加蘭他敏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)活化及C/EBPβ表達(dá)的影響

吳召軒　張艷

150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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加蘭他敏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)活化及C/EBPβ表達(dá)的影響

吳召軒張艷

150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

摘要：目的研究加蘭他敏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、C/EBPβ 表達(dá)及行為學(xué)的影響。方法 選取10月齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠20只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組(10只)和治療組(10只)，同月齡、同背景的C57BL/6野生型雄性小鼠10只作為正常對(duì)照組。治療組皮下注射加蘭他敏溶液5 mg/kg，2次/d，連續(xù)治療8周，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予皮下注射等量生理鹽水。應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)于干預(yù)治療8周后開始測(cè)定各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，連續(xù)7 d，采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光及Western-blot方法觀察各組小鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及C/EBPβ 表達(dá)水平。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組和治療組小鼠Morris檢測(cè)第5、6天平均逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05，P <0.05)，而治療組其逃避潛伏期較模型對(duì)照組縮短(P <0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)增多(P<0.05)；同時(shí)治療組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化被明顯抑制，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的陽性表達(dá)面積〔(5.003±0.823)%〕及C/EBPβ的表達(dá)量(87.711±14.622)較模型對(duì)照組〔(7.116±1.040)%，119.920±16.901〕明顯減少(P<0.05，P<0.05)。結(jié)論加蘭他敏改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力可能與其抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及C/EBPβ的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：加蘭他敏；APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；星形膠質(zhì)細(xì)胞；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；C/EBPβ

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積為核心的老年斑、細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化tau蛋白聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)及膽堿能神經(jīng)元的丟失是其主要的病理改變[1]。Aβ沉積可引起小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活增殖并產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而觸發(fā)腦內(nèi)一系列的炎性反應(yīng)[2]，而C/EBP β作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，其在炎癥發(fā)生過程中起重要作用[3-4]。加蘭他敏作為膽堿酯酶抑制劑及乙酰膽堿煙堿型受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，已獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療臨床上輕、中度AD。雖然加蘭他敏可延緩AD進(jìn)展，一定程度上改善一些癥狀，然而卻未能有效地控制疾病發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過研究加蘭他敏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及轉(zhuǎn)錄因子C/EBP β表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討加蘭他敏治療AD的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1動(dòng)物分組及給藥方法10月齡雄性C57BL/6野生型小鼠10只為正常對(duì)照組(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)；10月齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠20只(購(gòu)自北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，體重(35±5)g，隨機(jī)分為模型對(duì)照組和治療組，每組各10只。在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房中單籠飼養(yǎng)。治療組小鼠給予加蘭他敏5 mg/kg皮下注射，2次/d，持續(xù)治療8周，同時(shí)正常對(duì)照組和模型對(duì)照組按同樣方法給予等量生理鹽水。各實(shí)驗(yàn)小鼠均自由飲水和取食，環(huán)境溫度控制在25℃，濕度50%～60%。

1.2主要試劑與儀器加蘭他敏(MB1560，中國(guó)大連美侖生物技術(shù)有限公司)，兔抗小鼠Aβ1-42抗體、免疫熒光二抗FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG及Cy3標(biāo)記的驢抗山羊IgG(分別為437900、A21206、A21432，Invitrogen公司)，兔抗小鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗及β-actin抗體、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及顯影液、定影液(分別為BA0056、BA1054，武漢博士德生物工程有限公司)，羊抗小鼠GFAP抗體、兔抗小鼠C/EBPβ(ab53554、ab53138，Abcam公司)，免疫組化二抗(sp9000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，蛋白電泳Markers(Fermentas)，ECL試劑盒(Super)，PVDF膜(Millipore)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，曝光成像儀(Kodak IMAGE STATION 2000MM，美國(guó)柯達(dá)公司)，奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(Olympus Corporation，日本)，Nikon Eclipse80熒光顯微鏡(Nikon Instruments Inc.，日本)。

1.3方法

1.3.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：于治療8周后開始對(duì)各組小鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小鼠空間學(xué)記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)：水池水深30 cm，并將水池平均分為4個(gè)象限，平臺(tái)位于第一象限，并沒于水面下1 cm。將小鼠從不同象限選取的同一個(gè)入水點(diǎn)面對(duì)池壁放入水中，在60 s內(nèi)記錄各組小鼠成功進(jìn)駐平臺(tái)(找到平臺(tái)并在此停留5 s為成功進(jìn)駐)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)，如在60 s內(nèi)小鼠未能成功進(jìn)駐平臺(tái)，則將其引上平臺(tái)并令其滯留10 s，實(shí)驗(yàn)終止，記錄逃避潛伏期為60 s。測(cè)試于每天上午、下午固定時(shí)間段進(jìn)行。連續(xù)檢測(cè)6 d。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，從池中同一位置將每只小鼠放入水中，其余條件保持不變，記錄60 s內(nèi)各小鼠跨過原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)，共檢測(cè)兩次，取其均值。

1.3.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)：各組小鼠于水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)選擇5只進(jìn)行麻醉、灌流后迅速斷頭取腦，常規(guī)固定、包埋、切片。切片常規(guī)脫蠟至水，高溫抗原修復(fù)，3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，正常山羊血清封閉。一抗(兔抗小鼠Aβ1-42抗體1∶100，兔抗小鼠GFAP抗體1∶200)孵育4℃過夜，37℃復(fù)溫20 min，生物素化二抗工作液及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液于37℃分別孵育20 min、30 min，DAB顯色并于鏡下控制。常規(guī)脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠海馬Aβ1-42和GFAP的陽性染色情況并攝片。每張切片隨機(jī)選擇6個(gè)GFAP陽性表達(dá)視野進(jìn)行掃描，用Image-Pro-Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，記錄GFAP陽性表達(dá)面積百分比(%)平均值。

