萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌的篩選和基因型分析

孫瑯，劉建華，聶彤穎，胡辛欣，李聰然，游雪甫

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萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌的篩選和基因型分析

孫瑯，劉建華，聶彤穎，胡辛欣，李聰然，游雪甫

【摘要】

目的對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的 325 株腸球菌進(jìn)行萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌篩選，并對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行耐藥表型、耐藥基因型、菌株同源性分析。

方法采用瓊脂平皿二倍稀釋法篩選萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌，并檢測(cè)菌株對(duì)替考拉寧的敏感性；采用 PCR 方法檢測(cè)萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌的耐藥基因型；通過(guò)腸道細(xì)菌基因間重復(fù)一致序列（ERIC）PCR 技術(shù)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）技術(shù)、多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)進(jìn)行菌株的同源性分析。

結(jié)果從 325 株臨床分離腸球菌中共篩選出 17 株萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌，包括 1 株糞腸球菌、11 株屎腸球菌和5 株鶉雞腸球菌。其中 1 株糞腸球菌和 11 株屎腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素顯示高水平耐藥，對(duì)替考拉寧耐藥或中介耐藥，PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示 vanA 型；5 株鶉雞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素中介耐藥，對(duì)替考拉寧敏感，PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示 vanC1 型。ERIC 同源性分析顯示同基因型的大多數(shù)菌株顯示相似的分型；PFGE 同源性分析顯示，17 株臨床萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌分型不同，不屬于單克隆流行播散；MLST 同源性分析顯示，1 株臨床萬(wàn)古霉素非敏感糞腸球菌屬于 ST4，11 株臨床萬(wàn)古霉素非敏感屎腸球菌共分為 6 個(gè) ST 型，其中 4 株屬于 ST78，是屎腸球菌出現(xiàn)頻率最高的 ST 型。

結(jié)論我國(guó)萬(wàn)古霉素耐藥菌在糞腸球菌中分離率較低，但屎腸球菌中萬(wàn)古霉素耐藥情況較嚴(yán)重，并且耐藥菌株攜帶易于傳播和轉(zhuǎn)移的 vanA 基因。同源性分析結(jié)果顯示萬(wàn)古霉素耐藥存在同源性傳播的可能性。

【關(guān)鍵詞】糞腸球菌；屎腸球菌；萬(wàn)古霉素抗藥性；基因型；多位點(diǎn)測(cè)序分型；腸道細(xì)菌基因間重復(fù)一致序列

www.cmbp.net.cn中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):206-215

作者單位：100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所藥理室（孫瑯、聶彤穎、胡辛欣、李聰然、游雪甫）；075000 張家口，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科（劉建華）

腸球菌是一種較常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性條件致病球菌，可導(dǎo)致人體多臟器感染，其中糞腸球菌和屎腸球菌是導(dǎo)致人體感染的常見(jiàn)腸球菌，而其他類(lèi)型腸球菌如鉛黃腸球菌、鶉雞腸球菌等也時(shí)有致病情況出現(xiàn)。萬(wàn)古霉素為糖肽類(lèi)抗生素，被用作“最后一道防線”治療對(duì)其他抗生素?zé)o效的嚴(yán)重革蘭陽(yáng)性菌感染，如嚴(yán)重腸球菌感染。而萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌（vancomycin resistant enterococci，VRE）的出現(xiàn)對(duì)臨床治療帶來(lái)了極大的困難。1988 年，英國(guó)倫敦首次報(bào)道 VRE［1-2］，此后在多個(gè)國(guó)家都分離出VRE 菌株，并且 VRE 分離率出現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。美國(guó) VRE 感染率 1989 年為 0.4%，而 2005 年則上升到 28% 左右［3］，2013 年 VRE 院內(nèi)感染率達(dá)到了 30%。美國(guó)每年約有 20 000 人感染 VRE，約 1300 人死亡［4］。在歐洲，由于阿伏帕星早期在畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致動(dòng)物腸道 VRE 菌株大量存在［5］。我國(guó) VRE 發(fā)生率相對(duì)較低，一直穩(wěn)定在3% ～ 5% 之間，但近年來(lái)屎腸球菌在整個(gè)腸球菌中所占的比例在上升，而 VRE 主要出現(xiàn)在屎腸球菌中。CHINET 細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌分離率 2005 年為 0.35%［6］，而2014 年上升至 4.2%［7］。

