兒茶酚抑素對心梗大鼠心肌纖維化的影響

陳繼舜，閩新文，陳琴華

湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院a.心血管內科，b.實驗中心，湖北 十堰 442008

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*通信作者

兒茶酚抑素對心梗大鼠心肌纖維化的影響

陳繼舜a，閩新文a，陳琴華b*

湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院a.心血管內科，b.實驗中心，湖北 十堰 442008

[摘要]目的探討兒茶酚抑素(CST)治療對心梗(MI)大鼠心肌纖維化的影響。方法結扎SD大鼠冠狀動脈前降支建立心肌梗死模型，將模型大鼠隨機分為兒茶酚抑素組、心梗對照組，每組16只，另設假手術組16只。術后1 d開始，兒茶酚抑素組連續(xù)3周腹腔注射兒茶酚抑素2 nmol/(kg·d)，心梗對照組和假手術組給予等量生理鹽水腹腔注射。4周后，記錄左室血流動力學改變；處死大鼠，留取心臟標本，Masson染色檢測心肌纖維化；Western blot法檢測梗死周邊Ⅰ膠原蛋白表達。結果與心梗對照組比較，兒茶酚抑素組的心功能損害較輕(P<0.01)，梗死百分比及膠原含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。結論兒茶酚抑素能改善心臟功能，并能減輕心梗后非梗死區(qū)反應性膠原的過多沉積，預防心梗后心肌纖維化。

[關鍵詞]兒茶酚抑素；心肌梗死；心肌纖維化

0引言

兒茶酚抑素(CST)是一個具有21個氨基酸殘基的內源性多肽，其前體嗜鉻顆粒蛋白A(CgA)廣泛存在于心血管系統。研究表明，在急性冠脈綜合征中，嗜鉻顆粒蛋白A的循環(huán)水平為其提供獨立的預后信息，預測隨訪期間其長期死亡率及心衰住院率[1]。而且，嗜鉻顆粒蛋白A的血漿水平在心梗后患者升高[2]。兒茶酚抑素是嗜鉻顆粒蛋白A活性肽之一，其在體內外均存在心血管活性，是乙酰膽堿刺激兒茶酚胺釋放的非競爭性抑制劑[3]，通過抑制兒茶酚胺的釋放、升高循環(huán)中組胺水平而擴張血管[4]。高血壓患者及其后代兒茶酚抑素水平降低[5]，研究表明，外源性兒茶酚抑素能降低CgA基因敲除小鼠的血壓[6]。近年研究顯示，對用異丙腎上腺素或內皮素-1預處理的大鼠離體心臟，CST能引起冠狀動脈收縮減弱及舒張[7]。結果表明，兒茶酚抑素是心功能和血壓的一個新型調節(jié)劑?；谏鲜鲅芯?，我們推測，兒茶酚抑素在心梗心肌纖維化中也發(fā)揮著重要作用。由于尚缺乏兒茶酚抑素與心梗的研究，所以，筆者觀察大鼠心梗后應用外源性兒茶酚抑素是否能改善心梗后心功能及減輕心梗后心肌纖維化。

1材料與方法

1.1心梗模型的建立健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，隨機分為心梗組(32只)和假手術組(16只)，采用3%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉大鼠，麻醉劑量為40 mg/kg，采用肢體導聯進行大鼠心電圖監(jiān)測，氣管插管后接小動物呼吸機(呼吸頻率70次/min，潮氣量4～5 mL)，于第4、5肋間隙開胸，在肺動脈圓錐和左心耳之間進針，肺動脈圓錐側出針，結扎冠狀動脈前降支，結扎線以下區(qū)域立刻變成暗紅色，同時Ⅰ、aVL導聯ST段弓背向上抬高>0.2 mV，并持續(xù)0.5 h以上，說明結扎成功，關胸縫合。術后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素80萬U預防感染，假手術組中，除了不結扎左冠狀動脈前降支，其余的處理方式與MI組相同。

