熱應(yīng)激通過誘導(dǎo)奶牛乳腺細(xì)胞凋亡減少乳蛋白

高勝濤　郭　江　權(quán)素玉　南雪梅　卜登攀,2,3*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院-世界農(nóng)用林業(yè)中心，農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京100081;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱150030)

熱應(yīng)激通過誘導(dǎo)奶牛乳腺細(xì)胞凋亡減少乳蛋白

高勝濤1郭江1權(quán)素玉1南雪梅1卜登攀1,2,3*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院-世界農(nóng)用林業(yè)中心，農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京100081;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱150030)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究熱應(yīng)激時(shí)乳蛋白含量和產(chǎn)量降低與泌乳相關(guān)激素、乳蛋白合成相關(guān)信號(hào)通路及乳腺細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并揭示熱應(yīng)激引起乳蛋白含量和產(chǎn)量下降的原因。選取4頭泌乳日齡、體重、產(chǎn)奶量相近的經(jīng)產(chǎn)健康荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。采取2×2交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)共2期，每期18 d(其中預(yù)試期和試驗(yàn)期各9 d)，2期之間間隔30 d。預(yù)試期為熱中性環(huán)境，自由采食。試驗(yàn)期奶牛隨機(jī)分為2組(n=2)，分別為熱應(yīng)激組和配對(duì)限飼組。結(jié)果表明：1)熱應(yīng)激顯著降低了乳蛋白的含量和產(chǎn)量(P<0.05)。2)熱應(yīng)激對(duì)酪氨酸激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號(hào)通路及κ-酪蛋白(CSN3)基因表達(dá)量沒有顯著影響(P>0.05)。3)熱應(yīng)激顯著增加了哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路中的mTOR的基因表達(dá)量(P<0.05)，且有增加核糖體S6蛋白激酶(S6K1)基因表達(dá)量的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)。4)熱應(yīng)激增加了乳腺細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、環(huán)氧合酶-2(COX2)基因的表達(dá)量(P<0.05)，且有增加B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(BAX)基因表達(dá)量的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)。綜合可知，熱應(yīng)激可能并不是通過調(diào)控單個(gè)乳腺細(xì)胞合成乳蛋白的能力來影響乳蛋白的含量和產(chǎn)量，而是通過誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞的凋亡，減少可用于乳蛋白合成的乳腺細(xì)胞的數(shù)量來影響的。

關(guān)鍵詞：熱應(yīng)激；乳蛋白；JAK-STAT；mTOR；細(xì)胞凋亡

熱應(yīng)激可引起牛奶中乳蛋白含量的降低，從而降低夏季牛奶品質(zhì)[1-2]。探明由熱應(yīng)激直接引起乳蛋白含量下降的原因，對(duì)提升夏季熱應(yīng)激時(shí)期的乳品質(zhì)具有非常重要的意義。奶牛在熱應(yīng)激條件下通過降低干物質(zhì)采食量(DMI)和驅(qū)動(dòng)機(jī)體內(nèi)分泌激素的平衡以適應(yīng)熱應(yīng)激狀態(tài)[3]，乳蛋白的合成受到激素的調(diào)控和驅(qū)動(dòng)[4]，其中主要包括生長激素(growth hormone，GH)、催乳素(prolactin，PRL)、胰島素(insulin，INS)及類胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)[5]，這些激素主要通過Janus激酶(Janus kinase,JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)等信號(hào)通路作用于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始和延伸階段，來調(diào)控蛋白質(zhì)的合成[5]。

熱應(yīng)激能降低細(xì)胞的活力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-8]。通過體外培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)高溫抑制乳腺上皮細(xì)胞正常生長，促使細(xì)胞凋亡[7]，還發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激上調(diào)了乳腺細(xì)胞中與B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma-2-associated X protein，BAX)基因(促凋亡基因)的表達(dá)量，而B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因(抑制凋亡基因)先上調(diào)后下調(diào)[9]。此外，通過設(shè)置與熱應(yīng)激組采食量保持一致的配對(duì)限飼組排除了熱應(yīng)激時(shí)采食量下降對(duì)牛奶乳蛋白含量的影響，并且發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激時(shí)DMI降低只能解釋一部分的乳蛋白含量下降，而剩余部分的乳蛋白含量下降由熱應(yīng)激直接引起[10-12]。

