• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酵母UDP-葡萄糖合成途徑的優(yōu)化及黃酮葡萄糖苷的合成

    2016-06-21 00:50:13王惠敏楊燕田雷瑜周文龍王偉
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:黃酮類

    王惠敏,楊燕,田雷瑜,周文龍,王偉

    ?

    酵母UDP-葡萄糖合成途徑的優(yōu)化及黃酮葡萄糖苷的合成

    王惠敏,楊燕,田雷瑜,周文龍,王偉

    【摘要】

    目的研究在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)大腸桿菌 UDP-葡萄糖合成途徑的 2 個(gè)關(guān)鍵酶對(duì)工程酵母細(xì)胞的葡萄糖苷化反應(yīng)活性的影響。

    方法利用 PCR 方法獲得大腸桿菌磷酸葡萄糖變位酶(PGM)和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(GalU)基因,構(gòu)建整合型表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化酵母;同時(shí)共表達(dá)具有催化黃酮葡萄糖苷化的 UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶,研究搖瓶培養(yǎng)條件下 PGM 和 GalU 基因的表達(dá)對(duì)工程細(xì)胞生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化的影響。

    結(jié)果在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)大腸桿菌 UDP-葡萄糖合成途徑的 2 個(gè)關(guān)鍵酶 PGM 和 GalU,提高了組合表達(dá) UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的工程菌生物催化合成野黃芩素-7-O-葡萄糖苷的效率,表明 PGM 和 GalU 基因的高表達(dá)能促進(jìn) UDP-葡萄糖的合成;所構(gòu)建的工程菌也能催化木犀草素、柚皮素、白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素 A、黃芩素、槲皮素以及大豆黃酮等黃酮類化合物的葡萄糖苷化。

    結(jié)論組合表達(dá)大腸桿菌 PGM 和 GalU 基因能促進(jìn)酵母細(xì)胞內(nèi) UDP-葡萄糖的合成,進(jìn)而提高了工程細(xì)胞催化合成黃酮葡萄糖苷的效率。

    【關(guān)鍵詞】黃酮類;尿苷二磷酸葡糖;釀酒酵母菌;葡糖磷酸變位酶;葡糖轉(zhuǎn)移酶類

    www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):229-235

    作者單位:100050 北京,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

    黃酮類化合物廣泛存在于自然界,具抗氧化、抗腫瘤、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等生物活性,在植物體內(nèi)多以游離或與糖結(jié)合成苷的形式存在[1-2];大多數(shù)在水相中溶解度低,限制其藥物劑型的開發(fā)。目前提高黃酮類化合物溶解度的主要手段是對(duì)其糖苷化修飾,其糖苷化修飾研究最多的是葡萄糖苷化反應(yīng)?;瘜W(xué)修飾法需要對(duì)黃酮的酚羥基先進(jìn)行酰基保護(hù),然后與活化的糖基供體(如糖基三氯乙酰亞胺酯)進(jìn)行糖苷化反應(yīng),最后再高選擇性地脫去保護(hù)基團(tuán)獲得黃酮糖苷化產(chǎn)物[3]。這種葡萄糖苷化的化學(xué)修飾反應(yīng)步驟復(fù)雜,收率低,副產(chǎn)物多,難以進(jìn)行規(guī)?;糯蠛蜕a(chǎn),不具有生產(chǎn)實(shí)用價(jià)值。

    微生物轉(zhuǎn)化法和酶法進(jìn)行葡萄糖苷化修飾,反應(yīng)條件溫和,無需進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù)反應(yīng),立體和區(qū)域選擇性高,可以定向高效地生物催化黃酮苷元的葡萄糖苷化[4-5]。酶促催化需要添加活化的糖基供體 UDP-葡萄糖(uridine diphosphate glucose),由于此前體分子價(jià)格較貴,目前該法也僅用于糖基轉(zhuǎn)移酶的功能鑒定,難以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的放大;而利用僅高表達(dá) UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的工程菌直接進(jìn)行生物催化,由于細(xì)胞自身合成活化的 UDP-葡萄糖水平較低,導(dǎo)致生物催化合成葡萄糖苷化產(chǎn)物的水平較低。最近,為提高工程細(xì)胞生物催化糖苷化反應(yīng)的效率,研究報(bào)道通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)的 UDP-葡萄糖生物合成途徑,提高細(xì)胞合成 UDP-葡萄糖的水平;同時(shí)高表達(dá) UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶,較大幅度地提高了糖苷化產(chǎn)物的合成水平[6-7]。