1.2分組及給藥將心梗組大鼠隨機分為心梗對照組(16只)、兒茶酚抑素組(16只)和假手術組(16只)，術后24 h開始給藥，兒茶酚抑素組經腹腔注射兒茶酚抑素2 nmol/(kg·d)，連續(xù)給藥3周；心梗對照組和假手術組腹腔注射等量生理鹽水，給藥3周后處死動物檢測相關指標。

1.3方法

1.3.1心功能參數測定麻醉后分離右頸總動脈，插入充滿肝素生理鹽水的導管，BL-420生物機能實驗系統記錄動脈收縮壓(SBP)，然后將導管緩慢插入左心室，記錄左室舒張末期壓(LVEDP)、左室壓力上升最大速率(+dP/dtmax)和左室壓力下降最大速率(-dP/dtmax)。

1.3.2心室相對重量測定大鼠處死后分別稱取全心重量(Heart weight，HW)、左室重量(Left ventricular weight，LVW)，除以體重(Body weight，BW)得到其相對重量。

1.3.3Masson染色檢測心肌纖維化指標將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，以梯度濃度的乙醇溶液脫水，分別用蘇木山、麗春紅酸性品紅液、1%磷鉬酸染色，然后苯胺藍液復染，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，采用中性樹膠封片，最后制成心肌組織Masson染色切片，置于60 ℃烘干，光學顯微鏡下觀察。膠原纖維呈綠色，肌成纖維呈紅色，紅細胞呈橘紅色。圖像分析軟件測定梗死面積并取均值，梗死面積=(疤痕內弧長+疤痕外弧長)/(外周長+內周長)×100%。

心肌膠原容積分數(CVF)及心肌血管周圍膠原面積(PVCA)用Masson染色切片測定，CVF=視野中膠原面積(不含血管周圍膠原)/心肌組織和結締組織面積。每份標本在非梗死區(qū)隨機選取非心內外膜心肌5個視野，取均值。PVCA=壁內小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積。每份標本取5個壁內小動脈橫切面進行測量，取其均值。精確稱取凍存心肌組織100 mg，按照試劑盒說明進行操作，檢測羥脯氨酸含量，非梗死區(qū)心肌膠原含量=7.46×羥脯氨酸含量。

2結果

2.1心功能參數的變化心梗對照組和兒茶酚抑素組SBP、+dP/dtmax、-dP/dtmax均低于假手術組，LVEDP高于假手術組(P<0.01)；兒茶酚抑素組SBP、+dP/dtmax、-dP/dtmax高于心梗對照組(P<0.05)，LVEDP低于心梗組(P<0.01)。見表1。

表1　兒茶酚抑素對大鼠心梗后血流動力學參數的影響

注：與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與心梗對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2左室相對重量、梗死面積心梗對照組左室及全心相對重量均重于假手術組(P<0.01)；兒茶酚抑素組及全心相對重量明顯輕于心梗對照組(P<0.05)。與心梗對照組比較，兒茶酚抑素組心肌梗死面積減小(P<0.05)。見表2。

2.3心肌纖維化及CVFMasson染色顯示，膠原纖維被染成藍色，心梗對照組大鼠心臟梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)域可見纖維增生、排列紊亂；兒茶酚抑素組大鼠心臟纖維增生較心梗對照組明顯減弱，膠原纖維排列趨向于規(guī)則；假手術組纖維增生不明顯。見圖1。心梗對照組和兒茶酚抑素組的CVF、PVCA均高于假手術組(P<0.01)；但兒茶酚抑素組明顯低于心梗對照組(P<0.05)。見表3。

3討論

急性心肌梗死是一種急性病理性損傷過程，對心臟的結構和功能破壞性極大。其并發(fā)癥如心力衰竭、心律失常及心臟性猝死使心?；颊叩纳钯|量大大降低，因而對于心?；颊撸A防其并發(fā)癥尤為重要[8]。研究表明，心梗后交感神經過度激活與心梗后惡性并發(fā)癥的發(fā)生密切相關，心梗后心梗周邊區(qū)域交感神經再生，激活亢進，兒茶酚胺釋放增多，高濃度的兒茶酚胺促進心肌細胞凋亡，刺激心肌間質膠原增生，使心肌纖維化，發(fā)生室性重構，誘發(fā)心力衰竭和心律失常[9]。

