尼古丁抑制MIA誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡

韓貴賓，張 壽，孫薇薇，鐘海波，陳建強(qiáng)，范忠誠(chéng)（?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心，海口 570208）

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尼古丁抑制MIA誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡

韓貴賓，張 壽，孫薇薇，鐘海波，陳建強(qiáng)，范忠誠(chéng)
（海口市人民醫(yī)院骨科中心，海口 570208）

【摘要】目的 探討尼古丁抑制碘乙酸鈉（MIA）誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡。方法 酶消化法分離大鼠原代軟骨細(xì)胞，并用10－8，10－7，10－6，10－5mol/ L尼古丁處理細(xì)胞48 h，隨后實(shí)驗(yàn)分為5組，除正常組外，其余4組皆用4 μM MIA處理24 h，并給予尼古丁。MTT法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞活力；Annexin V-FITC/ PI流式雙染細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞凋亡；分光光度法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase 3）活性；Western blot分析磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）激活狀況及下游靶分子Bax，Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果10－7，10－6mol/ L尼古丁顯著促進(jìn)大鼠軟骨細(xì)胞活力（P＜0. 05），10－5mol/ L尼古丁顯著降低大鼠軟骨細(xì)胞活力（P＜0. 05），10－8mol/ L尼古丁對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活力無(wú)影響（P＞0. 05）。10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能劑量依賴性的提高M(jìn)IA誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞活力，并抑制MIA誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡及Caspase 3活性（P＜0. 05）；10－7，10－6mol/ L尼古丁能提高PI3K表達(dá)及AKT磷酸化水平，并下調(diào)促Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)（P＜0. 05）。結(jié)論 一定劑量尼古丁能顯著的抑制MIA誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡，可能與PI3K/ AKT信號(hào)通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】關(guān)鍵詞尼古丁；骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；凋亡

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，其中軟骨病變是骨關(guān)節(jié)炎的中心環(huán)節(jié)［1］。軟骨細(xì)胞是軟骨中唯一細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一旦軟骨細(xì)胞死亡，只能緩慢再生甚至無(wú)法再生，而軟骨細(xì)胞的死亡又破壞了胞外基質(zhì)合成及降解的平衡，從而進(jìn)一步加劇OA［2］。軟骨細(xì)胞的凋亡受多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，其中包括PI3K/ AKT，此通路的持續(xù)激活，能使軟骨細(xì)胞維持增殖活力，并調(diào)節(jié)下游靶基因Bax，Bcl-2及Caspase 3的表達(dá)［3］。

一定劑量尼古丁能顯著促進(jìn)包括軟骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖活力。如Liu等［4］報(bào)道在碘乙酸鈉（MIA）誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠中，尼古丁通過(guò)與乙酰膽堿受體α7結(jié)合，從而改善大鼠大體及病理形態(tài)，并抑制大鼠軟骨細(xì)胞凋亡。Zheng等［5］通過(guò)MTT及DAPI實(shí)驗(yàn)證實(shí)10－7M尼古丁能顯著抑制白介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡。但尼古丁對(duì)于軟骨細(xì)胞凋亡的抑制作用機(jī)制尚未見報(bào)道，因此本文旨在考察尼古丁是否能過(guò)通過(guò)PI3K/ AKT信號(hào)通路從而阻斷MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

1　材料和方法

1.1藥品和試劑

尼古丁購(gòu)自美國(guó)sigma公司，批號(hào)：4408；兔抗Bax，Bcl-2，PI3K，AKT，p-AKT，GDAPH抗體購(gòu)自Epitmics公司；Annexin V-FITC/ PI流式雙染細(xì)胞，Caspase 3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，DMEM/ F-12培養(yǎng)基，二型膠原酶，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自Gibco公司。

1.2大鼠軟骨細(xì)胞的制備［6］

無(wú)菌環(huán)境下，刮取100 g左右SD大鼠（購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（滬2012－ 0002】）雙側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨坪、髕骨內(nèi)側(cè)透明軟骨，剪碎至1 mm3大小。依次用0. 25%的胰蛋白酶及0. 2%的膠原酶消化。得到單細(xì)胞懸液，用DMEM/ F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞（含20%胎牛血清，100 U/ mL青霉素，100 U/ mL鏈霉素），在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約5～6 d細(xì)胞開始融合，實(shí)驗(yàn)使用第2～3代細(xì)胞。

