p16、RASSF1A在肝細(xì)胞性肝癌患者腫瘤組織及血漿中異常甲基化的檢測及臨床意義

董曉剛，郭文佳，丁偉

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p16、RASSF1A在肝細(xì)胞性肝癌患者腫瘤組織及血漿中異常甲基化的檢測及臨床意義

董曉剛，郭文佳，丁偉

【摘要】

目的探討原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌（HCC）患者腫瘤組織及血漿中 p16 及 RASSF1A 啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)及其在HCC 早期無創(chuàng)診斷中的意義。

方法采用甲基化特異性 PCR 技術(shù)檢測 60 例 HCC 患者腫瘤組織、癌旁組織、血漿及 60 例正常肝臟患者肝組織及血漿中 p16、RASSF1A 基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，分析其與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

結(jié)果60 例 HCC 患者血漿、腫瘤組織及癌旁中 p16 基因甲基化率分別為 68.3%（41/60）、63.3%（38/60）和 41.7% （25/60）；RASSF1A 基因異常甲基化檢出率分別為 73.3% （44/60）、70.0%（42/60）和 36.7%（22/60）；60 例正常肝臟患者肝組織及血漿 p16、RASSF1A 未檢測到基因啟動子區(qū)域的甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.000）。HCC 患者外周血漿和癌組織中 p16、RASSF1A 基因的甲基化率與患者年齡、性別、AFP、有無肝炎病毒感染（HBV）、有無肝硬化、Child 分級、腫瘤個數(shù)、包膜完整與否、有無癌栓、是否復(fù)發(fā)、病理分級、腫瘤分期無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。

結(jié)論HCC 患者腫瘤組織及血漿 DNA 中可檢測到RASSF1A 基因和 p16 基因的甲基化，外周血 p16 基因和RASSF1A 基因的甲基化檢測對肝癌篩查有重要意義，可能成為 HCC 新的腫瘤分子標(biāo)記物。

【關(guān)鍵詞】癌，肝細(xì)胞；p16 基因；RASSF1A 基因；啟動子區(qū)甲基化；血漿

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù)， 2016， 11（3）：252-258

作者單位：830011 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科（董曉剛、丁偉），腫瘤研究所（郭文佳）

原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌（HCC）是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，但其發(fā)生的分子機(jī)制目前尚不清楚。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，盡管手術(shù)、肝動脈灌注化療栓塞、射頻消融、微波消融、肝移植等多種治療手段被廣泛應(yīng)用于臨床，但總體治療效果欠佳，故早期診斷并進(jìn)行治療對 HCC 預(yù)后具有重要意義［1］。

甲胎蛋白（AFP）是目前臨床常用的 HCC 診斷的指標(biāo)，AFP 可以在大約 80% 的成人肝癌患者血清中升高，但并不是 AFP 升高就一定意味著HCC 的發(fā)生，妊娠、生殖胚胎惡性腫瘤、急性肝炎、慢性活動性肝炎、肝硬化患者血清 AFP 都會有輕度或中度升高，也不是所有的 HCC 患者都有AFP 的升高。因此，尋找微創(chuàng)和簡捷的檢測方法是HCC 治療新的研究方向。

腫瘤抑制基因（tumor suppression gene，TSG）啟動子區(qū)域 CpG 島的異常高甲基化可以改變?nèi)旧|(zhì)空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤抑制基因的低表達(dá)或不表達(dá)，但該基因的 DNA 序列并沒有發(fā)生改變，被認(rèn)為在惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起到了重要作用［2］，肝癌也不例外。