圖1　兒茶酚抑素對大鼠心梗后心肌纖維化的影響

組別只數梗死面積(%)HW/BW(mg/g)LVW/BW(mg/g)假手術組16—3.58±0.392.56±0.21心梗對照組1649.13±1.974.74±0.43**3.94±0.27**兒茶酚抑素組1647.25±2.13#4.35±0.28*#3.64±0.19**#

注：與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與心梗對照組比較，#P<0.05

表3　兒茶酚抑素對大鼠心梗后CVP、PVCA及

注：與假手術組比較，*P<0.05，**P<0.01；與心梗對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

CgA是48 kDa的酸性分泌蛋白，與兒茶酚胺、利鈉肽廣泛共存于脊椎動物的神經內分泌系統[10]及心血管系統[11]。CgA的血漿水平長期以來被作為神經內分泌腫瘤的生物學標記[12]。近年來，CgA也用來檢測心血管功能異常如原發(fā)性高血壓[1]、擴張性及肥厚性心肌病、心衰等[11]。通過翻譯后的蛋白水解加工，CgA產生多種參與反向調節(jié)過程的生物活性肽[13]。兒茶酚抑素是嗜鉻顆粒蛋白A活性肽之一。1988年Simon等首次發(fā)現，在離體培養(yǎng)的腎上腺髓質嗜鉻細胞中，牛兒茶酚抑素能夠以自分泌負反饋機制顯著抑制乙酰膽堿刺激的兒茶酚胺釋放[14]。后續(xù)研究發(fā)現，兒茶酚抑素可特異性、非競爭性地作用于全部神經元煙酸乙酰膽堿受體(Neuronal nincotinc acetylcholine receptor，nAChR)亞型，抑制兒茶酚胺分泌[15]，改善缺血后心室功能，減少缺血再灌注損傷[16]，降低交感活性，提高副交感活性，起改善心臟功能的作用[17]。因此，本試驗旨在研究其是否能通過降低交感活性減輕心梗后心梗周邊區(qū)域高兒茶酚胺所致的心肌纖維化。

本研究顯示，與心梗對照組比較，兒茶酚抑素組SBP、+dP/dtmax、-dP/dtmax升高，LVEDP降低，全心相對重量減輕；大鼠心臟纖維增生減弱，膠原纖維排列趨向于規(guī)則。心梗對照組、兒茶酚抑素組的CVF及PVCA高于假手術組，而兒茶酚抑素組低于心梗對照組。表明外源注射兒茶酚抑素能改善心梗后心功能，減小梗死面積，降低心梗后心肌間質膠原蛋白的表達，明顯改善心梗后心肌纖維化。本實驗僅證實了兒茶酚抑素能改善心梗后心肌纖維化，但未深入探討其機制，之后我們將從心肌纖維化信號調控機制進一步研究兒茶酚抑素抑制心梗后心肌纖維化的機制，以期為臨床應用提供有力證據。

參考文獻：

[1]Jansson AM,R?sj? H,Omland T,et al.Prognostic value of circulating chromogranin A levels in acute coronary syndromes[J].Eur Heart J,2009,30:25-32.

[2]Omland T,Dickstein K,Syversen U.Association between plasma chromogranin A concentration and long-term mortality after MI[J].Am J Med,2003,114:25-30

[3]Mahata SK,Mahata M,Fung MM,et al.Catestatin:a multifunctional peptide from chromogranin A[J].Regul Pept,2010,162:33-43.

[4]Kennedy BP,Mahata SK,O′Connor DT,et al.Mechanism of cardiovascular actions of the chromogranin A fragment catestatin in vivo[J].Peptides,1998,19:1241-1248.

[5]O′Connor DT,Kailasam MT,Kennedy BP,et al.Early decline in the catecholamine release inhibitory peptide catestatin in humans at genetic risk of hypertension[J].J Hypertens,2002,20:1335-1345.