    釀酒酵母作為真核單細(xì)胞生物,不僅具有原核生物(如大腸桿菌等)生長快、易培養(yǎng)和易于進(jìn)行遺傳改造的優(yōu)點(diǎn),還可以異源高表達(dá) UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行葡萄糖苷化修飾[7]。但由于酵母細(xì)胞具有較強(qiáng)的葡萄糖苷酶水解活性[8-9],限制了其進(jìn)行生物催化合成葡萄糖苷產(chǎn)物的應(yīng)用;酵母細(xì)胞糖苷水解酶對(duì)葡萄糖苷修飾的影響已另文報(bào)道。本研究以敲除葡萄糖苷酶基因的工程酵母細(xì)胞為基礎(chǔ)菌株,進(jìn)行高表達(dá)大腸桿菌的 2 個(gè)參與 UDP-葡萄糖合成的關(guān)鍵酶,即葡萄糖-6 -磷酸變位酶(phosphoglucomutase,PGM)和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase,GalU),提高細(xì)胞內(nèi)源性 UDP-葡萄糖水平;同時(shí)共表達(dá)已功能鑒定的黃芩 UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶,研究所構(gòu)建工程菌具有催化黃酮類化合物葡萄糖苷化生物催化的活性。

    1 材料與方法

    1.1菌株和質(zhì)粒

    所使用菌株和構(gòu)建的質(zhì)粒見表1,其中宿主菌Escherichia coli Trans1-T1 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,酵母 W303-1b 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2方法

    1.2.1表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

    1.2.1.1含有 PGM 基因表達(dá)載體的構(gòu)建以大腸桿菌的基因組 DNA 為模板,以 GenBank 注冊(cè)號(hào) EG12144 的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成引物(表2),利用 2 組引物 PGM_1/PGM_4 和PGM_2/PGM_3 進(jìn)行巢式-PCR(Nested-PCR)擴(kuò)增,得到長約為 1.6 kb 的 DNA 片段;然后用限制性內(nèi)切酶 Nde I 和 Nhe I 酶切,再與用相同酶切的質(zhì)粒 pδGAPh[10]進(jìn)行 DNA 連接反應(yīng),該載體 pδGAPh 含有釀酒酵母三磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,GAP)啟動(dòng)子、釀酒酵母 δ 整合位點(diǎn)、釀酒酵母終止子(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)和可利用潮霉素 B(hygromycin B,HygB)進(jìn)行篩選的 HygB 激酶標(biāo)記基因,經(jīng) CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Trans1-T1,篩選獲得陽性克隆,即得到釀酒酵母整合型表達(dá)質(zhì)粒 pδGAPh-PGM。

    表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

    表2 本實(shí)驗(yàn)使用的 PCR 擴(kuò)增引物Table 2 PCR primers used in this study

    1.2.1.2含有 GalU 基因表達(dá)載體的構(gòu)建以GenBank 注冊(cè)號(hào) NP_415752 的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成 PCR 反應(yīng)引物,采用與 PGM 基因片段相同的克隆方式,把 PCR 擴(kuò)增獲得的 DNA 片段與經(jīng) Nde I 和 Nhe I 酶切的質(zhì)粒 pδGAP'z 進(jìn)行DNA 連接反應(yīng);其中質(zhì)粒 pδGAP'z 是用引物TyR-ZH1/TyR-ZE1 和質(zhì)粒 pPICZαA 為模板經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到博來霉素篩選標(biāo)記基因 sh ble,再置換質(zhì)粒 pδGAP'g 上的標(biāo)記基因 kanMX,該質(zhì)粒載體 pδGAP'z 含有甲醇酵母 GAP 啟動(dòng)子、釀酒酵母 δ 整合位點(diǎn)、釀酒酵母 PGK1 終止子和可用博來霉素抗性篩選標(biāo)記基因 sh ble,經(jīng) CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Trans1-T1,篩選獲得陽性克隆,即得到釀酒酵母整合型質(zhì)粒 pδGAP'z-GalU。

    1.2.1.3含有 SbGT34 表達(dá)載體的構(gòu)建以含有黃芩 UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒 pTWIN1BUGT34 為模板,用引物 SBUGT_N1/SBUGT_X1 經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得的已完成功能鑒定的黃芩 UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段,經(jīng) Nde I 和 Xba I 雙酶切并亞克隆到 pδGAPg[10]載體,經(jīng) CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Trans1-T1,篩選獲得陽性克隆,即得到 pδGAPg-SbGT34 整合型表達(dá)載體。