1.3軟骨細(xì)胞活力檢測(cè)（MTT法）

將第2～3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行消化，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)細(xì)胞/ mL，接種，于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5%胎牛血清的DMEM/ F-12（含4 μmol/ L MIA及10－8，10－7，10－6，10－5mol/ L尼古?。┡囵B(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加MTT（5 mg/ mL）20 μL，4 h后，棄上清，并每孔加入DMSO 150 μL，10 min后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值，以O(shè)D值代表細(xì)胞活力。

1.4Annexin V-FITC流式細(xì)胞法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡

將第2～3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)細(xì)胞/ mL，接種，于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5%胎牛血清的DMEM/ F-12培養(yǎng)基、尼古?。ńK濃度為10－8，10－7，10－6mol/ L）和MIA（終濃度為4 μmol/ L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按照Annexin V-FITC/ PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的方法，用0. 25%的胰蛋白酶（不含EDTA）消化，PBS洗滌，2000 r/ min離心5 min，收集細(xì)胞；加入Binding Buffer 500 μL懸浮細(xì)胞，隨后加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后，加入PI 5 μL，混勻，于室溫避光反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5Caspase 3活性檢測(cè)

將第2～3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)細(xì)胞/ mL，接種，于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5%小牛血清的DMEM/ F-12培養(yǎng)基、尼古?。ńK濃度為10－8，10－7，10－6mol/ L）和MIA（終濃度為4 μmol/ L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按Caspase 3分光光度法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.6Western blotting

收集處理過(guò)的樣本，加入裂解液裂解，離心，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗4℃孵育過(guò)夜。次日加二抗孵育后曝光。用“Quantity One”軟件對(duì)各蛋白條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1尼古丁對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著提高軟骨細(xì)胞活力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）；而10－5mol/ L尼古丁對(duì)軟骨細(xì)胞活力具有顯著抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）；10－8mol/ L尼古丁對(duì)軟骨細(xì)胞活力影響不大（P＞0. 05）。

圖1　尼古丁對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響Note：Compared with normal control group，aaP＜0. 01.Fig. 1 Effect of nicotine on rat chondrocytes viability

2.2尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，4 μmol/ L MIA顯著抑制軟骨細(xì)胞活力，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著提高M(jìn)IA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）。

2.3尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，4 μmol/ L MIA顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著抑制MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

2.4尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞PI3K/ AKT信號(hào)通路的影響

如圖4所示，4 μmol/ L MIA顯著抑制PI3K表達(dá)和AKT的磷酸化程度，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能提高PI3K表達(dá)，10－7，10－6mol/ L尼古丁能提高AKT磷酸化水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。

2.5尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Bax及Bcl-2表達(dá)的影響

如圖5所示，4 μmol/ L MIA顯著提高Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，而10－7，10－6mol/ L尼古丁能下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）。

圖2　尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力的影響Note：Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01.Fig. 2 Effect of nicotine on viability of ratchondrocytes induced by MIA

2.6尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Caspase 3活性的影響

如圖6所示，4 μmol/ L MIA顯著提高軟骨細(xì)胞Caspase 3活性，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著抑制MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Caspase 3活性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）。