熱應(yīng)激對(duì)生產(chǎn)性能、乳成分等方面影響已有大量相關(guān)報(bào)道。體外培養(yǎng)奶牛乳腺細(xì)胞也表明熱應(yīng)激可促進(jìn)體外培養(yǎng)乳腺細(xì)胞的凋亡[7]。但熱應(yīng)激是否通過活體牛乳腺細(xì)胞中JAK-STAT和mTOR通路影響乳蛋白的合成，以及熱應(yīng)激是否促進(jìn)活體牛乳腺細(xì)胞的凋亡目前尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)?zāi)康氖茄芯繜釕?yīng)激時(shí)乳蛋白含量降低與泌乳相關(guān)激素、乳蛋白合成相關(guān)信號(hào)通路及乳腺組織中細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并通過對(duì)非熱應(yīng)激牛限飼處理排除熱應(yīng)激時(shí)由于DMI下降而造成的間接影響，從中揭示熱應(yīng)激引起乳蛋白下降的直接原因，為緩解熱應(yīng)激時(shí)乳蛋白含量下降提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選取4頭泌乳日齡[(101±10) d]、體重[(574±36) kg]、產(chǎn)奶量[(38.0±2.4) kg/d]相近的經(jīng)產(chǎn)健康荷斯坦奶牛，隨機(jī)分配到4個(gè)大家畜環(huán)境控制艙(kooland，北京庫藍(lán)科技有限公司；4.0 m×3.0 m×2.5 m；溫度15～40 ℃；相對(duì)濕度25%～85%；光照0～800 lx，連續(xù)可調(diào))。采取2×2交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)共2期，每期18 d(其中預(yù)試期和試驗(yàn)期各9 d)，2期之間間隔30 d。預(yù)試期4頭牛均處于熱中性環(huán)境[溫度20 ℃；相對(duì)濕度55%；溫濕指數(shù)(THI)65.5；12 h光照]，且自由采食。試驗(yàn)期試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分2組(n=2)，分別為熱應(yīng)激(HS)組[溫度：06：00—18：00，36 ℃，18：00— 06：00(次日)，32 ℃；相對(duì)濕度55%；THI 84.5；12 h光照]和配對(duì)限飼(PRF)組(溫度20 ℃；相對(duì)濕度55%；THI 65.5；12 h光照)，其中熱應(yīng)激組為自由采食，且提供足夠量的飼糧。配對(duì)限飼組的某天飼喂量(采食量)占該組牛預(yù)試期DMI平均值百分比與熱應(yīng)激組此前1 d DMI占該組牛預(yù)試期DMI平均值百分比(26.8%～61.0%)保持一致，即配對(duì)限飼組相對(duì)于熱應(yīng)激組錯(cuò)后1 d開始和結(jié)束試驗(yàn)以及采集樣品，保證試驗(yàn)期內(nèi)熱應(yīng)激組和配對(duì)限飼組每天DMI保持一致。THI設(shè)置參考熱應(yīng)激閾值[13]。

試驗(yàn)期間每天早晚飼喂2次(05：00和17：00)，飼喂同時(shí)擠奶，并記錄每頭牛產(chǎn)奶量。于第2天晨飼前收集剩料并稱重。所有試驗(yàn)動(dòng)物自由飲水。根據(jù)NRC(2001)奶牛營養(yǎng)需要量推薦值[14]，配制飼糧，精粗比為50∶50，其組成及營養(yǎng)水平參見表1，以全混合日糧(TMR)形式飼喂。代謝室衛(wèi)生管理按動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)程序進(jìn)行。

表1　飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料含有 One kg of premix contained the following：VA 250 000 IU，VD 65 000 IU，VE 2 100 IU，F(xiàn)e 400 mg，Cu 540 mg，Zn 2 100 mg，Mn 560 mg，Se 15 mg，I 35 mg，Co 68 mg。

2)泌乳凈能為計(jì)算值，由CPM-Dairy 3.8.0.1V(美國康奈爾大學(xué)、賓夕法尼亞大學(xué)、邁納農(nóng)業(yè)研究所共同研發(fā))計(jì)算得出，其余為實(shí)測(cè)值。NELwas a calculated value, and was calculated by CPM-Dairy 3.8.0.1V researched and developed by Cornell University, University of Pennsylvania, William H. Miner Agricultural Research Institute, while the others were measured values.