本研究應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation-specific PCR，MSP）技術(shù)，檢測 60 例HCC 患者腫瘤組織、癌旁組織、血漿中 p16、RASSF1A 基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，并檢測60 例正常肝臟患者肝組織及血漿 p16、RASSF1A基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，結(jié)合腫瘤患者臨床資料，以探討 p16、RASSF1A 基因啟動子區(qū)域異常甲基化在 HCC 患者血漿和組織中的一致性，及血漿 DNA 甲基化檢測在 HCC 早期篩查中的臨床應(yīng)用價值。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本收集共收集 2011 年 1 月至 2013 年 12 月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科手術(shù)治療的 60 例 HCC 患者血漿及組織標(biāo)本，所有樣本患者均經(jīng)病理確診，排除其他內(nèi)分泌、免疫性、代謝性疾病，術(shù)前均未行介入、化療、放療等其他抗腫瘤治療。其中男性 35 例，女性 25 例；血漿 AFP ≥ 400 μg/L 者 56 例，AFP ＜ 400 μg/L 者 4 例；HBV 感染 58 例；合并肝硬化者 48 例；肝功能 Child 分級：A 級 58 例，B 級 2 例；腫瘤個數(shù)：單發(fā)者 53 例，多發(fā)者 7 例；包膜完整者 44 例，無包膜或包膜不完整者 16 例；60 例正常肝組織及血液取自未合并慢性乙型病毒性肝炎的肝海綿狀血管瘤手術(shù)患者。所有患者均簽署知情同意書并詳細(xì)告知樣本收集目的及用途。HCC患者及正常對照者血液 EDTA 用抗凝管采血 4 ～8 ml 后以 3000 r/min 離心 10 min，分離血漿，血漿分裝于 1.5 ml Eppendof 管，-80 ℃ 冰箱保存待用或立即提取 DNA。

1.1.2試劑QIAmpDNA Blood Mini Kit 試劑盒和 DNA 提取試劑盒購自德國 Qiagen 公司；MethylampTMOne-Step DNA Modification Kit 試劑盒購自美國 Epigentek 公司。

1.2方法

1.2.1DNA 提?、倏鼓x心分離后得到血漿標(biāo)本，采用 QIAmpDNA Blood Mini Kit 試劑盒提取血漿 DNA，按說明書進(jìn)行操作。②取癌組織及癌旁組織約 25 mg，按說明書采用 DNA 提取試劑盒提取癌組織 DNA。提取的 DNA 用紫外分光光度計(jì)檢測濃度和純度，提取的 DNA 置于 -20 ℃冰箱保存或立即行亞硫酸化修飾。

1.2.2DNA 亞硫酸化修飾按照 MethylampTMOne-Step DNA Modification Kit 試劑盒中的說明進(jìn)行操作。發(fā)生甲基化的 DNA 在修飾后不發(fā)生序列改變，而未發(fā)生甲基化的 DNA 在修飾后 CpG 中5′ 端的“C”將變成“U”。然后運(yùn)用甲基化特異性 PCR 擴(kuò)增后分析甲基化狀態(tài)。

1.2.3甲基化特異性 PCRp16 和 RASSF1A 基因引物序列及反應(yīng)條件如表1。反應(yīng)體系總體積為25 μl，組成為：MiliiQ H2O 13.4 μl；10 × PCR 緩沖液 II 2.5 μl；MgCl22.5 pl；2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl；Ampli Taq Gold 0.1 μl；甲基化或非甲基化引物 F 1.0 μl；甲基化或非甲基化引物 R 1.0 μl；已修飾的DNA 2 μl。PCR 條件：95 ℃ 預(yù)變性 10 min；繼以95 ℃ 1 min，退火溫度 1 min，72 ℃ 1 min 共 45 個循環(huán)。最后于 72 ℃ 延伸 10 min，4 ℃ 冷卻。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 2% 的瓊脂凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。陰性對照不加模板 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

1.2.4結(jié)果判斷瓊脂凝膠電泳出現(xiàn)甲基化引物擴(kuò)增條帶判定該組織甲基化為陽性；當(dāng)出現(xiàn)非甲基化引物擴(kuò)增條帶未出現(xiàn)甲基化擴(kuò)增條帶，判定該組織為甲基化陰性。甲基化和非甲基化引物均擴(kuò)增出條帶，判定其為部分甲基化，亦表示甲基化陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用 t 檢驗(yàn)，肝癌組織基因甲基化與臨床資料的關(guān)系采用四格表確切概率法，P ＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

表1　p16 和 RASSF1A 基因引物序列及甲基化特異性 PCR 反應(yīng)條件Table 1　Primers sequences and conditions of the methylated PCR （MSP）

