mg/kg水合氯醛腹腔注射)使用立體定位儀固定頭部,按如下坐標埋入帶微量進樣針的套管：前囟后0.2 mm,左旁開0.9 mm,深1 mm。將caspase-3抑制劑Z-DEVD-fmk溶于DMSO,進一步在PBS中稀釋(pH=7.4),在腦缺血后第3、6、9、12天,每天2次(間隔8 h)經(jīng)側(cè)腦室注射Z-DEVD-fmk(240 ng溶于2 μL 1.8% DMSO),對照組注射2 μL 1.8% DMSO[14]。腦卒中后早期給藥會減少小鼠腦梗死[20],為排除Z-DEVD-fmk起神經(jīng)保護作用的可能,在腦缺血后第3天開始注射Z-DEVD-fmk。對照組和給藥組隨機分配。

BrdU標記為了研究Z-DEVD-fmk對NPCs增殖的影響,在腦缺血后第5～13天,每天2次由腹腔注射BrdU(50 mg/kg)[21],每組6只小鼠。

神經(jīng)球的培養(yǎng)根據(jù)文獻報道[22],在腦缺血后第7天將小鼠麻醉,無菌條件下取全腦,分離缺血側(cè)DG。分離出的組織用胰蛋白酶37℃水浴消化20 min,單細胞懸液以100×g離心5 min,用培養(yǎng)液重懸,將細胞密度調(diào)為1×104/mL,接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)皿,置于37℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。收集原代培養(yǎng)獲得的神經(jīng)球,消化成單個細胞,將細胞懸液以1 000個/孔接種于96孔板中。培養(yǎng)基中加入25 μmol/L Z-DEVD-fmk或等量DMSO,7天后統(tǒng)計神經(jīng)球數(shù)量。

Western blot檢測收集培養(yǎng)的神經(jīng)球,離心后加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酯酶抑制劑的裂解液裂解,勻漿,提取蛋白,再離心,BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜,含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h,加入兔抗激活型caspase-3一抗,4 ℃過夜,加入二抗,37 ℃孵育1 h,加入顯影液顯色,在Bio-Rad自動凝膠成像系統(tǒng)中拍照,以β-actin為內(nèi)參。

免疫細胞化學(xué)和TUNEL檢測免疫細胞化學(xué)染色：將經(jīng)過多聚賴氨酸和層粘連蛋白包被的蓋玻片置于24孔板內(nèi),將神經(jīng)球接種于蓋玻片上,用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定,10%驢血清封閉,加入兔抗激活型 caspase-3抗體,4℃過夜,PBS洗3次,加入熒光二抗(驢抗兔Alexa Fluro 594 IgG),室溫反應(yīng)30 min。按照相同步驟,進行Nestin染色。用DAPI標記細胞核。使用TUNEL試劑盒,按照說明書標記凋亡細胞。

流式細胞儀檢測凋亡收集對照組和Z-DEVD-fmk處理7天的神經(jīng)球,加入0.25%胰酶消化成單細胞,每組1×105細胞,加入錨定蛋白V-FITC和二碘化丙錠,避光反應(yīng)15 min,用流式細胞儀(Epics Altra FACScan Flow Cytometer,美國Beckman Coulter公司)檢測,采用EXPO32 V1.2 分析軟件分析數(shù)據(jù)。

免疫組織化學(xué)小鼠腦缺血手術(shù)后第14天,深麻醉,用PBS和多聚甲醛灌流、取腦。腦組織經(jīng)過多聚甲醛后固定、蔗糖梯度脫水,包埋,用冰凍切片機制備海馬DG區(qū)冠狀切片,切片厚度為20 μm。BrdU染色：切片經(jīng)PBS洗滌3次,浸入2 mol/L HCl,37 ℃水浴30 min,洗滌后浸入3% H2O2室溫避光反應(yīng)20 min,0.1%胰酶修復(fù)20 min,封閉液封閉后,加入鼠抗BrdU抗體(1∶200),4 ℃過夜,洗滌后,加入辣根過氧化酶(horse radish peroxidase,HRP)標記的二抗室溫孵育30 min,PBS漂洗,進行DAB顯色[23],經(jīng)光學(xué)顯微鏡成像分析。BrdU/DCX熒光雙標記中,一抗分別為鼠抗BrdU抗體(1∶200)和山羊抗DCX抗體(1∶200),二抗為Alexa Fluor 488(1∶1 000)和Alexa Fluor 594(1∶1 000),通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察和拍照。每個小鼠以1 mm的間隔取4張切片,通過Image J 軟件計數(shù)細胞。