3　結(jié)論

Ying等［7］研究結(jié)果表明10－7，10－6mol/ L尼古丁能促進(jìn)骨髓干細(xì)胞增殖并向軟骨細(xì)胞分化，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)能逐漸誘導(dǎo)二型膠原蛋白的表達(dá)，而10－5mol/ L尼古丁可顯著的抑制骨髓干細(xì)胞增殖。Schraufstatter等［8］報(bào)道10－5mol/ L尼古丁會(huì)導(dǎo)致人間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡。說(shuō)明不同劑量尼古丁對(duì)細(xì)胞增殖活力影響具有顯著差異，本實(shí)驗(yàn)研究表明10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著提高軟骨細(xì)胞活力，而10－5mol/ L尼古丁對(duì)軟骨細(xì)胞活力具有顯著抑制作用，與上述報(bào)道一致，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)尼古丁對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用。而多種因素可引起軟骨細(xì)胞損傷乃至死亡，如軟骨表面應(yīng)力異常，細(xì)胞因子（如IL-1β、TNF-α等）的作用，NO、能量代謝抑制劑（如MIA）等。其中MIA為糖酵解途徑中3-磷酸甘油醛脫氫酶抑制劑，通過(guò)抑制細(xì)胞能量代謝而導(dǎo)致細(xì)胞因供養(yǎng)不足而死亡［9］。MIA體外刺激24 h，亦能造成大鼠軟骨細(xì)胞的死亡［10－11］。本實(shí)驗(yàn)亦表明MIA誘導(dǎo)24 h會(huì)降低軟骨細(xì)胞活力，并使細(xì)胞凋亡顯著。且10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著抑制MIA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，與Zheng等［5］觀點(diǎn)一致。

圖3　尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響Note：Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01. A：normal control group；B：model group；C：10－8mol/ L nicotine +4 μmol/ L MIA；D：10－7mol/ L nicotine +4 μmol/ L MIA；E：10－6mol/ L nicotine +4 μmol/ L MIA.Fig. 3 Effect of nicotine on apoptosis of rat chondrocytes induced by MIA

正常生理狀態(tài)下，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡與增殖處于動(dòng)態(tài)平衡，而在OA等病理狀態(tài)下，軟骨細(xì)胞凋亡占主要方面，且關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的異常會(huì)引起OA。PI3K/ AKT信號(hào)通路在OA軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用［3］。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，其代謝產(chǎn)物4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）和1，4，5-三磷酸肌醇（PIP3）可以激活A(yù)KT蛋白上的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。PI3K/ AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)眾多靶分子表達(dá)，如Bax，Bcl-2，Caspase 3等，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡活動(dòng)［3］。PI3K抑制劑LY294002加入到大鼠脛骨軟骨細(xì)胞中，使軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)目增多，且軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢［12］。胰島素生長(zhǎng)因子-1通過(guò)激活兔軟骨細(xì)胞PI3K/ AKT信號(hào)通路拮抗軟骨細(xì)胞凋亡，而PI3K抑制劑LY294002加入使軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)目增加［13］。這些提示PI3K/ AKT途徑是抗軟骨細(xì)胞凋亡作用的重要途徑。并且李舒潔等［14］研究表明，MIA促使大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的同時(shí)，伴隨著AKT磷酸化水平的降低，Bax表達(dá)量的提高及Bcl-2表達(dá)量的降低。本研究也發(fā)現(xiàn)，在MIA誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞中，PI3K表達(dá)及AKT磷酸化程度下降，而10－7，10－6mol/ L尼古丁顯著促進(jìn)PI3K表達(dá)及AKT磷酸化。Nishioka等［15］研究結(jié)果也表明尼古丁可通過(guò)激活PI3K/ Akt信號(hào)通路來(lái)抵抗肺癌細(xì)胞凋亡。說(shuō)明尼古丁可通過(guò)PI3K/ AKT信號(hào)通路來(lái)抵抗MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

軟骨細(xì)胞的凋亡受凋亡基因的嚴(yán)格控制，如Bcl-2家族，能與Bax亞家族成員，相互作用，啟動(dòng)軟骨細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在關(guān)節(jié)炎患者血清中，Bax含量顯著上升，Bcl-2含量下降［16］，通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，能顯著抑制軟骨細(xì)胞凋亡［17］，本研究結(jié)果也顯示MIA能上調(diào)軟骨細(xì)胞的Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，而10－7，10－6mol/ L尼古丁減弱MIA誘導(dǎo)的這種變化。Caspase是一類進(jìn)化上保守的天冬氨酸蛋白酶家族，依賴Caspase的信號(hào)途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑。Caspase 3抑制劑Z-DEVD-FMK或Ac-DMQD-CHO在體外證實(shí)能抑制由膠原酶引起的軟骨細(xì)胞凋亡［18］。碘乙酸鈉能誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡，與促進(jìn)Caspase 3的活化有關(guān)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中Caspase 3活性顯著提高，10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁可顯著降低Caspase 3活性。