2.1p16 和 RASSFlA 基因的甲基化水平

p16 基因在 60 例 HCC 患者癌組織中的甲基化率為 63.3%（38/60），在癌旁組織中甲基化率為 41.7%（25/60），在 HCC 患者血漿中的甲基化率為 68.3%（41/60），見圖1 和圖2；MSP 法檢測癌組織、癌旁組織及 HCC 患者血漿 p16 基因甲基化結(jié)果示意見圖3。對照肝臟海綿狀血管瘤患者肝組織及血漿 p16 基因未檢測到啟動子區(qū)域的甲基化，p16 甲基化率癌組織與癌旁組織比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 5.65，P ＜ 0.05），癌組織與腫瘤患者血漿比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.33，P ＞0.05），癌旁組織與 HCC 患者血漿比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.62，P ＜ 0.05）；HCC 患者癌組織與血漿中的甲基化發(fā)生率呈正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為r = 1（P = 0.003）。

圖1　p16 基因在組織標(biāo)本中的甲基化率（*P ＜ 0.05）Figure 1　The methylated rate of p16 in tissues （*P ＜ 0.05）

圖2　p16 基因在血漿標(biāo)本中的甲基化率（*P ＜ 0.05）Figure 2　The methylated rate of p16 in plasma （*P ＜ 0.05）

M：甲基化引物擴(kuò)增條帶；U：非甲基化引物擴(kuò)增條帶；T：癌組織；P：血漿M： Methylated； U： Unmethylated； T： Tumor tissues； P： Plasma圖3　肝癌組織（T1 ～ T4）和肝癌患者血漿（P1 ～ P4）p16 甲基化情況Figure 3　The methylated status of p16 in tumor tissues （T1 - T4） and plasma （P1 - P4）

圖4　RASSF1A 基因在組織標(biāo)本中的甲基化率（*P ＜ 0.05）Figure 4　The methylated rate of RASSF1A in tissues （*P ＜0.05）

圖5　RASSF1A 基因在血漿標(biāo)本中的甲基化率（*P ＜ 0.05）Figure 5　The methylated rate of RASSF1A in plasma （*P ＜0.05）

RASSF1A 基因在 60 例 HCC 患者癌組織中的甲基化率為 70.0%（42/60），在癌旁組織中甲基化率為 36.7%（22/60），見圖4，在 HCC 患者血漿中的甲基化率為 73.3%（44/60）（圖5），MSP 法檢測癌組織、癌旁組織及 HCC 患者血漿RASSF1A 基因甲基化結(jié)果示意見圖6；對照肝臟海綿狀血管瘤患者肝組織及血漿 RASSF1A 未檢測到基因啟動子區(qū)域的甲基化；RASSF1A 甲基化率癌組織與癌旁組織比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），癌組織與 HCC 患者血漿比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），癌旁組織與 HCC 患者血漿比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；癌組織與 HCC 患者血漿中的甲基化發(fā)生率呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 r = 1（P = 0.003）。

2.2甲基化與各臨床資料的關(guān)系

本組病例血漿中 p16、RASSF1A 基因甲基化發(fā)生率與患者性別、年齡、肝硬化、腫瘤大小、AFP 水平等臨床資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（表2）。癌組織中p16、RASSF1A 基因甲基化發(fā)生率與各臨床資料也無相關(guān)性（表3）。

M：甲基化引物擴(kuò)增條帶；U：非甲基化引物擴(kuò)增條帶；T：癌組織；P：血漿M： Methylated； U： Unmethylated； T： Tumor tissues； P： Plasma圖6　肝癌組織（T1 ～ T4）和肝癌患者血漿（P1 ～ P4）RASSF1A 甲基化情況Figure 6　The methylated status of RASSF1A in tumor tissues （T1 - T4） and plasma （P1 - P4）

表2　HCC 患者血漿中 p16、RASSF1A 基因甲基化與臨床參數(shù)的關(guān)系Table 2　The correlation between HCC and plasma’s p16 and RASSF1A methylation and the clinicopathological parameters

2.3p16 基因和 RASSF1A 基因聯(lián)合檢測及 AFP與基因甲基化檢出率的關(guān)系

HCC 患者血漿 p16 基因甲基化檢出率為63.3%（38/60），RASSF1A 基因甲基化檢出率為73.3%（44/60），兩者聯(lián)合甲基化檢出率為 80% （48/60），高于兩者各自的單項(xiàng)指標(biāo)檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.042）。60 例 HCC 患者中，AFP 陽性 41 例，AFP 陰性 19 例，AFP 陽性組和陰性組 p16 甲基化檢出率分別為 95.1%（39/41）和 10.5%（2/19），RASSF1A 甲基化檢出率分別為100%（41/41）和 15.8%（3/19），AFP 陽性組和陰性組 RASSF1A 基因、p16 基因甲基化檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。60 例研究對象中 AFP 陽性率為68.3%（41/60）。AFP、p16 和 RASSF1A 基因項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢出率同三者各自的單項(xiàng)指標(biāo)檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