目前還沒(méi)有有效治療 VRE 感染的藥物，臨床上主要通過(guò) VRE 耐藥表型來(lái)選擇治療藥物。根據(jù)菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平及耐藥基因簇的差異，可將 VRE 分為 9 種表型，vanA、vanB、vanC（C1、C2、C3）、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM 和 vanN［8-12］。其中 vanA、vanB、vanD 和 vanM 型介導(dǎo)合成以 D-丙氨酸-D-乳酸結(jié)尾的肽聚糖前體，而 vanC、vanE、vanG、vanL 和vanN 型介導(dǎo)合成以 D-丙氨酸-D-絲氨酸結(jié)尾的肽聚糖前體，兩種前體對(duì)糖肽類(lèi)親和力降低（與天然的以 D-丙氨酸-D-丙氨酸結(jié)尾的前體相比），從而表現(xiàn)出對(duì)糖肽類(lèi)的耐藥性。vanA 型和 vanB 型是具有重要臨床意義的耐藥表型，兩者耐藥菌株多見(jiàn)于屎腸球菌和糞腸球菌。vanA 型耐藥的 VRE 對(duì)萬(wàn)古霉素呈現(xiàn)高水平耐藥（MIC 64 ～ ＞ 512 μg/ml），可以由萬(wàn)古霉素和替考拉寧誘導(dǎo)產(chǎn)生，多由質(zhì)粒介導(dǎo)，耐藥基因位于轉(zhuǎn)座子 Tn1546 上，易于轉(zhuǎn)移。vanB 耐藥表型對(duì)萬(wàn)古霉素呈現(xiàn)異質(zhì)性的耐藥，而對(duì)替考拉寧表現(xiàn)為敏感。vanB 型耐藥基因多位于宿主染色體上，也可存在于質(zhì)粒上，耐藥性也可被轉(zhuǎn)移。vanC 耐藥多見(jiàn)于低水平萬(wàn)古霉素耐藥（MIC 4 ～ 32 μg/ml）的天然菌株，如鉛黃腸球菌或鶉雞腸球菌等，并且對(duì)替考拉寧敏感。本研究中，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的 2006 - 2012 年臨床分離的 325 株腸球菌進(jìn)行了萬(wàn)古霉素耐藥性的篩選，并對(duì)篩選出的 VRE 進(jìn)行了耐藥基因型分析，以期為應(yīng)對(duì)VRE 感染和抗 VRE 藥物研發(fā)提供支持和參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株實(shí)驗(yàn)菌株為 2006 - 2012 年從北京地區(qū)醫(yī)院患者尿液、痰液、血液、分泌物等標(biāo)本中分離的 325 株腸球菌，包括 208 株糞腸球菌，111 株屎腸球菌和 6 株其他腸球菌（鉛黃腸球菌、鶉雞腸球菌）。質(zhì)控菌糞腸球菌 ATCC29212、糞腸球菌 ATCC51299（vanB）、糞腸球菌 ATCC700802、糞腸球菌 ATCC51575、屎腸球菌 ATCC700221 （vanA）購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物中心（ATCC），菌株經(jīng) VITEK 2-compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定后使用。對(duì)于篩選出的萬(wàn)古霉素非敏感菌株用 16S rRNA 測(cè)序法再次確定菌株類(lèi)型。

1.1.2試劑萬(wàn)古霉素、替考拉寧為中國(guó)食品藥品檢定研究院標(biāo)準(zhǔn)品；BHI 瓊脂為美國(guó) BD 公司產(chǎn)品；GoTaq Green MasterMix 為美國(guó) Promega 公司產(chǎn)品；溶菌酶為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；變?nèi)芫貫槊绹?guó) Sigma 公司產(chǎn)品；蛋白酶 K、限制性?xún)?nèi)切酶 Sma I 為日本 Takara 公司產(chǎn)品；MidRange PFG marker I 為美國(guó) BioLabs 公司產(chǎn)品；PCR 引物的合成和產(chǎn)物測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.3主要儀器PCR 擴(kuò)增儀為美國(guó) AB 公司產(chǎn)品；全自動(dòng)微生物分析鑒定儀為法國(guó) Bio-Merieux公司產(chǎn)品；凝膠成像儀和脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀為美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌篩選通過(guò)瓊脂平皿二倍稀釋法測(cè)定受試腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性（最小抑菌濃度），篩選萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌。所用培養(yǎng)基為含 5% 無(wú)菌羊血的 MH 瓊脂。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌液適當(dāng)稀釋后，接種于含不同萬(wàn)古霉素濃度的血平皿中，使接種量為104CFU/點(diǎn)，37 ℃ 培養(yǎng) 24 h，肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為最小抑菌濃度。萬(wàn)古霉素受試濃度為 0.03 ～ 128 μg/ml。以萬(wàn)古霉素敏感菌糞腸球菌ATCC29212 和萬(wàn)古霉素耐藥糞腸球菌ATCC51299 為質(zhì)控菌。腸球菌的萬(wàn)古霉素敏感性標(biāo)準(zhǔn)為：≤ 4 μg/ml，敏感；8 ～ 16 μg/ml，中介；≥32 μg/ml，耐藥［13］。