1.2樣品采集

預(yù)試期和試驗(yàn)期(試驗(yàn)期配對(duì)限飼組相對(duì)于熱應(yīng)激組錯(cuò)后1 d開始)每天3次(07：00、14：00、22：00)記錄每頭牛的直腸溫度、呼吸頻率及每個(gè)艙的溫度、濕度；預(yù)試期和試驗(yàn)期每天采集牛奶樣品50 mL(早晚各取25 mL)，乳樣加重鉻酸鉀防腐劑(0.6 mg/mL)混合均勻后于4 ℃存放；預(yù)試期和試驗(yàn)期第2、4、6、8天采食后2～3 h采集尾動(dòng)/靜脈血液10 mL，靜置30 min后4 ℃，1 500×g離心20 min，用1.5 mL EP管收集血清，-20 ℃保存；預(yù)試期和試驗(yàn)期第2、4、6、8天采集飼糧樣品，于第2天晨飼前采集剩料樣品；試驗(yàn)期的第9天活體采集乳腺組織樣品，采集方法參考《反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)研究方法》[15]。

1.3指標(biāo)測(cè)定

飼糧和剩料樣品采集后60 ℃烘干48 h測(cè)定水分含量(GB/T 6435—1986，強(qiáng)制對(duì)流烘箱UFE400，德國MEMMERT)，烘干樣品粉碎過40目篩后-20 ℃保存，用于其他指標(biāo)的測(cè)定。飼料常規(guī)參照國家標(biāo)準(zhǔn)分析粗灰分(GB/T 6438—1992，箱式電阻爐SRJX-8-13，天津市泰斯特儀器有限公司)、粗脂肪(GB/T 6433—2006，粗脂肪分析儀SoxtecTMAVANTI 2043，丹麥FOSS)、粗蛋白質(zhì)含量(GB/T 6432—1994，全自動(dòng)凱氏定氮儀FOSS KJELTEC 2300，丹麥FOSS)。中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參照Van Soest等[16]的方法測(cè)定，稱取0.5 g左右樣品封裝于纖維測(cè)定專用濾袋(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院)，使用全自動(dòng)纖維分析儀(A2000i，美國ANKOM)洗滌，洗滌時(shí)滴加2滴淀粉酶處理。

采用紅外分光光度法(全自動(dòng)乳成分分析儀Minor-78110，丹麥FOSS)分析乳蛋白含量。血清中GH、INS、PRL含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。血清中IGF-1含量測(cè)定采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司試劑盒測(cè)定。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR分析基因表達(dá)量

1.4.1細(xì)胞總RNA提取

乳腺組織在液氮中研磨后提取乳腺組織總RNA，采用NanoDrop1 000檢測(cè)RNA純度及260和280 nm波長下吸光度值的比(OD260 nm/OD280 nm)，測(cè)定值在1.8～2.0符合反轉(zhuǎn)錄要求。濃度調(diào)整至500 ng/μL，用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄。

1.4.2反轉(zhuǎn)錄

采用Prime ScriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase (日本TaKaRa)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL：5×Prime Script RT Master Mix 2 μL，總RNA 1 μL，無RNA酶水7 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存，獲得cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3實(shí)時(shí)定量RCR

1.5統(tǒng)計(jì)分析

每期預(yù)試期的呼吸頻率、直腸溫度、乳蛋白含量、乳蛋白產(chǎn)量、DMI及其他主要營養(yǎng)物質(zhì)采食量平均值作為該期試驗(yàn)期的協(xié)變量，用SAS 9.3中Mixed模型進(jìn)行方差分析，最小二乘均數(shù)法做平均值比較。P<0.01為差異極顯著評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05為差異顯著評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，0.05≤P<0.10為存在趨勢(shì)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