結(jié)果

體外培養(yǎng)的DGNPCs表達caspase-3通過Westernblot檢測,我們發(fā)現(xiàn),源于小鼠腦缺血后DG的神經(jīng)球在不同時間點均能檢測到激活型caspase-3,但是Z-DEVD-fmk處理組激活型caspase-3表達量明顯偏低(圖1A)。通過細胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),源于小鼠腦缺血后DG的神經(jīng)球NPCs大量表達caspase-3(圖1B),但是通過TUNEL標記發(fā)現(xiàn),在激活型caspase-3陽性細胞中,TUNEL陽性率只有13%(圖1C,D)。綜上,我們初步得知源自腦缺血后DG的NPCs大量表達caspase-3,但caspase-3 的表達與細胞凋亡相關(guān)性不大。

圖 1Caspase-3在體外培養(yǎng)DGNPCs中的表達

Fig1Caspase-3wasexpressedinculturedDGNPCsin vitro

Caspase-3限制DG NPCs的自我更新,但不參與細胞凋亡過程為進一步確定DG NPCs中,caspase-3與細胞凋亡的關(guān)系,我們采用流式細胞儀和TUNEL試劑盒檢測了對照組和 Z-DEVD-fmk處理組細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,兩組的V-FITC陽性細胞率顯著差異(圖2A,B),兩組的TUNEL陽性細胞率也無顯著差異(圖2C)。這說明在DG 來源的NPCs中,caspase-3沒有發(fā)揮細胞凋亡作用。接下來,我們觀察了對照組和 Z-DEVD-fmk處理組神經(jīng)球的生長情況(圖2D),并對兩組神經(jīng)球計數(shù)統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)兩組神經(jīng)球的數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2E)。這些表明caspase-3雖然限制DG NPCs的自我更新,但不參與誘導(dǎo)細胞凋亡。

Caspase-3對小鼠腦卒中恢復(fù)期DG NPCs增殖的調(diào)節(jié)作用我們前期的工作證明,海馬DG區(qū)在生理情況下存在caspase-3激活的細胞,并且dMCAO缺血模型可增加caspase-3陽性細胞表達[24]。為闡明小鼠腦缺血恢復(fù)期caspase-3在DG NPCs中所起的作用,我們對小鼠進行dMCAO缺血手術(shù),手術(shù)后的小鼠被隨機分為對照組和Z-DEVD-fmk給藥組,在腦缺血手術(shù)后第14天,收集腦組織。通過BrdU染色發(fā)現(xiàn),Z-DEVD-fmk給藥組DG的BrdU陽性細胞數(shù)比對照組增加42.2%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A,C)。通過BrdU和DCX免疫熒光雙標染色發(fā)現(xiàn),Z-DEVD-fmk給藥組DG BrdU陽性的NPCs數(shù)比對照組增加48.3%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B,D)。

討論

對于caspase-3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理過程中的作用,以往的研究大多關(guān)注其凋亡功能。而在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)caspase-3限制腦缺血后DG來源神經(jīng)球NPCs的自我更新,但是并不參與細胞的凋亡過程,還發(fā)現(xiàn)抑制caspase-3活性能促進腦卒中恢復(fù)期DG NPCs的增殖。

在腦缺血急性期,csapase-3表達增加,caspase-3去磷酸化形成激活型caspase-3,激活型caspase-3通過切割其作用底物,繼而造成染色質(zhì)濃縮、DNA 損傷以及細胞凋亡小體的產(chǎn)生,從而引起細胞凋亡。有研究證明,在腦缺血和腦外傷急性期,抑制caspase-3可明顯減少神經(jīng)元死亡,減輕腦損傷[6,17]。近年來也有研究發(fā)現(xiàn),在細胞的增殖、分化,突觸的可塑性變化和軸突的定向等方面,caspase-3也發(fā)揮了非凋亡的重要功能[12-13]。