表3　HCC 患者肝癌組織中 p16、RASSF1A 基因甲基化與臨床參數(shù)的關(guān)系Table 3　The correlation between HCC and tumor tissues’ p16 and RASSF1A methylation and the clinicopathological parameters

3　討論

肝癌的病因至今尚不清楚，目前認(rèn)為是 HBV感染、食物黃曲霉素污染、癌基因活化、抑癌基因失活等因素共同作用、逐漸積累的結(jié)果，其中抑癌基因的失活是一個重要機(jī)制［3］。有研究報道抑癌基因啟動子甲基化是 HCC 發(fā)生中的一種早期、普遍事件［4］，對其的研究亦越來越受到關(guān)注。

DNA 甲基化主要發(fā)生在 DNA 的 CpG 島，雖不能改變核苷酸序列，卻能調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，在基因的表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞增殖與分化等方面都發(fā)揮重要作用［5］。大量研究表明，DNA 甲基化可引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，DNA 構(gòu)象、穩(wěn)定性及 DNA 與蛋白質(zhì)作用方式發(fā)生改變，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)［6］，平時非甲基化的抑癌基因出現(xiàn)啟動子區(qū) CpG 島甲基化可導(dǎo)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活從而表達(dá)缺失。啟動子區(qū)異常甲基化與腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，其會影響甲基化敏感的轉(zhuǎn)錄因子同啟動子的結(jié)合，進(jìn)而引起基因表達(dá)沉默［7］。由于 CpG 島的局部高度甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此，甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測［8］。

P16 又叫 MTS 1（multiple tumor suppressor 1）基因，是 1994 年美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室 Kamb 等發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，p16 蛋白通過與 cyclinD1 競爭結(jié)合細(xì)胞周期素依賴激酶 CDK4 而抑制 CDK4 的激酶活性，阻止細(xì)胞從 G1期進(jìn)入 S 期，抑制細(xì)胞的無限增殖及惡性轉(zhuǎn)化。其失活可導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，細(xì)胞周期加速，使 DNA 在未被修復(fù)前過早地進(jìn)入 S 期，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［9］。p16 基因啟動子區(qū)域的 CpG 島異常甲基化在腫瘤發(fā)生組織增生和化生階段就已出現(xiàn)，且該甲基化通過腫瘤患者血清標(biāo)本即可檢測［10］。RAS 相關(guān)區(qū)域家族 1A（RASSF1A）位于染色體 3p21.3 區(qū)，是由 Dammann 等［11］在2000 年克隆并命名的，功能研究顯示其為抑癌基因，在正常組織中 RASFF1A 基因啟動子區(qū)域很少發(fā)生甲基化，目前 RASSF1A 基因啟動子區(qū)甲基化水平已經(jīng)成為多種腫瘤診斷的一個重要生物學(xué)指標(biāo)，在乳腺癌［12］、腎癌［13］、肺癌［13］和前列腺癌［14］等惡性腫瘤中均檢測出該基因啟動子區(qū)異常甲基化。

p16 和 RASSF1A 基因分屬于兩個不同的信號傳導(dǎo)通路，本研究我們發(fā)現(xiàn) p16 及 RASSF1A 基因在 HCC 組織的甲基化陽性率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，正常肝組織中未檢測到 p16 及RASSF1A 基因異常甲基化，HCC 患者血漿中 p16 及 RASSF1A 較對照患者血漿甲基化率高，且HCC 患者血漿與腫瘤組織 p16 及 RASSF1A 甲基化有相關(guān)性，因此兩者聯(lián)合檢測可能提高 HCC檢出率（P = 0.042），提示 HCC 患者相對于正常對照血清中異常甲基化的游離 p16 及 RASSF1A基因與 HCC 發(fā)生有關(guān)，HCC 患者血清中 p16 及RASSF1A 基因甲基化可能是腫瘤形成的早期事件，血清 p16 及 RASSF1A 甲基化的檢測有早期預(yù)示腫瘤的作用。本結(jié)果與 Zekri 等［15］研究結(jié)果相近但甲基化程度不同，原因可能為①該研究樣本均取自HCV 病毒感染患者，探討 HCV 病毒與甲基化的關(guān)系；②該研究與本研究人種不同，地域也存在一定差異，可能影響甲基化的特點(diǎn)。