    1.2.2釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及 LiAc 轉(zhuǎn)化方法參照 LiAc 轉(zhuǎn)化法[11]制備酵母感受態(tài)細(xì)胞和DNA 轉(zhuǎn)化,把轉(zhuǎn)化體系涂布于含有相應(yīng)抗生素的YPD 平板上篩選,在 30 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3 d。將獲得的菌株轉(zhuǎn)接于含高濃度抗生素的篩選平板上進(jìn)行高拷貝整合陽性克隆復(fù)篩。

    1.2.3陽性克隆的鑒定目的基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,篩選獲得陽性克隆,然后采用酵母基因組 DNA提取試劑盒提取基因組 DNA。通過 PCR 鑒定確定目的基因是否整合進(jìn)入宿主的基因組中,最后再以各基因的特異引物對(duì)純化的 PCR 擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

    1.2.4大腸桿菌糖代謝途徑 PGM 和 GalU 基因?qū)こ叹呋S酮底物轉(zhuǎn)化率的影響把已構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒 pδGAPh-PGM、pδGAP'z-GalU 和pδGAPg-SbGT34 用限制性內(nèi)切酶 Not I 進(jìn)行線性化,然后轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 W303-1b/ES。以獲得的工程菌W303-1b/ES/PeG/SbGT34 為實(shí)驗(yàn)組,工程菌W303-1b/ES/SbGT34 為對(duì)照組鑒定 PGM 和GalU基因的表達(dá)對(duì)工程菌催化黃酮底物轉(zhuǎn)化率的影響。以野黃芩素為底物鑒定提高 UDP-葡萄糖合成水平的工程菌對(duì)黃酮底物糖苷化催化活性的變化,具體做法如下:①挑取單克隆接種于 YPD 液體培養(yǎng)基中,30 ℃,220 r/min,培養(yǎng)至 OD600到 3.0 左右。②按 1% 的接種量轉(zhuǎn)接到 SC 合成液體培養(yǎng)基中,30 ℃,220 r/min 培養(yǎng)約 10 h。③用 SC 培養(yǎng)基調(diào)節(jié)生物量,使得初始 OD600為 1.0,然后把工程細(xì)胞 1 ml 分裝于 5 ml 反應(yīng)瓶中,每種工程菌3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn),每個(gè)反應(yīng)瓶中加入野黃芩素為反應(yīng)底物,使得野黃芩素的終濃度為 0.2 mmol/L,30 ℃,165 r/min 反應(yīng)。④分別于反應(yīng) 3、6、12、24、48、 72、96 h 取出 3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)瓶,樣品冷干后用 500 μl 甲醇萃取 3 次。把 3 次甲醇萃取液完全揮干后,再用 1 ml 甲醇溶解萃取物,經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行 HPLC 分析。

    1.2.5工程菌對(duì)不同黃酮類底物的生物催化利用工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 對(duì)不同黃酮類化合物包括木犀草素、柚皮素、白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素 A、野黃芩素、黃芩素、槲皮素以及大豆黃酮等進(jìn)行生物催化,實(shí)驗(yàn)方法與 1.2.4 相同。

    1.2.6黃酮葡萄糖苷化產(chǎn)物的分析和結(jié)構(gòu)鑒定生物催化產(chǎn)物冷干濃縮,用甲醇溶解后直接利用 HPLC 系統(tǒng)進(jìn)行分析,C18 色譜柱為 Mightysil RP-18 GP(4.6 mm × 250 mm,5 μm),流動(dòng)相 A 和B 為 H2O(0.05% 三氟乙酸)和乙腈,流速為1 ml/min;洗脫梯度為 0 ~ 25 min(10% ~ 35% B)、25 ~ 27 min(35% ~ 100% B)、27 ~ 32 min(100% B)、32 ~ 35 min(100% ~ 10% B)、35 ~ 40 min(10% B)。采用 HPLC-ESI-MS/MS 以負(fù)離子掃描模式進(jìn)行產(chǎn)物的質(zhì)譜分析。