表2　引物序列

2結(jié)果

2.1環(huán)境THI及奶牛直腸溫度、呼吸頻率和采食量

由表3可知，熱應(yīng)激組和配對(duì)限飼組THI分別為82.4和64.6，熱應(yīng)激組極顯著高于配對(duì)限飼組(P<0.01)。與配對(duì)限飼組相比，熱應(yīng)激組極顯著提高了奶牛的呼吸頻率和直腸溫度(P<0.01)。由圖1可看出，試驗(yàn)期熱應(yīng)激組THI日平均值均高于72，而預(yù)試期和試驗(yàn)期配對(duì)限飼組低于72。由表3和圖2可知，熱應(yīng)激組和配對(duì)限飼組DMI及其他主要營養(yǎng)物質(zhì)采食量無顯著差異(P>0.05)。

表3　環(huán)境溫濕指數(shù)及奶牛直腸溫度、呼吸頻率和采食量

圖1　預(yù)試期和試驗(yàn)期THI日平均值

2.2熱應(yīng)激對(duì)乳蛋白含量和產(chǎn)量的影響

由表4可知，與配對(duì)限飼組相比，熱應(yīng)激組顯著降低了乳蛋白含量和產(chǎn)量(P<0.05)。

2.3熱應(yīng)激對(duì)泌乳相關(guān)血液激素含量的影響

由表5可知，熱應(yīng)激組奶牛血液中GH、INS、PRL及IGF-1含量與配對(duì)限飼組差異不顯著(P>0.05)。

2.4熱應(yīng)激對(duì)乳腺細(xì)胞中JAK-STAT和mTOR信號(hào)通路表達(dá)量的影響

由表6可知，相對(duì)于配對(duì)限飼組，熱應(yīng)激組顯著提高了PRLR基因表達(dá)量(P<0.05)，而對(duì)INSR基因表達(dá)量的影響不顯著(P>0.05)。熱應(yīng)激對(duì)JAK-STAT通路基因(JAK2、STAT5B、ELF5)表達(dá)量的影響不顯著(P>0.05)，對(duì)mTOR通路基因(mTOR、eIF4EBP1、eIF4EBP2、S6K1)中mTOR和S6K1基因表達(dá)量有顯著的影響(P<0.05)或有顯著影響的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)。與配對(duì)限飼組相比，熱應(yīng)激顯著提高了mTOR基因表達(dá)量(P<0.05)，且有提高S6K1基因表達(dá)量的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)，對(duì)eIF4EBP1及eIF4EBP2的基因表達(dá)量沒有顯著的影響(P>0.05)。

2.5熱應(yīng)激對(duì)乳腺細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由表7可知，與配對(duì)限飼組相比，熱應(yīng)激組提高了乳腺細(xì)胞中CASP3(P<0.05)、COX2(P<0.05)和BAX的基因表達(dá)量(0.05≤P<0.10)，而對(duì)FAS、Bcl-2、TNFR1和CASP8基因表達(dá)量影響不顯著(P>0.05)。

圖2　預(yù)試期和試驗(yàn)期DMI日平均值

項(xiàng)目Items配對(duì)限飼組PRFgroup熱應(yīng)激組HSgroupSEMP值P-value分組Grouping時(shí)間Time分組×?xí)r間Grouping×time乳蛋白含量Milkproteincontent/%2.682.570.0290.038<0.0010.436乳蛋白產(chǎn)量Milkproteinyield/(g/d)69557238.40.048<0.0010.378

表5　熱應(yīng)激對(duì)泌乳相關(guān)血液激素含量的影響

3討論

當(dāng)THI超過72時(shí)奶牛的生產(chǎn)性能開始出現(xiàn)明顯下降，故將72作為熱應(yīng)激的THI閾值[13]。然而Zimbleman等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)THI超過68時(shí)高產(chǎn)奶牛已經(jīng)開始出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)，且當(dāng)THI等于68時(shí)每24 h產(chǎn)奶量下降2.2 kg。本研究中，試驗(yàn)期熱應(yīng)激組平均THI為82.4，且試驗(yàn)期每天THI平均值均高于72，而預(yù)試期和試驗(yàn)期配對(duì)限飼組每天THI平均值均低于68，滿足熱應(yīng)激組和非熱應(yīng)激組的THI要求。與配對(duì)限飼組相比，熱應(yīng)激顯著提高了奶牛的呼吸頻率和直腸溫度。綜合以上數(shù)據(jù)可知，本試驗(yàn)的熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激模型構(gòu)建成功。