1.2.2萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌的耐藥表型測(cè)定對(duì)篩選出的萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌，測(cè)定其對(duì)替考拉寧的敏感性，根據(jù)菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧的 MIC 值獲得其耐藥表型特征。菌株對(duì)替考拉寧的最小抑菌濃度測(cè)定方法同萬(wàn)古霉素，替考拉寧受試濃度范圍為 0.03 ～ 128 μg/ml。腸球菌的替考拉寧敏感性標(biāo)準(zhǔn)為：≤ 8 μg/ml，敏感；16 μg/ml，中介；≥ 32 μg/ml，耐藥［13］。

1.2.3萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌耐藥基因的 PCR檢測(cè)對(duì)篩選出的萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌，用 PCR方法檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因 vanA、vanB、vanC1、vanC2/3。參考文獻(xiàn)［14］設(shè)計(jì)引物，所用引物及擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1。水煮法提取染色體 DNA 制備PCR 模板，方法為取劃線于 BHI 瓊脂平皿上的新鮮菌落 3 ～ 5 個(gè)，懸于 50 μl ddH2O 中，煮沸 10 ～15 min；離心取上清。PCR 反應(yīng)條件為 95 ℃ 預(yù)變性 3 min；95 ℃ 變性 30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，重復(fù) 35 個(gè)循環(huán)，而后再 72 ℃ 延伸5 min。PCR 結(jié)束后用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并取不同基因型陽(yáng)性菌株條帶測(cè)序鑒定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不含耐藥基因的萬(wàn)古霉素敏感菌糞腸球菌ATCC29212 為陰性質(zhì)控，而含耐藥基因 vanA 或vanB 的糞腸球菌 ATCC51299（vanB）、糞腸球菌ATCC700802（vanB）、糞腸球菌 ATCC51575 （vanB）、屎腸球菌 ATCC700221（vanA）為陽(yáng)性質(zhì)控。每個(gè)菌株至少重復(fù) 2 次實(shí)驗(yàn)。

1.2.4ERIC-PCR 技術(shù)進(jìn)行菌株的同源性分析用 ERIC-PCR 分析［15］實(shí)驗(yàn)菌株的同源性。所用引物為 ERIC-P，序列見(jiàn)表1。菌株總 DNA 提取方法如前所述。ERIC-PCR 體系為 20 μl，引物終濃度為 0.25 μmol/L。PCR 反應(yīng)條件為 95 ℃ 預(yù)變性 7 min；94 ℃ 變性 1 min，36 ℃ 退火 1 min，65 ℃ 延伸 8 min，重復(fù) 32 個(gè)循環(huán)；而后再 65 ℃延伸 16 min。PCR 結(jié)束后用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)菌株 ERIC-PCR 條帶特點(diǎn)分型，主、副帶均相同判定為同一型；主帶相同、副帶不同判定為同一型的不同亞型；主帶不同判定為不同型。