本研究結(jié)果顯示,激活型caspase-3在體外培養(yǎng)的DG NPCs中大量表達。我們采取TUNEL標記、免疫熒光染色及流式細胞儀檢測等多種方法,發(fā)現(xiàn)caspase-3并未執(zhí)行細胞凋亡的功能。通過Z-DEVD-fmk抑制caspase-3活性,可促進神經(jīng)球的更新,并且顯著增加小鼠腦缺血恢復(fù)期海馬DG NPCs的增殖。結(jié)合以往的研究報道,我們發(fā)現(xiàn),在腦卒中的疾病過程中,caspase-3可能扮演以下角色：在腦卒中急性期,caspase-3執(zhí)行細胞凋亡的功能,造成神經(jīng)元死亡;而在腦卒中恢復(fù)期,caspase-3抑制神經(jīng)細胞增殖,進而影響損傷后腦功能的重塑。今后需要進一步研究caspase-3抑制是否能能夠促進正常情況下DG NPC的增殖。

圖2Caspase-3可調(diào)節(jié)DGNPCs的自我更新但不參與細胞凋亡

Fig2Caspase-3regulatedself-renewalofNPCsbutnotcelldeathinculturedDGNPCs

圖3在小鼠腦缺血恢復(fù)過程中caspase-3對DGNPCs增殖的調(diào)節(jié)作用

Fig3Caspase-3negativelyregulatedDGNPCsproliferationinmiceduringstrokerecovery

腦卒中能夠引起神經(jīng)元的損傷和修復(fù)過程,因此增強內(nèi)源性神經(jīng)再生能力可能是治療腦損傷的一條可行途徑[25-26]。然而,僅僅依靠腦組織的自身修復(fù),新生的神經(jīng)元數(shù)目遠遠不能滿足卒中后腦功能修復(fù)的需要。本研究結(jié)果表明,caspase-3限制腦卒中后內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞的增殖,考慮到在腦缺血急性期caspase-3抑制對腦損傷具有保護作用,我們的研究結(jié)果將對開發(fā)腦卒中的新型治療藥物具有重要的參考意義。

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Restricted effect of caspase-3 on proliferation of neuronal precursor cells in dentate gyrus of mice during stroke recovery

ZHU Xi-min1,2▲, DAI Yi-qin1,2▲, XU Hao-chen1,2, SUN Chun-gang1,2,FAN Wen-ying1,2, ZHAO Bing-qiao1,2△

(1StateKeyLaboratoryofMedicalNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,2CollaborativeInnovationCenterforBrainScience,InstitutesofBrainScience,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of caspase-3 on the proliferation of neuronal precursor cells (NPCs) in the dentate gyruse (DG) during stroke recovery.MethodsThe stroke model was produced by electrocoagulating the distal middle cerebral artery (dMCA) of mice, then the NPGs were cultered from ischemia DG on the 7thday after stroke. Treatment groups and control groups were assigned in a randomized manner. The expression of caspase-3 and apoptosis and proliferation of NPCs were analyzed by Western blot, immunocytochemistry, flow cytometry analysis and TUNEL staining in NPCs cultured from ischemic DG. Besides, the effects of caspase-3 inhibition on the proliferation of NPCs in the DG was also investigated by immunohistochemistry in the mouse at 14 day after stroke.ResultsCaspase-3 was expressed in cultured NPCs,but more than 87% of the caspase-3 positive cells and TUNEL positive cells were not collocated. Caspase-3 negatively regulated self-renewal of NPCs,but did not participate in cell death in culture DG NPCs. Caspase-3 negatively regulated NPCs proliferation in the DG during stroke recovery.ConclusionsCaspase-3 may possess a novel function that limits the neurogenic response after stroke.

【Key words】stroke;neurogenesis;caspase-3;dentate gyruse;neural precursor cells;mouse

【中圖分類號】R363

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.005

(收稿日期:2015-09-15;編輯:段佳)

國家自然科學(xué)基金重點項目(81530034);國家自然科學(xué)基金面上項目(81071062,81271457)

△Corresponding authorE-mail:bingqiaoz@fudan.edu.cn

*This work was supported by the Key Program of National Natural Science Foundation of China (81530034) and the General Program of National Natural Science Foundation of China (81071062,81271457).