    2 結(jié)果

    2.1釀酒酵母工程菌的構(gòu)建

    利用限制性內(nèi)切酶 Not I 線性化處理質(zhì)粒pδGAPh-PGM 和 pδGAP'z-GalU,然后轉(zhuǎn)化入基礎(chǔ)工程酵母菌株 W303-1b/ES(E 表示 EXG1 基因敲除,S 表示 SPR1 基因敲除),利用含有潮霉素和博來霉素的 YPD 固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)篩選獲得的陽性克隆用 YPD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng),然后提取陽性克隆的基因組 DNA,對(duì)所整合的 PGM 和GalU 基因進(jìn)行 PCR 鑒定,結(jié)果如圖1A 和 1B所示,陰性對(duì)照菌基因組沒有 DNA 擴(kuò)增條帶,陽性對(duì)照質(zhì)粒和陽性克隆都有預(yù)期長度的 DNA 片段擴(kuò)增,再對(duì)獲得的 DNA 片段純化并進(jìn)行 DNA測(cè)序驗(yàn)證,即獲得工程菌株 W303-1b/ES/PeG(Pe表示表達(dá)大腸桿菌 PGM 基因,G 表示表達(dá)大腸桿菌 GalU 基因)。

    利用限制性內(nèi)切酶 Not I 線性化質(zhì)粒pδGAPg-SbGT34,同樣采用 LiAc 轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞 W303-1b/ES 和 W303-1b/ES/PeG,利用含有 G418 的固體 YPD 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)篩選獲得的陽性克隆用 YPD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng),然后提取陽性克隆的基因組 DNA,對(duì)所整合的SbGT34 基因進(jìn)行 PCR 鑒定,如圖1C 所示,工程菌株 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 的 3 個(gè)陽性克隆和陽性對(duì)照質(zhì)粒均有預(yù)期大小的 DNA 片段擴(kuò)增,陰性對(duì)照有一個(gè)較小的非特異性 DNA 片段擴(kuò)增;再對(duì)獲得的 DNA 片段純化并進(jìn)行 DNA 測(cè)序驗(yàn)證,即獲得工程菌株 W303-1b/ES/PeG/SbGT34。采用同樣的酵母轉(zhuǎn)化方法,篩選獲得對(duì)照工程菌株W303-1b/ES/SbGT34。

    M:DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量;1:陰性對(duì)照;2:陽性對(duì)照;3 ~ 5:陽性克隆M: DNA ladder; 1: Negative control; 2: Positive control; 3 - 5: Positively engineered strains圖1 工程酵母基因組整合的目的基因的 PCR 鑒定(A:PGM DNA 片段;B:GalU DNA 片段;C:SbGT34 DNA 片段)Figure 1 PCR verification results of genetically engineered strains with integration of three heterologous genes (A: PGM DNA fragments; B: GalU DNA fragments; C: SbGT34 DNA fragments)

    圖2 工程菌 W303-1b/ES/SbGT34 和 W303-1b/ES/PeG/ SbGT34 生物催化合成野黃芩素-7-O-葡萄糖的相對(duì)活性比較Figure 2 Differences in the level of scutellarein 7-O-glucoside produced by strains W303-1b/ES/SbGT34 and W303-1b/ES/PeG/SbGT34 over time

    圖3 釀酒酵母工程菌株合成野黃芩素-7-O-葡萄糖苷的生物合成途徑Figure 3 Schematic diagram of biosynthetic pathway of scutellarein 7-O-glucoside in engineering Saccharomyces cerevisiae

    2.2異源高表達(dá) PGM 和 GalU 基因提高工程菌W303-1b/ES/PeG/SbGT34 的葡萄糖苷反應(yīng)活性

    由于酵母細(xì)胞不具有催化黃酮類化合物葡萄糖苷化反應(yīng)的活性,在酵母細(xì)胞直接表達(dá)具有催化黃酮葡萄糖苷化的 UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 SbGT34,以野黃芩素(0.2 mmol)為底物檢測(cè)其催化活性,其生物催化合成的野黃芩素-7-O-葡萄糖苷的轉(zhuǎn)化率約 37%;酵母細(xì)胞本身具有葡萄糖苷酶水解活性,能水解糖苷化產(chǎn)物,導(dǎo)致產(chǎn)物的積累水平較低。于是敲除酵母細(xì)胞葡萄糖苷水解酶基因,使得野黃芩素的轉(zhuǎn)化率提高到 76%,該研究結(jié)果已經(jīng)另文發(fā)表。