1.2.5PFGE 技術(shù)進(jìn)行菌株的同源性分析對(duì)篩選得到的臨床非敏感腸球菌，采用 PFGE 分析菌株同源性［16］。挑取單個(gè)菌落于 4 ml 腦心湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 靜止培養(yǎng)過(guò)夜至 OD610 nm為 1.3 ～ 1.4，取 300 μl 菌液離心取沉淀（12 000 r/min、2 min）。用 150 μl CSB 緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，pH 8.0）重懸菌體沉淀，加入3 μl 濃度為 100 mg/ml 的溶菌酶和 3 μl 濃度為1 kU/ml 變?nèi)芫赜?37 ℃ 孵育 5 min，向菌體中加入 150 μl 1% 低熔點(diǎn)瓊脂糖灌注模型。模塊凝固后置于加入 35 μl 溶菌酶和 10 μl 變?nèi)芫氐?00 μl TE 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）中孵育 4 h，棄去裂解液，用 TE 緩沖液洗滌 2 遍，加入 1 ml CLB（50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，pH 8.0，加 1% 十二烷基肌氨酸鈉）緩沖液和 40 μl 濃度為 20 mg/ml的蛋白酶 K，于 54 ℃ 條件下消化過(guò)夜。用 1 ml水洗 2 次，再用 TE 洗 3 遍，在第 1、2 次洗滌時(shí)加入 1 mmol/L PMSF 使殘余的蛋白酶 K 失活。用刀片切下約 2 mm 的膠，加入 40 U 限制性?xún)?nèi)切酶 Sma I 于 37 ℃ 下酶切 2 h，上樣跑膠。糞腸球菌、屎腸球菌電泳程序?yàn)殡妷海? V，脈沖時(shí)間：1 ～ 20 s，電泳時(shí)間：20 h。鶉雞腸球菌電泳程序?yàn)殡妷海? V，脈沖時(shí)間：1 ～ 15 s，電泳時(shí)間：20 h。采用 Quantity One 軟件繪制菌株進(jìn)化樹(shù)。

表1　萬(wàn)古霉素耐藥基因 PCR 檢測(cè)及 ERIC 分型所用引物Table 1　Primers used in PCR detection of the vancomycin resistance gene and ERIC typing

表2　屎腸球菌 MLST 分型 7 個(gè)等位基因所用引物Table 2　Primers used in MLST of Enterococcus faecium

1.2.6MLST 技術(shù)進(jìn)行菌株的同源性分析擴(kuò)增7 個(gè)內(nèi)源性管家基因，反應(yīng)條件及引物序列參考MLST 網(wǎng)站（http：//www.mlst.net/），屎腸球菌擴(kuò)增基因分別是 adk、atpA、ddl、purK、pstS、gyd、gdh，引物序列見(jiàn)表2，糞腸球菌擴(kuò)增基因分別是gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yiqL，引物序列見(jiàn)表3，所有 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，參考eBURST v.3 軟件系統(tǒng)確定單克隆復(fù)雜性菌株之間的單個(gè)位點(diǎn)的變異信息，從而快速獲得該菌株的流行病學(xué)方面信息。

表3　糞腸球菌 MLST 分型 7 個(gè)等位基因所用引物Table 3　Primers used in MLST of Enterococcus faecalis

2　結(jié)果

2.1萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌篩選

測(cè)定 325 株腸球菌的萬(wàn)古霉素最小抑菌濃度，結(jié)果顯示有 17 株為萬(wàn)古霉素非敏感菌，包括1 株糞腸球菌，11 株屎腸球菌和 5 株鶉雞腸球菌。208 株糞腸球菌中檢測(cè)出 1 株萬(wàn)古霉素耐藥菌，檢出率為 0.5%。111 株屎腸球菌中共檢出11 株萬(wàn)古霉素耐藥菌，檢出率為 10%。6 株其他腸球菌中共檢出 5 株萬(wàn)古霉素中介耐藥腸球菌，檢出率為 83.3%。檢出的萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的最小抑菌濃度見(jiàn)表4。

2.2萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌的耐藥表型測(cè)定

對(duì)篩選出的 17 株萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌（12 株萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌和 5 株萬(wàn)古霉素中介耐藥腸球菌），進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)替考拉寧的敏感性，根據(jù)菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧的MIC 值獲得菌株的糖肽類(lèi)耐藥表型特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1 株萬(wàn)古霉素耐藥糞腸球菌和 9 株萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧均顯示較高水平的耐藥；2 株屎腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素顯示較高水平的耐藥，而對(duì)替考拉寧顯示中介耐藥（MIC = 16 μg/ml）；5 株鶉雞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素顯示中介耐藥（MIC = 8 μg/ml），對(duì)替考拉寧敏感（MIC 范圍為 0.06 ～ 0.5 μg/ml）。

2.3萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌耐藥基因的 PCR 檢測(cè)