表6　熱應(yīng)激對(duì)JAK-STAT和mTOR信號(hào)通路基因表達(dá)量的影響

表7　熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的影響

大量研究表明，當(dāng)THI高于72時(shí)會(huì)引起奶牛DMI的下降[21-22]，同時(shí)引起乳蛋白含量下降[23]，降低乳品質(zhì)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激時(shí)DMI的下降只能解釋部分乳蛋白下降[10-12]，剩余部分的乳蛋白下降由熱應(yīng)激直接引起。本研究中熱應(yīng)激組與配對(duì)限飼組的乳蛋白含量和產(chǎn)量均隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長而下降，但配對(duì)限飼組的乳蛋白含量在試驗(yàn)期的最后2 d有升高的趨勢(shì)，這可能與產(chǎn)奶量下降后乳蛋白的濃縮有關(guān)。綜合以上數(shù)據(jù)提示，熱應(yīng)激通過DMI下降引起乳蛋白下降的同時(shí)還會(huì)通過其他途徑引起乳蛋白的降低。

乳蛋白的合成受到激素的調(diào)控和驅(qū)動(dòng)[4]，其中主要包括GH、PRL、INS及IGF-1[5]。GH對(duì)促進(jìn)生長發(fā)育及泌乳有重要的作用，主要通過調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡及增加機(jī)體蛋白質(zhì)的合成來產(chǎn)生作用[24]。PRL的主要作用是促進(jìn)乳腺生長發(fā)育、發(fā)動(dòng)和維持泌乳。INS是由胰島β細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，是機(jī)體內(nèi)唯一降低血液GLU的激素，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)的合成。研究表明，增加血液中INS含量可明顯增加乳腺血流量，提高產(chǎn)奶量[25-26]。IGF-1除可作為GH發(fā)揮作用的中介物質(zhì)以外，還可通過作用于其受體介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖和腺泡的形成[27]。

目前關(guān)于熱應(yīng)激對(duì)泌乳相關(guān)激素影響的報(bào)道不完全一致。宋代軍等[28]研究表明，各熱應(yīng)激期泌乳前、中期奶牛血清INS含量有下降的趨勢(shì)，這與Herbein等[29]的研究結(jié)果一致，然而Itoh等[30]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可顯著提高泌乳期奶牛血液INS含量。宋代軍等[28]研究表明，泌乳前、中、后期的奶牛在熱應(yīng)激期的血清PRL含量均低于非熱應(yīng)激期，然而朱國標(biāo)等[31]卻得到相反的結(jié)果。熱應(yīng)激對(duì)GH的影響，目前研究基本一致，熱應(yīng)激可降低奶牛血液中GH含量或有降低的趨勢(shì)[11,32-33]。熱應(yīng)激對(duì)IGF-1的影響并沒有太多的報(bào)道，Rhoads等[11]認(rèn)為熱應(yīng)激可降低IGF-1含量，而McGuire等[33]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激對(duì)IGF-1含量并沒有顯著影響。本研究中，和配對(duì)限飼組相比，熱應(yīng)激對(duì)血液GH、INS、PRL、IGF-1含量并沒有顯著影響，這可能與試驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量較少有關(guān)。

乳蛋白基因表達(dá)的過程主要包括DNA的轉(zhuǎn)錄和mRNA的翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，PRL、INS、GH、糖皮質(zhì)激素、IGF-1等對(duì)泌乳有直接或間接的影響，主要通過JAK-STAT和mTOR等信號(hào)通路作用于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始及延伸階段來調(diào)控蛋白質(zhì)的合成[5]。PRL或GH與相應(yīng)的受體結(jié)合后引起受體分子的二聚體化，這使得與受體偶聯(lián)的JAK相互接近并通過交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾，繼而這些磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)與周圍的氨基酸序列形成“停泊位點(diǎn)(docking site)”，同時(shí)STAT5蛋白被招募到這個(gè)“停泊位點(diǎn)”。最后，JAK催化結(jié)合在受體上的STAT5蛋白發(fā)生磷酸化修飾，活化的STAT5以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與γ干擾素激活序列(GAS)位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)ELF5、SOCS1、SOCS2和乳蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，其中ELF5在調(diào)節(jié)乳腺中STAT5活性方面發(fā)揮著重要作用[34-36]。mTOR通路中起主要作用的是mTOR復(fù)合物1(mTORc1)，mTORc1可以磷酸化eIF4EBP的某些位點(diǎn)，使其與真核翻譯起始因子(eIF)4E解離，使eIF4E可以與eIF4G和eIF4A結(jié)合形成eIF4E·eIF4G·eIF4A復(fù)合物。eIF4E·eIF4G·eIF4A復(fù)合物被認(rèn)為對(duì)含有5′端非翻譯區(qū)(5′-UTR)二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯有重要作用[37]，因?yàn)閑IF4A可使5′-UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)解旋，有利于跳讀過程的進(jìn)行，使核糖體能夠快速定位到mRNA的起始密碼子，從而促進(jìn)翻譯的進(jìn)行。mTORc1可介導(dǎo)S6K1的磷酸化，S6K1可磷酸化核糖體S6(rpS6)、eIF4B、SKAR(S6K1 Aly/REF-like target)和真核細(xì)胞翻譯延長因子2(eEF2)激酶，進(jìn)而影響mRNA翻譯的起始和延伸階段[38]。