本研究中血清 p16 及 RASSF1A 基因甲基化與性別、年齡、肝硬化、腫瘤大小、AFP 水平等臨床病理資料未顯示相關(guān)性，與何青芳等［16］報道結(jié)果一致，分析原因可能與我們收集病例數(shù)較少、AFP及甲基化檢測方法的不同、腫瘤患者的地域性差異，以及患者合并不同肝臟疾病等其他臨床病理相關(guān)因素有關(guān)。

眾所周知，早期診斷對提高腫瘤治療效果及改善預(yù)后意義重大，越來越多的研究表明，DNA 的甲基化異常和癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。血漿 DNA 甲基化檢測的優(yōu)點(diǎn)在于方便及微創(chuàng)，對HCC 早期診斷、病情檢測及預(yù)后評估有重要意義。本研究結(jié)果表明，p16、RASSF1A 基因在 HCC 患者血漿中的甲基化率分別為 68.3% 和 73.3%，HCC 患者血漿中 p16 和 RASSF1A 基因甲基化測定可能對 HCC 的篩查有一定預(yù)示作用，兩者聯(lián)合檢測的陽性率達(dá) 80%，因此，兩者聯(lián)合檢測可能提高 HCC 檢出率，我們認(rèn)為對 HCC 發(fā)生的高風(fēng)險人群進(jìn)行基因甲基化監(jiān)測可能有助于 HCC 的早期診斷，且可作為腫瘤篩查的分子生物標(biāo)志物進(jìn)一步研究，對確診的 HCC 患者可能有助于監(jiān)測病情變化和預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)。

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Author Affiliation：Departments of Hepatobiliary Surgery （DONG Xiao-gang， DING Wei）， Cancer Research Institute （GUO Wen-jia）， Affiliated Cancer Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（3）：252-258

·協(xié)會之窗·

Detection of methylation of p16 and RASSF1A gene in plasma and tumor tissues from patients with hepatocellular carcinoma and its clinical significance

DONG Xiao-gang， GUO Wen-jia， DING Wei

【Abstract】

ObjectiveTo detect aberrant methylation in the promoter of p16 and RASSF1A genes in peripheral plasma and tumor tissues from patients with hepatocellular carcinoma （HCC） and to discuss its clinical significance.

MethodsThe methylation status of p16 and RASSF1A genes in peripheral plasma and tumor tissues from 60 patients with HCC and adjacent noncancerous tissues were detected by methylation specific polymerase chain reaction （MSP）， and 60 normal liver tissues and plasma served as controls. Correlation between methylation status and clinicopathological features was analyzed.

ResultsThe rates of promoter methylation of p16 gene in the plasma， HCC and adjacent noncancerous tissues of 60 patients were 68.3% （41/60）， 63.3 % （38/60） and 41.7 % （25/60）， respectively， while the rates of promoter methylation of RASSF1A gene from above samples were 73.3% （44/60）， 70.0% （42/60） and 36.7% （22/60）， respectively. No methylated p16 or RASSF1A promoter was detected in normal liver tissues and plasma （P = 0.000）. No correlation was found between p16 and RASSF1A methylation status in HCC and plasma and the clinicopathological parameters， such as age， sex， cirrhosis， HBV， AFP， tumor size， tumor capsular， portal vein tumor embolus or pathological grades.

ConclusionAberrant promoter methylation of RASSF1A and p16 can be detected in plasma DNA among HCC patients. This detection is valuable as a potential biomarker for HCC.

【Key words】Carcimona， hepatocellular；p16 gene；RASSF1A gene；Promoter methylation；Plasma

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.010

基金項(xiàng)目：新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院啟動基金腫（2014-13）

通信作者：丁偉，Email：dingwei2@medmail.com.cn

收稿日期：2015-10-27

Corresponding Author:DING Wei， Email： dingwei2@medmail.com.cn