對(duì)篩選出的萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌，用 PCR方法檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因 vanA、vanB、vanC1、vanC2/3。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中平行進(jìn)行萬(wàn)古霉素敏感腸球菌（臨床菌及標(biāo)準(zhǔn)菌）和萬(wàn)古霉素耐藥標(biāo)準(zhǔn)腸球菌的耐藥基因擴(kuò)增，作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，實(shí)驗(yàn)菌株電泳圖譜見(jiàn)圖1。所有 17 株萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌中均檢測(cè)到萬(wàn)古霉素耐藥基因，其中 1 株萬(wàn)古霉素耐藥糞腸球菌和 11 株萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌為 vanA 型，對(duì)萬(wàn)古霉素中介耐藥的 5 株鶉雞腸球菌為 vanC1 型，所有菌株中均未擴(kuò)增出 vanB 基因。將部分陽(yáng)性菌株 PCR 產(chǎn)物送樣測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示與 PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)一致。

2.4用 ERIC-PCR 技術(shù)進(jìn)行菌株的同源性分析

應(yīng)用 ERIC-PCR 技術(shù)對(duì)包括萬(wàn)古霉素非敏感臨床分離腸球菌、萬(wàn)古霉素敏感標(biāo)準(zhǔn)菌、萬(wàn)古霉素耐藥標(biāo)準(zhǔn)菌及萬(wàn)古霉素敏感臨床分離菌的共 28 株菌進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見(jiàn)表4 和圖2。根據(jù)ERIC 圖譜特點(diǎn)，28 株菌株共分為 9 個(gè)譜型。糞腸球菌 VSE 標(biāo)準(zhǔn)菌 ATCC29212 顯示出與臨床分離 VSE 糞腸球菌 0911 相似的 A 型 ERIC 圖譜。VanB 型 VRE 糞腸球菌 ATCC51299、糞腸球菌 EFL4041、糞腸球菌 ATCC700802 具有相似的B 型 ERIC 圖譜，并且該圖譜與糞腸球菌 HH22相近，而同屬于 VanB 型的糞腸球菌 ATCC51575則顯示出與此不同的 C 型圖譜，說(shuō)明該菌株與上述菌株同源性較差。VanA 型糞腸球菌 0909 顯示出與 VSE 糞腸球菌 0910 相似的 E 型譜圖。VanA 標(biāo)準(zhǔn)屎腸球菌 ATCC700221 與臨床分離VSE 屎腸球菌 0809 和臨床分離 VanA 型屎腸球菌 1202 顯示相似的 G 型譜圖。而大多數(shù) VanA屎腸球菌則顯示 F 型譜圖。VanA 型屎腸球菌的其他譜圖類(lèi)型還包括 H 型和 I 型。VanA 型屎腸球菌 0607、0925、1104 和 VanC1 型鶉雞腸球菌0610 未檢測(cè)出 ERIC 圖譜，而 VanC1 型鶉雞腸球菌均顯示 D 型譜圖。

表4　實(shí)驗(yàn)所用腸球菌表型、基因型及 ERIC 分型結(jié)果Table 4　Phenotype， genotype and ERIC typing analysis results for the tested enterococci

A： vanA； B： vanB； C： vanC1； 1： E. faecalis ATCC29212 （VSE）； 2： E. faecalis 0910 （VSE）； 3： E. faecium ATCC700221 （vanA positive）； 4： E. faecalis 0909；5： E. faecium 1103； 6： E. faecalis ATCC51299 （vanB positive）； 7： E. faecalis ATCC51575 （vanB positive）； 8： E. faecalis EFL4041； 9： E. gallinarum 0810；10： E. gallinarum 0926； 11： E. gallinarum 0610； 12： E. gallinarum 0614； M： Marker圖1　萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌基因型檢測(cè)代表性圖譜Figure 1　Electrophoresis analysis figures for genotype detection of representative vancomycin nonsusceptible enterococci

M： Marker； 1 - 6， 8 - 10： E. faecalis ATCC29212， ATCC51299， EFL4041， ATCC700802， ATCC51575， HH22， 0909， 0910， 0911； 7， 11， 13， 14，15： E. gallinarum 0810， 0926， 0609， 0610， 0614； 12， 16 - 28： E. faecium 0607， 0628， 0629， ATCC700221， 0809， 0810， 0811， 0830， 0921， 0925， 1103， 1104，1201， 1202圖2　萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌的 ERIC-PCR 電泳檢測(cè)圖譜Figure 2　Electrophoresis analysis of ERIC-PCR results from vancomycin nonsusceptible enterococci