熱應(yīng)激對(duì)奶牛乳腺細(xì)胞中JAK-STAT和mTOR通路的影響目前尚未見報(bào)道。Yoshihara等[39]在老鼠上的研究表明熱應(yīng)激對(duì)mTOR和eIF4EBP1基因表達(dá)量并沒有顯著的影響。在人肌肉細(xì)胞上的研究表明，熱應(yīng)激可增加mTOR、S6K1的磷酸化水平，降低eIF4EBP1的磷酸化水平，但在熱應(yīng)激1 h后eIF4EBP1磷酸化水平恢復(fù)到熱應(yīng)激之前的水平[40]。本研究中，熱應(yīng)激對(duì)JAK-STAT通路基因表達(dá)量并沒有顯著的影響，但是顯著增加了mTOR基因的表達(dá)量，并有增加S6K1基因表達(dá)量的趨勢(shì)。本研究中熱應(yīng)激對(duì)于CSN3基因的表達(dá)量并沒有顯著的影響，然而胡菡等[9]在體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞上研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可降低乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白αS1-酪蛋白和β-酪蛋白的基因的表達(dá)量，試驗(yàn)結(jié)果的不同可能與體內(nèi)試驗(yàn)和體外培養(yǎng)細(xì)胞的差異以及熱應(yīng)激的程度(胡菡等[9]：42 ℃，本研究：平均直腸溫度40.0 ℃)不同造成。綜合以上數(shù)據(jù)，提示熱應(yīng)激可能并沒有通過JAK-STAT和mTOR通路影響乳蛋白的合成，且CSN3基因的表達(dá)量可能并沒有受到熱應(yīng)激的顯著影響。

大量研究表明，熱應(yīng)激能降低細(xì)胞的活力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-8]。通過體外培養(yǎng)乳腺細(xì)胞，周振峰等[7]發(fā)現(xiàn)高溫抑制乳腺上皮細(xì)胞正常生長，促使細(xì)胞凋亡，胡菡等[9]發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激上調(diào)了乳腺細(xì)胞中促凋亡基因BAX的表達(dá)量，而抑制凋亡基因Bcl-2先上調(diào)后下調(diào)。限于無法直接測(cè)定活體乳腺組織中乳腺細(xì)胞凋亡數(shù)量，本研究選擇了幾個(gè)和細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，通過實(shí)時(shí)定量PCR分析相關(guān)基因表達(dá)量來了解熱應(yīng)激對(duì)乳腺細(xì)胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激顯著增加了乳腺細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因CASP3、COX2的表達(dá)量，且有增加BAX表達(dá)量的趨勢(shì)，而抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)量并未受到影響，提示熱應(yīng)激可能降低了活體乳腺組織中乳腺細(xì)胞的活力，促進(jìn)了乳腺細(xì)胞的凋亡。