    酵母細(xì)胞自身合成的 UDP-葡萄糖參與能量代謝、細(xì)胞壁合成等重要的生理活動(dòng),在細(xì)胞內(nèi)積累水平較低。本研究通過高表達(dá)大腸桿菌的 2 個(gè)參與 UDP-葡萄糖合成的關(guān)鍵酶 PGM 和 GalU 用來提高工程細(xì)胞的 UDP-葡萄糖的合成水平,結(jié)果表明這 2 個(gè)功能酶的表達(dá)使得野黃芩素的轉(zhuǎn)化率提高到 84%(圖2),間接地證實(shí)了 PGM 和 GalU基因的高表達(dá)能夠提高細(xì)胞內(nèi)的 UDP-葡萄糖水平。因此,工程細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的 2 個(gè)異源的 UDP-葡萄糖合成酶(PGM 和 GalU)和 UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(SbGT34)形成了一個(gè)完整的生物催化葡萄糖苷化反應(yīng)的代謝途徑(圖3)。

    2.3代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

    以最適的黃酮化合物-野黃芩素為目標(biāo)分子詳細(xì)地研究了工程酵母細(xì)胞生物催化的效率,然后以標(biāo)準(zhǔn)野黃芩素-7-O-葡萄糖苷為參照對(duì)其葡萄糖苷化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng) HPLC 分析獲得保留時(shí)間為 13.4 min 的產(chǎn)物(圖4)。再利用HPLC-ESI-MS/MS 在負(fù)離子模式進(jìn)行掃描,可以獲得母分子離子峰 m/z = 447[M-H]-和糖基斷裂產(chǎn)生的碎片離子 m/z = 285[M-H-162]-(圖5)。

    2.4不同黃酮類化合物的葡萄糖苷化

    利用工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 對(duì)其他黃酮類化合物如木犀草素、柚皮素、白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素 A、野黃芩素、黃芩素、槲皮素以及大豆黃酮等進(jìn)行了生物催化活性分析,結(jié)果表明工程菌體內(nèi)催化與體外酶促催化結(jié)果基本一致,對(duì)不同底物的葡萄糖苷化效率不同,其中對(duì)野黃芩素催化效率最高(圖6)。

    圖4 生物催化產(chǎn)物野黃芩素-7-O-葡萄糖的 HPLC 分析(A:野黃芩素-7-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn);B:野黃芩素底物;C:工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 催化野黃芩素的反應(yīng)產(chǎn)物)Figure 4 HPLC analysis of scutellarein 7-O-glucoside biosynthesized through whole-cell biocatalysis (A: Standard scutellarein-7-O-glucoside; B: Standard scutellarein; C: Products of strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 with scutellarein as a substrate)

    圖5 生物催化產(chǎn)物野黃芩素-7-O-葡萄糖的質(zhì)譜分析Figure 5 Scutellarein-7-O-glucoside was detected in negative ionisation mode

    圖6 工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 催化不同黃酮葡萄糖苷的合成Figure 6 Biotransformation of flavones into respective glucosides using the engineering strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 as biocatalyst

    3 討論

    利用生物催化法進(jìn)行藥物的葡萄糖苷化反應(yīng),反應(yīng)條件溫和,立體和區(qū)域選擇性高,是一個(gè)具有巨大潛力的藥物結(jié)構(gòu)修飾技術(shù)。目前無論是酶法還是單一表達(dá) UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的工程菌,生物催化合成葡萄糖苷都受限于 UDP-葡萄糖供體的添加,致使難以規(guī)?;糯?。為解決 UDP-葡萄糖供應(yīng)不足的難題,在大腸桿菌工程菌中進(jìn)行 UDP-葡萄糖生物合成途徑的調(diào)控,提高了細(xì)胞內(nèi) UDP-葡萄糖合成的水平,進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖苷化產(chǎn)物的積累[7, 12-13]。盡管在酵母細(xì)胞已有文獻(xiàn)報(bào)道了 UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)[8, 14-15],但工程細(xì)胞催化合成葡萄糖苷效率較低,其中一個(gè)限制因素是細(xì)胞自身具有葡萄糖苷酶活性,可逆地水解葡萄糖苷化產(chǎn)物,最終導(dǎo)致工程酵母細(xì)胞合成葡萄糖苷的滴度較低[8-9]。另一個(gè)潛在的限制因素是酵母細(xì)胞合成UDP-葡萄糖的水平較低。研究組已完成了酵母細(xì)胞葡萄糖苷酶的基因敲除,使得工程細(xì)胞葡萄糖苷的轉(zhuǎn)化效率有了大幅度提高。本研究目的是探索提高酵母細(xì)胞內(nèi) UDP-葡萄糖的水平對(duì)工程細(xì)胞葡萄糖苷反應(yīng)活性的影響。研究結(jié)果表明在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)大腸桿菌參與 UDP-葡糖合成的 2 個(gè)關(guān)鍵酶PGM 和 GalU,使得模式分子野黃芩素-7-O-葡萄糖苷的合成效率得到進(jìn)一步提高,間接地證實(shí)在酵母細(xì)胞內(nèi)大腸桿菌 PGM 和 GalU 的表達(dá)能促進(jìn)宿主細(xì)胞 UDP-葡萄糖的合成,為利用工程酵母細(xì)胞生物催化合成葡萄糖苷類的藥物結(jié)構(gòu)修飾提供了理論和實(shí)踐借鑒。