2.5用 PFGE 技術(shù)進(jìn)行菌株的同源性分析

采用 PFGE 技術(shù)對(duì) 17 株萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌進(jìn)行同源性分析，屎腸球菌采用ATCC700802作為對(duì)照，糞腸球菌采用 ATCC29212 作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖3 和圖4。結(jié)果顯示，17 株腸球菌表現(xiàn)出不同的同源性，糞腸球菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌不同種屬之間差異較大，同源性系數(shù)均在 50%以下，同屬于屎腸球菌的 11株 vanA 型耐藥菌株不屬于同一型，可見(jiàn)不屬于單克隆流行播散。

2.6用 MLST 技術(shù)進(jìn)行菌株的同源性分析

采用 MLST 技術(shù)對(duì) 11株臨床萬(wàn)古霉素非敏感屎腸球菌和 1 株萬(wàn)古霉素非敏感糞腸球菌進(jìn)行同源性分析。屎腸球菌以 ATCC700221 作為對(duì)照，糞腸球菌以 ATCC51299 作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表5和表6。萬(wàn)古霉素非敏感屎腸球菌共分為 6 個(gè) ST型，其中兩株為 ST17，兩株為 ST323 型，四株為ST78，另三株分別屬 ST571、ST262、ST203，ST78、ST203、ST17 屬于同一個(gè)克隆復(fù)合型 CC17。1 株臨床的萬(wàn)古霉素非敏感糞腸球菌屬于 ST4 型。

M： MidRange PFG marker I （15.0， 33.5， 48.5， 63.5， 82.0， 97.0， 112.0， 130.5， 145.5， 160.5， 179.0， 194.0， 209.0， 227.5， 242.5， 257.5， 276.0， 291.0）； 1， 2， 4 - 12：E. faecium ATCC700802， 0607， 0628， 0629， 0811， 0830， 0921， 0925， 1103， 1201， 1202； 13 - 14： E. faecalis ATCC29212， 0909； 3， 15 - 18： E. gallinarum 0610，0609， 0614， 0810， 0926圖3　萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌的 PFGE 電泳圖Figure 3　Electrophoresis analysis of PFGE results from vancomycin nonsusceptible enterococci

圖4　萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌的 PFGE 聚類(lèi)圖Figure 4　Hierarchical cluster analysis of PFGE results from vancomycin nonsusceptible enterococci

3　討論

萬(wàn)古霉素作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，通過(guò)與細(xì)菌胞壁上的以 D-丙氨酸-D-丙氨酰為末端的肽聚糖前體小肽特異性結(jié)合使細(xì)菌細(xì)胞壁合成受阻而死亡。萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌由于可產(chǎn)生一種以 D-丙氨酸-D-乳酸或 D-丙氨酸-D-絲氨酸為末端的肽聚糖前體，使萬(wàn)古霉素與之無(wú)法結(jié)合而耐藥。根據(jù)菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平，VRE 可分為多種表型，其中具有重要臨床意義的耐藥表型為vanA 型以及 vanB 型，兩者耐藥菌株多見(jiàn)于屎腸球菌和糞腸球菌，表現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素的高水平耐藥或異質(zhì)性耐藥，并且易于轉(zhuǎn)移。而 vanC 型耐藥通常是固有型的，主要存在于鶉雞腸球菌（vanC1 型）或鉛黃腸球菌、黃色腸球菌（vanC2/3）等［17-18］，對(duì)萬(wàn)古霉素低水平耐藥。

本研究中，我們通過(guò)瓊脂平皿篩選法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的 325 株北京地區(qū)臨床分離腸球菌進(jìn)行了VRE 菌株篩選，并進(jìn)一步檢測(cè)了這些菌株對(duì)替考拉寧的敏感性。結(jié)果共篩選出 17 株萬(wàn)古霉素非敏感菌，包括 1 株糞腸球菌，11 株屎腸球菌和 5 株鶉雞腸球菌。其中 208 株糞腸球菌中檢測(cè)出 1 株VRE，檢出率為 0.5%。111 株屎腸球菌中檢出11 株 VRE，檢出率為 10%。而 6 株其他腸球菌中共檢出 5 株萬(wàn)古霉素中介耐藥腸球菌，檢出率為 83.3%。結(jié)果與已有報(bào)道相近，VRE 在我國(guó)糞腸球菌中檢出率低，但在屎腸球菌中占有較高的比例［6-7， 18-19］，值得注意。對(duì)這些菌株進(jìn)一步的替考拉寧敏感度測(cè)定結(jié)果顯示，糞腸球菌 VRE 和大多數(shù)屎腸球菌 VRE 菌對(duì)替考拉寧耐藥，呈現(xiàn) VanA 型表型；5 株鶉雞腸球菌 VRE 對(duì)替考拉寧敏感，呈現(xiàn) VanC 型表型。