綜合得出，與配對(duì)限飼組相比，熱應(yīng)激降低了乳蛋白的含量和產(chǎn)量，而與乳蛋白合成相關(guān)的信號(hào)通路(JAK-STAT和mTOR通路)的基因表達(dá)量并沒有下降，提示熱應(yīng)激可能并沒有通過JAK-STAT和mTOR通路影響乳腺細(xì)胞合成乳蛋白的能力。與體外研究的結(jié)果[9]一致的是，熱應(yīng)激增加了活體乳腺細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因(CASP3、COX2、BAX)的表達(dá)量或有增加的趨勢(shì)，顯示熱應(yīng)激可能誘導(dǎo)了活體乳腺細(xì)胞的凋亡。綜合考慮，熱應(yīng)激可能并不是通過調(diào)控單個(gè)乳腺細(xì)胞合成乳蛋白的能力來影響乳蛋白的含量和產(chǎn)量，而是通過誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞的凋亡，減少可用于乳蛋白合成的乳腺細(xì)胞的數(shù)量來影響乳蛋白的含量和產(chǎn)量。

但是由于目前研究技術(shù)的限制，不能活體檢測(cè)奶牛乳腺組織中乳腺細(xì)胞凋亡的情況，尚不能充分證明熱應(yīng)激可誘導(dǎo)活體乳腺細(xì)胞的凋亡，需要進(jìn)一步的改進(jìn)和提升研究技術(shù)，進(jìn)一步研究熱應(yīng)激引起乳蛋白下降的原因，為采取相關(guān)措施緩解熱應(yīng)激引起的乳蛋白下降提供理論依據(jù)。

4結(jié)論

熱應(yīng)激可能并不是通過調(diào)控單個(gè)乳腺細(xì)胞合成乳蛋白的能力來影響乳蛋白的含量和產(chǎn)量，而是通過誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞的凋亡，減少可用于乳蛋白合成的乳腺細(xì)胞的數(shù)量來影響的。

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(責(zé)任編輯王智航)

Heat-Stress Decreases Milk Protein through Induction of Mammary Cells Apoptosis of Cows

GAO Shengtao1GUO Jiang1QUAN Suyu1NAN Xuemei1BU Dengpan1,2,3*

(1. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. CAAS-ICRAF Joint Laboratory on Agroforestry and Sustainable Animal Husbandry, Beijing 100081, China; 3. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Harbin 150030, China)

Abstract:This experiment was conducted to investigate the relationship among the decrease of milk protein content and yield under heat stress, hormones related to lactation, pathways involved in milk protein synthesis, and apoptosis of mammary cells, and to find reasons for milk protein decline caused by heat stress. Four healthy multiparous lactating Holstein cows with similar days in milk, body weight and milk yield were used as experiment animals. Crossover design was applied, there were two experimental periods, and each period lasted for 18 days (9 d of pretrial period, and 9 d of trail period) with 30 d between the two periods. Cows in pretrial period were exposed to thermal neutral conditions and allowed to eat ad libitum. Cows in trial period were randomly divided into two groups (n=2)， which were heat stress group and pair-restricted feeding group. The results showed as follows: 1) heat stress significantly decreased milk protein yield and content (P<0.05). 2) Heat stress had no significant influence on Janus kinase (JAK)-signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway and κ-casein (CSN3) gene expression (P>0.05). 3) In mTOR pathway, heat stress significantly increased the expression of mammalian target of rapamycin (mTOR) gene (P<0.05), and had the tendency to increase the expression of ribosomal protein S6 kinase (S6K1) gene (0.05≤P<0.10). 4) Heat stress significantly increased the expressions of Caspase-3 (CASP3) and cyclooxygenase-2 (COX2) genes involved in apoptosis (P<0.05), and had the tendency to increase the expression of B-cell lymphoma-2-associated X protein (BAX) (0.05≤P<0.10). It is concluded that heat stress may not be able to decline milk protein content and yield through regulating the capacity of individual mammary cells, but thorough induction of apoptosis of the mammary cells and decrease of the quantity of mammary cells used for milk protein synthesis.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(5)：1615-1625]

Key words:heat stress; milk protein; JAK-STAT; mTOR; apoptosis

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.05.040

收稿日期：2015-12-15

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31372341)；十二五國家科技支撐計(jì)劃(2012BAD12B02-05)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)

作者簡介：高勝濤(1990—)，男，河北邯鄲人，碩士研究生，從事動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)研究。E-mail: gaoshengtao2014@outlook.com *通信作者：卜登攀，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: budengpan@126.com

中圖分類號(hào)：S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)05-1615-11

*Corresponding author, professor, E-mail： burdenpan@126.com