[6]Mahapatra NR,O′Connor DT,Vaingankar SM,et al.Hypertension from targeted ablation of chromogranin A can be rescued by the human orthology[J].J Clin Invest,2005,115:1942-1952.

[7]Angelone T,Quintieri AM,Brar BK,et al.The antihypertensive chromogranin A peptide catestatin acts as a novel endocrine/paracrine modulator of cardiac inotropism and lusitropism[J].Endocrinology,2008,149:4780-4793.

[8]Massare J,BmTy JM,Luo X,et al.Diminished cardiac fibrosis in heart failure is associated with altered ventricular arrhythmia phenotype[J].J Cardiovasc Electrophysiol,2010,21:1031-1037.

[9]Wang Y,Xuan YL,Hu HS,et al.Risk of ventricular arrhythmias after myocardial infarction with diabetes associated with sympathetic neural remodeling in rabbits[J].Cardiology,2012,121(1):1-9.

[10]Helle KB.The chromogranin A-derived peptides vasostatin-I and catestatin as regulatory peptides for cardiovascular functions[J].Cardiovasc Res,2010,85:9-16.

[11]Pieroni M,Corti A,Tota B,et al.Myocardial production of chromogranin A in human heart:a new regulatory peptide of cardiac function[J].Eur Heart J,2007,28:1117-1127.

[12]O′Connor DT,Zhu G,Rao F,et al.Heritability and genome-wide linkage in US and Australian twins identifies novel genomic regions controlling the catecholamine release-inhibitory peptide catestatin[J].Circulation,2008,118:247-257.

[13]Helle KB,Corti A,Metz-Boutigue MH,et al.The endocrine role for chromogranin A:a prohormone for peptides with regulatory properties[J].Cell Mol Life Sci,2007,64:2863-2886.

[14]Simon JP,Bader MF,Aunis D.Secretion from chromaffin cells is controlled by chromograninA-derived peptides[J].Proc Nat Acad Sci USA,1988,85(5):1712-1716.

[15]Mahapatra NR,Mahata M,Mahata SK,et al.The chromogranin A fragment catestatin:specificity,potency and mechanism to inhibit exocytotic secretion of multiple catecholamine storage vesicle CO-transmitters[J].J Hypertens,2006,24(5):895-904.

[16]Theurl M,Schgoeo W,Albrecht K,et al.The neuropeptide catestatin acts as a novel angiogenic cytokine via a basic fibroblast growth factor-dependent mechanism[J].Circulation Research,2010,107(11):1326-1335.

[17]Kabadi SV,Ally A.Negative cardiotropism by catestatin and its variants[J].Endocrinology,2008,149(10):4778-4779.

Effect of catechol endostatin on myocardial fibrosis in rats with myocardial infarction

CHEN Ji-shuna,MIN Xin-wena,CHEN Qin-huab*

(a.Deparment of Vasculocardiology,b.Medical Experimental Center,Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of catechol endostatin on myocardial fibrosis in rats with myocardial infarction (MI).MethodsMI model of Sprague-Dawley (SD) rat was established by ligating the left anterior descending coronary artery.Rats were randomly divided into MI group (n=16) and CST group (n=16),and 16 rats were chosen as sham group.Rats in CST group were given CST 2 nmol/(kg·d) ip for 3 weeks at first day after operation,while an equal amount of 0.9% normal saline was applied to MI group and sham group.The left ventricular hemodynamics was measured.Myocardial interstitial fibrosis was observed by Masson staining,and the peripheral collagen Ⅰ was detected by western blot.ResultsCompared with MI group,cardiac function damage was milder in CST group (P<0.01).Collagen content and infarct size decreased significantly(P<0.05,P<0.01).ConclusionCST can improve the cardiac function and reduce reactive myocardial fibrosis,thus preventing myocardial fibrosis.

Key words：Catechol endostatin;Myocardial infarction;Myocardial fibrosis

收稿日期：2015-07-08

基金項目：湖北省自然科學基金面上項目(2015CFB615)；十堰市科學技術研究與開發(fā)項目(14Y59)

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604006