表5　糞腸球菌 MLST 分型結(jié)果Table 5　MLST typing analysis results for the tested Enterococcus faecalis

表6　屎腸球菌 MLST 分型結(jié)果Table 6　MLST typing analysis results for the tested Enterococcus faecium

對(duì)萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌進(jìn)行 vanA、vanB、vanC 的 PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與表型一致，萬(wàn)古霉素耐藥、替考拉寧耐藥的糞腸球菌和屎腸球菌VRE 顯示 vanA 陽(yáng)性 PCR 結(jié)果，而萬(wàn)古霉素中度敏感、替考拉寧敏感的鶉雞腸球菌則顯示 vanC1陽(yáng)性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn) vanB 型 VRE。VanA型萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧均耐藥，并且耐藥性易于轉(zhuǎn)移至其他腸球菌，甚至金黃色葡萄球菌［20］，對(duì)臨床危害大。

用于分子流行病學(xué)研究的技術(shù)包括擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機(jī)引物擴(kuò)增 DNA 多態(tài)性分型（random amplified polymorphim DNA，RAPD）、PFGE、MLST、ERIC-PCR 等，其中 ERIC-PCR 具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高等特點(diǎn)，在分子流行病學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。ERIC 序列［14］是主要存在于腸道細(xì)菌基因間的重復(fù)序列，可以形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，定位于基因組內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域或者與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的區(qū)域。該序列長(zhǎng) 124 ～ 127 bp，并且在其中心存在高度保守、長(zhǎng)約 40 bp 的核心反向重復(fù)序列。ERIC-PCR 技術(shù)是利用 ERIC 核心的高度保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增兩個(gè) ERIC 序列之間的 DNA 片段。本研究中以 ERIC 序列為引物的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增腸球菌的基因，對(duì)其進(jìn)行分子流行病學(xué)研究。ERIC 受試菌株共分為9 個(gè) ERIC 譜型，其中本次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出的臨床分離 vanA 型 VRE 糞腸球菌 0909 顯示出與 VSE糞腸球菌 0910 相似的 E 型譜圖。11 株 vanA 型臨床分離 VRE 屎腸球菌中，3 株未檢測(cè)到 ERIC譜圖，5 株顯示 F 型譜圖，1 株顯示 H 型譜圖，1 株顯示 I 型譜圖，而臨床分離 vanA 型屎腸球菌 1202 與 vanA 型標(biāo)準(zhǔn)屎腸球菌 ATCC700221和臨床分離 VSE 屎腸球菌 0809 顯示相似的 G型譜圖。4 株 vanC1 型鶉雞腸球菌顯示 D 型譜圖，而 1 株vanC1 型鶉雞腸球菌 0610 未檢測(cè)到ERIC 條帶。上述結(jié)果顯示，檢測(cè)到 ERIC 條帶的8 株 vanA 型屎腸球菌 5 株具有相似的 ERIC 圖譜（F 型），說(shuō)明萬(wàn)古霉素耐藥存在同源性傳播的可能性。同時(shí)，vanA 型糞腸球菌 0909 和 vanA 型屎腸球菌 1202 分別與相應(yīng)的敏感菌株具有類(lèi)似的 ERIC 圖譜，說(shuō)明耐藥菌株可能經(jīng)由敏感菌株獲得 vanA 耐藥基因而產(chǎn)生。PFGE 適用于比較確定的高度變異片段，具有高分辨力，但是不適用于進(jìn)行全面的流行病學(xué)調(diào)查，且不同實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性較差，而 MLST 具有一套標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)，在不同實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性較好，可用來(lái)比較進(jìn)化較慢的位點(diǎn)。采用 PFGE 技術(shù)和 MLST 技術(shù)分析臨床萬(wàn)古霉素非敏感腸球菌分子流行病學(xué)特征，PFGE 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明萬(wàn)古霉素非敏感屎腸球菌 81.8%（9/11）相似性在 55% 以上，屎腸球菌、糞腸球菌、鶉雞腸球菌不同種屬之間差異較大。MLST 分型結(jié)果將所有的萬(wàn)古霉素非敏感屎腸球菌分成六型（ST17、ST78、ST203、ST323、ST571、ST262），其中 ST17、ST203、ST571、ST262 占 9.1%，ST78 占 36.3%，ST323 占 18.2%。萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌分型結(jié)果與國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌的流行株分型情況相似［21-23］，均含有 ST78 和 ST203，ST78 是傳播最為廣泛的一個(gè) ST 型，ST17、ST203、ST78、ST323 屬于同一個(gè)克隆復(fù)合型 CC17。CC17 克隆株是醫(yī)院的優(yōu)勢(shì)菌群，已分布在世界各地，曾多次造成院內(nèi)暴發(fā)流行［24-25］。僅有的一株萬(wàn)古霉素耐藥糞腸球菌為 ST4 型，屬于 CC4 克隆株，這株克隆株并不屬于臨床大量出現(xiàn)的菌株，但是此克隆株曾在其他的亞太國(guó)家造成嚴(yán)重感染。