圖4　尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞PI3K/ AKT信號(hào)通路的影響與正常組比較，aaP＜0. 05；與模型組比較，bbP＜0. 01Fig. 4 Effect of nicotine on PI3K/ AKT signal pathway in rat chondrocytes induced by MIA Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01

圖5　尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Bax及Bcl-2表達(dá)的影響與正常組比較，aaP＜0. 05；與模型組比較，bbP＜0. 01Fig. 5 Effect of nicotine on the expression of Bax and Bcl-2 in rat chondrocytes induced by MIA Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bP＜0. 05，bbP＜0. 01

綜上所述，10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁具有保護(hù)軟骨細(xì)胞作用，可抑制MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡并抑制Caspase 3活性，10－7，10－6mol/ L尼古丁可下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，并抑制PI3K表達(dá)及AKT磷酸化水平。

圖6　尼古丁對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Caspase 3活性的影響與正常組比較，aaP＜0. 05；與模型組比較，bP＜0. 05，bbP＜0. 01Fig. 6 Effect of nicotine on the activity of Caspase 3 in rat chondrocytes induced by MIA Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bP＜0. 05，bbP＜0. 01

參考文獻(xiàn)：

［1］ 謝輝晉，杜遠(yuǎn)立.骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)細(xì)胞因子作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（4）：395－398.

［2］ Tong P，Xu S，Cao G，et al. Chondroprotective activity of a detoxicated traditional Chinese medicine（Fuzi）of Aconitum carmichaeli Debx against severe-stage osteoarthritis model induced by mono-iodoacetate［J］. J Ethnopharmacol，2014，151 （1）：740－744.

［3］ Huang Y，Wu D，F(xiàn)an W. Protection of ginsenoside Rg1 on chondrocyte from IL-1beta-induced mitochondria-activated apoptosis through PI3K/ Akt signaling［J］. Mol Cell Biochem，2014，392（1－2）：249－257.

［4］ Liu Y，Wu D，Song F，et al. Activation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors prevents monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis in rats［J］. Cell Physiol Biochem，2015，35（2）：627－638.

［5］ Zheng X，Xia C，Chen Z，et al. Requirement of the phosphatidylinositol 3-kinase/ Akt signaling pathway for the effect of nicotine on interleukin-1beta-induced chondrocyte apoptosis in a rat model of osteoarthritis［J］. Biochem Biophys Res Commun，2012，423（3）：606－612.

［6］ Zhang X，Xu X，Xu T，et al. beta-Ecdysterone suppresses interleukin-1beta-induced apoptosis and inflammation in rat chondrocytes via inhibition of NF-kappaB signaling pathway［J］. Drug Dev Res，2014，75（3）：195－201.

［7］ Ying XZ，Peng L，Cheng SW，et al.［Effects of nicotine on bone marrow stromal cells proliferation and differentiation of chondrocyte in vitro］［J］. Zhongguo Gu Shang，2011，24 （11）：935－938.

［8］ Schraufstatter IU，Discipio RG，Khaldoyanidi SK. Alpha 7 subunit of nAChR regulates migration of human mesenchymal stem cells［J］. J Stem Cells，2009，4（4）：203－215.

［9］ Grossin L，Cournil-Henrionnet C，Pinzano A，et al. Gene transfer with HSP 70 in rat chondrocytes confers cytoprotection in vitro and during experimental osteoarthritis［J］. FASEB J，2006，20（1）：65－75.

［10］ Liu Y，Wu D，Song F，et al. Activation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors prevents monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis in rats［J］. Cell Physiol Biochem，2015，35（2）：627－638.

［11］ Tong P，Xu S，Cao G，et al. Chondroprotective activity of a detoxicated traditional Chinese medicine（Fuzi）of Aconitum carmichaeli Debx against severe-stage osteoarthritis model induced by mono-iodoacetate［J］. J Ethnopharmacol，2014，151 （1）：740－744.

［12］ Ulici V，Hoenselaar KD，Gillespie JR，et al. The PI3K pathway regulates endochondral bone growth through control of hypertrophic chondrocyte differentiation［J］. BMC Dev Biol，2008，8：40.