    所構(gòu)建的工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 不僅可以催化野黃芩素發(fā)生葡萄糖苷化反應(yīng),也對(duì)其他黃酮類化合物具有較高的催化活性。工程細(xì)胞催化的這些黃酮類化合物如白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素 A、野黃芩素、黃芩素和大豆黃酮僅合成單一的葡萄糖苷;而催化柚皮素體系產(chǎn)生了 2 個(gè)葡萄糖苷產(chǎn)物;黃酮分子母核含有 3-羥基或 3',4'-二羥基的槲皮素和木犀草素則被催化產(chǎn)生 3 個(gè)和 4 個(gè)葡萄糖苷產(chǎn)物,這些葡萄糖苷化合物結(jié)果還需要進(jìn)一步鑒定。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Ahmadi A, Shadboorestan A. Oxidative stress and cancer; the role of hesperidin, a citrus natural bioflavonoid, as a cancer chemoprotective agent. Nutr Cancer, 2016, 68(1):29-39.

    [2] Gormaz JG, Quintremil S, Rodrigo R. Cardiovascular disease: a target for the pharmacological effects of quercetin. Curr Top Med Chem,2015, 15(17):1735-1742.

    [3] Li M, Han X, Yu B. Facile synthesis of flavonoid 7-O-glycosides. J Org Chem, 2003, 68(17):6842-6845.

    [4] Simkhada D, Kim E, Lee HC, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the biological synthesis of 7-O-xylosyl naringenin. Mol Cells, 2009, 28(4):397-401.

    [5] Poppenberger B, Berthiller F, Bachmann H, et al. Heterologous expression of arabidopsis UDP-glucosyltransferases in Saccharomyces cerevisiae for production of zearalenone-4-O-glucoside. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(6):4404-4410.

    [6] Kim BG, Yang SM, Kim SY, et al. Biosynthesis and production of glycosylated flavonoids in Escherichia coli: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(7):2979-2988.

    [7] De Bruyn F, De Paepe B, Maertens J, et al. Development of an in vivo glucosylation platform by coupling production to growth: Production of phenolic glucosides by a glycosyltransferase of Vitis vinifera. Biotechnol Bioeng, 2015, 112(8):1594-1603.

    [8] Werner SR, Morgan JA. Expression of a dianthus flavonoidglucosyltransferase in Saccharomyces cerevisiae for whole-cell biocatalysis. J Biotechnol, 2009, 142(3-4):233-241.

    [9] Schmidt S, Rainieri S, Witte S, et al. Identification of a Saccharomyces cerevisiae glucosidase that hydrolyzes flavonoid glucosides. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(5):1751-1757.

    [10] Tang L, Wang W, Zhou WL, et al. Three-pathway combination for glutathione biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact, 2015, 14:139.

    [11] Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc, 2007, 2(1):31-34.

    [12] Kim HJ, Kim BG, Ahn JH. Regioselective synthesis of flavonoid bisglycosides using Escherichia coli harboring two glycosyltransferases. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(12):5275-5282.

    [13] Pandey RP, Parajuli P, Koirala N, et al. Glucosylation of isoflavonoids in engineered Escherichia coli. Mol Cells, 2014, 37(2):172-177.

    [14] Yamazaki M, Gong Z, Fukuchi-Mizutani M, et al. Molecular cloning and biochemical characterization of a novel anthocyanin 5-O-glucosyltransferase by mRNA differential display for plant forms regarding anthocyanin. J Biol Chem, 1999, 274(11):7405-7411.