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Author Affiliations: Department of Pharmacology， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China （SUN Lang， NIE Tong-ying， HU Xin-xin， LI Cong-ran， YOU Xue-fu）；Department of Respiratory Medicine， First Affiliated Hospital of Hebei North University， Zhangjiakou 075000， China （LIU Jian-hua）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):206-215

·協(xié)會(huì)之窗·

Screening and genotype analysis of vancomycin-non-susceptible enterococci

SUN Lang， LIU Jian-hua， NIE Tong-ying， HU Xin-xin， LI Cong-ran， YOU Xue-fu

【Abstract】

ObjectiveTo screen vancomycin-non-susceptible enterococci from 325 strains of clinical enterococci isolated from 2006 to 2012，and to further conduct the resistance phenotype， resistance genotype and homology analysis of the vancomycin-non-susceptible enterococci.

MethodsScreening of the vancomycin-non-susceptible enterococci and detection of the susceptibility to teicoplanin were conducted by blood agar dilution method. Resistance genotypes were determined by PCR method. Homology analysis was carried out by ERIC-PCR， PFGE and MLST technology.

ResultsTotally 17 strains of vancomycin-non-susceptible enterococci were screened out from 325 strains of clinical enterococci，including 1 strain of E. faecalis， 11 strains of E. faecium， and 5 strains of E. gallinarum. 1 strain of E. faecalis and 11 strains of E. faecium showed high level resistance to vancomycin， and resistance or intermediate resistance to teicoplanin， PCR results suggesting vanA genotype. 5 strains of E. gallinarum demonstrated intermediate resistance to vancomycin， and susceptibility to teicoplanin，PCR results suggesting vanC1 genotype. ERIC homology analysis results showed that most of isolates with the same genotype demonstrated similar ERIC profiles. Pulsed-field gel electrophoresis results of 17 strains of vancomycin-non-susceptible enterococci showed differences in PFGE type. 1 strain of E. faecalis displayed ST4 in multilocus sequence typing analysis， and 11 strains of E. faecium isolates were typed into six different sequence types （STs）， including ST17， ST78， ST203， ST323， ST571， ST262. Four of the E. faecium isolates belonged to ST78， which was the most prevalent ST type in E. faecium of this study.

ConclusionsIn our country， vancomycin resistance rate is low in E. faecalis， but vancomycin resistance is relatively a seriousproblem in E. faecium. And the resistant isolates usually carry the vanA gene favoring resistance transfer between different isolates. Homology analysis of vancomycin resistant isolates suggests the possibility of homologic transfer of vancomycin resistance.

【Key words】Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Vancomycin resistance；Genotype；Multilocus sequence typin；Enterobacterial repetitive integenic consensus

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.003

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2014AA021101）； “十二五” 國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX09301002-005）

通信作者：李聰然，Email：cong5885@aliyun.com；游雪甫，Email：xuefuyou@hotmail.com

收稿日期：2016-01-22

Corresponding Authors: LI Cong-ran， Email： cong5885@aliyun.com； YOU Xue-fu， Email： xuefuyou@hotmail.com