［13］ Wang L，Shao YY，Ballock RT. Thyroid hormone-mediated growth and differentiation of growth plate chondrocytes involves IGF-1 modulation of beta-catenin signaling［J］. J Bone Miner Res，2010，25（5）：1138－1146.

［14］ 李淑潔，陳秀娟，任艷紅，等.牛膝提取物對(duì)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞保護(hù)作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（14）：132－135.

［15］ Nishioka T，Guo J，Yamamoto D，et al. Nicotine，through upregulating pro-survival signaling，cooperates with NNK to promote transformation［J］. J Cell Biochem，2010，109（1）：152－161.

［16］ 邢國(guó)勝，趙文君，張凱，等.姜黃素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞增殖與凋亡的影響［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29 （11）：872－875.

［17］ Zhang XH，Xu XX，Xu T. Ginsenoside Ro suppresses interleukin-1beta-induced apoptosis and inflammation in rat chondrocytes by inhibiting NF-kappaB［J］. Chin J Nat Med，2015，13（4）：283－289.

［18］ Nuttall ME，Nadeau DP，F(xiàn)isher PW，et al. Inhibition of caspase-3-like activity prevents apoptosis while retaining functionality of human chondrocytes in vitro［J］. J Orthop Res，2000，18（3）：356－363.

［19］ 姜麗平，李龍婕，宮德正，等.碘乙酸鈉誘導(dǎo)原代大鼠軟骨細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)組織工程研究，2013，17（2）：247－253.

〔修回日期〕2015－11－13

Inhibition of nicotine on apoptosis of chondrocytes induced by monosodium iodoacetate

HAN Gui-bin，ZHANG Shou，SUN Wei-wei，ZHONG Hai-tao，CHEN Jian-qiang，F(xiàn)AN Zhong-cheng

【Abstract】Objective To explore inhibition of nicotine on apoptosis of chondrocytes induced by monosodium iodoacetate（MIA）. Methods Rat primary chondrocytes were isolated by enzyme digestion，and the cells were treated with 10－8，10－7，10－6，10－5mol/ L nicotine for 48 h. The cases were randomly divided into five groups，except for normal group，the other four groups were treated with 4 μmol/ L MIA 24 h，and three groups were treated 10－8，10－7，10－6mol/ L nicotine. The viability of chondrocytes was detected by MTT assay. The apoptosis of chondrocytes was examed by Annexin V-FITC/ PI flow dual-staining method. The activity of cysteinyl aspartate specific proteinase 3（Caspase 3）was measured by spectrophotography method. The activation of phosphatidylinositol 3 kinase（PI3K）/ protein kinase B（AKT）and the expression of down-stream molecule Bax，Bcl-2 was assayed by western blot. Results 10－7，10－6mol/ L nicotine increased chondrocytes’viability（P＜0. 05），10－5mol/ L nicotine reduced chondrocytes’viability（P＜0. 05），and 10－8mol/ L nicotine didn‘t effect on chondrocytes’viability（P＞0. 05）. 10－8，10－7，10－6mol/ L nicotine could increaseMIA-induced chondrocytes’viability（P＜0. 05），suppress MIA-induced chondrocytes’apoptosis and the activity of MIA-induced Caspase 3（P＜0. 05）. Moreover，10－7，10－6mol/ L nicotine could increase the expression of PI3K and phosphorylation of AKT（P＜0. 05），down-regulate the expression of Bax and up-regulate the expression of Bcl-2 in MIA-induced rat chondrocytes（P＜0. 05）. Conclusion These results suggested nicotine could exert anti-apoptosis in MIA-induced rat chondrocytes，which might be related to PI3K/ AKT signal pathway.

【Key words】Nicotine；Ostearthritis；Chondrocytes；Apoptosis

【中圖分類號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）03-0040-00

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 009

［基金項(xiàng)目］海南省衛(wèi)生廳基金資助項(xiàng)目（瓊衛(wèi)－2013資助－036號(hào)）。

［作者簡(jiǎn)介］韓貴賓（1974－），男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：關(guān)節(jié)外科。E-mail：hanguibin456@163. com。

［通訊作者］張壽，Email：shouzhang456@163. com。