    [15] Yamazaki M, Yamagishi E, Gong Z, et al. Two flavonoid glucosyltransferases from Petunia hybrida: molecular cloning,biochemical properties and developmentally regulated expression. Plant Mol Biol, 2002, 48(4):401-411.

    www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):229-235

    Optimization of biosynthetic pathway of uridine diphosphate glucose in yeast for production of flavonoid glucosides

    WANG Hui-min, YANG Yan, TIAN Lei-yu, ZHOU Wen-long, WANG Wei

    【Abstract】

    ObjectiveTo investigate the effect of expression of phosphoglucomutase and UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase [two key enzymes in the pathway of synthesizing uracil diphosphate glucose (UDP-glucose)] from Escherichia coli on glucosylation capacity of engineering yeast.

    MethodsIn order to up-regulate the biosynthetic pathway of UDP-glucose of Saccharomyces cerevisiae, the two genes encoding phosphoglucomutase (PGM) and UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase (GalU) of E. coli were amplified by PCR and then inserted into the yeast integration vectors. The resulting plasmids were linearized by restriction enzyme Not I and transformed into the engineering strain. The integration expression plasmid pδGAPg-SbGT34 with a UDP-glucose flavonoid glucosyltransferase gene cloned from Scutellaria baicalensis Georgi was also constructed and further integrated into the basic engineering strain W303-1b/ES/PeG. The effect of high expression of PGM and GalU on production of flavonoid glucosides was investigated using the engineered strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 as whole-cell biocatalyst under the flask culture condition.

    ResultsThe engineering strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 with the high expression of PGM and GalU genes involving the biosynthesis of UDP-glucose together with the glucosyltransferase was successfully constructed. Its production of scutellarein 7-O-glucoside was further improved in comparison with that of strain W303-1b/ES/SbGT34. It is indicated that the expression of heterologous PGM and GalU genes of E. coli contributes to the synthesis of endogenous UDP-glucose of engineering strain. The resulting strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 also glucosylated the flavonoids such as luteolin, naringenin, chrysin, wogonin, orohylin A, baicalein, quercetin and daidzein.

    ConclusionThe synthesis of endogenous UDP-glucose of yeast was boosted through the co-expression of PGM and GalU genes isolated from E. coli, which improves the glycosylation capacity of the engineered strain along with expression of a UDP-glucose falvonoid glucosyltransferase.

    【Key words】Flavores;Uridine diphosphate glucose;Saccharomyces cerevisiae;Phosphoglucomutase;Glucosyltransferase Author Affiliation: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of National Health and Family Planning Commission, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 100050 Beijing, China

    DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.006

    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(81072562);“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX09301002)

    通信作者:王偉,Email:wwang@imm.ac.cn

    收稿日期:2016-04-05

    Corresponding Author:WANG Wei, Email: wwang@imm.ac.cn

    猜你喜歡
    黃酮類
    MS-DAIL聯(lián)合MS-FINDER鑒定中藥黃酮類化合物
    HPLC法同時(shí)測(cè)定白梅花中6種黃酮類成分
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:46
    山楂中一個(gè)具有抗菌活性的黃酮類新化合物
    膜莢黃芪葉黃酮類成分的研究
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:53
    南嶺栲葉黃酮類成分的研究
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:11
    黃芩黃酮類成分純化工藝的優(yōu)化
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:48
    藥桑葉黃酮類成分的研究
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:34
    益智莖葉中黃酮類化學(xué)成分研究
    臘梅花中黃酮類化合物的UHPLC/QTOF-MS分析
    中成藥(2014年11期)2014-02-28 22:29:58
    黃酮類化合物抗心肌缺血再灌注損傷研究進(jìn)展
    中成藥(2014年10期)2014-02-28 22:29:33
    贵南县| 涿鹿县| 营山县| 遵化市| 丰都县| 奉化市| 多伦县| 宜良县| 安泽县| 哈尔滨市| 衡水市| 沙坪坝区| 钦州市| 多伦县| 澎湖县| 巴林左旗| 镇巴县| 夹江县| 开封县| 富宁县| 文成县| 塔城市| 霍城县| 福海县| 清水河县| 舒城县| 日土县| 璧山县| 武胜县| 云和县| 景宁| 昌图县| 饶平县| 乐昌市| 重庆市| 梧州市| 惠州市| 平舆县| 通道| 石城县| 内乡县|