1.3.3熒光雙染鑒定：冷凍切片復(fù)溫后，PBS振蕩清洗，正常驢血清封閉2 h。將一抗(山羊抗小鼠GFAP抗體l∶200，兔抗小鼠C/EBPβ抗體1∶50)用抗體稀釋液按比例稀釋后滴加在載玻片腦組織上，置4℃冰箱濕盒內(nèi)孵育過夜。次日用PBS洗滌后分別加入二抗(FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG 1∶200，Cy3標(biāo)記的驢抗山羊IgG 1∶200)，置于室溫避光、37℃孵育1 h。使用Nikon Eclipse80熒光顯微鏡觀察GFAP和C/EBPβ在海馬區(qū)的共表達(dá)。C/EBPβ陽性表達(dá)呈綠色熒光標(biāo)記，而用于檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗GFAP 抗體呈紅色熒光信號(hào)。

1.3.4Western blot：快速提取3組小鼠(每組隨機(jī)選擇5只)海馬組織細(xì)胞核蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行蛋白定量(一抗為兔抗小鼠C/EBPβ抗體1∶300及β-actin抗體1∶2000；二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體1∶500)，曝光成膠片掃描后采用專業(yè)圖像分析軟件對(duì)各顯色條帶進(jìn)行灰度分析，β-actin為內(nèi)參，各組C/EBPβ蛋白的表達(dá)強(qiáng)度以各組C/EBPβ條帶平均灰度值與各自β-actin平均灰度掃描值的比值表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用最小顯著差異t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：結(jié)果見表1。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組于訓(xùn)練的第4、5、6天時(shí)逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，治療組于訓(xùn)練的第5、6天時(shí)逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，但較正常對(duì)照組仍延長(zhǎng)(P<0.05)。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組以及治療組小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)分別為(4.32±1.77)、(1.41±1.35)和(3.24±1.07)次，各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.69，P<0.01)，兩兩之間比較，模型對(duì)照組與治療組穿越平臺(tái)次數(shù)較正常對(duì)照組明顯減少(均P<0.05)，而治療組穿越平臺(tái)次數(shù)較模型對(duì)照組增加(P<0.05)。

2.2加蘭他敏可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生與活化模型對(duì)照組小鼠海馬區(qū)可見大量濃染的 GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞，胞體肥大，突起密集且粗短，Aβ斑塊附近與周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)形態(tài)腫脹、胞體肥大、突起粗短、染色深及不規(guī)則增生，而遠(yuǎn)離斑塊的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)則無顯著變化；治療組小鼠海馬區(qū)GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)較模型對(duì)照組明顯減弱，鏡下表現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體較小，突起較短且細(xì)，陽性細(xì)胞數(shù)量減少且細(xì)胞質(zhì)染色淺(圖1)。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組以及治療組GFAP免疫組化染色陽性面積分別為(2.653±1.246)%、(7.116±1.040)%和(5.003±0.823)%，各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=180.5，P<0.01)，兩兩之間比較，模型對(duì)照組與治療組小鼠海馬區(qū)GFAP陽性表達(dá)面積較正常對(duì)照組明顯增高(均P<0.05)，而治療組其海馬區(qū)GFAP陽性表達(dá)面積較模型對(duì)照組降低(P<0.05)。

2.3加蘭他敏抑制C/EBPβ表達(dá)免疫熒光雙染鑒定結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯，核內(nèi)C/EBPβ表達(dá)較多；與模型對(duì)照組相比，治療組小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化被明顯抑制，且核內(nèi)C/EBPβ的表達(dá)量也相對(duì)減少(圖2)。免疫印跡法結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及治療組海馬區(qū)C/EBPβ表達(dá)水平分別為66.702±14.813、119.920±16.901、87.711±14.622，各組間比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.92，P<0.01)；均數(shù)間兩兩比較，模型對(duì)照組海馬區(qū)C/EBPβ表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，治療組小鼠其表達(dá)水平較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

表1　各組小鼠Morris水迷宮檢測(cè)平均逃避潛伏期(n=10，x±s)

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05

GFAP：膠質(zhì)纖維酸性蛋白，圖2同；Aβ：β淀粉樣蛋白；A：正常對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：治療組；D：模型對(duì)照組小鼠腦內(nèi)圍繞Aβ斑塊的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)；E：模型對(duì)照組小鼠腦內(nèi)遠(yuǎn)離Aβ斑塊的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)圖1　各組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦海馬區(qū)GFAP表達(dá)(免疫組化，比例尺=400 μm)

C/EBPβ呈綠色熒光信號(hào)標(biāo)記，GFAP呈紅色熒光信號(hào)標(biāo)記；Merge圖像顯示C/EBPβ和GFAP的共表達(dá)(×20)；最右側(cè)圖為左側(cè)Merge圖中矩形框內(nèi)圖的放大圖像(×40)圖2　APP/PS1小鼠海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞核中C/EBPβ和GFAP共表達(dá)(免疫熒光雙染法)

1：正常對(duì)照組；2：模型對(duì)照組；3：治療組圖3　Western-blot 檢測(cè)各組小鼠海馬區(qū)C/EBPβ表達(dá)水平

3討論

AD患者腦內(nèi)持續(xù)存慢性神經(jīng)炎性反應(yīng)，Aβ激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞而釋放多種炎性細(xì)胞因子，引起神經(jīng)元損害，并進(jìn)一步刺激膠質(zhì)增生反應(yīng)，加劇神經(jīng)元的退行性變。

該研究觀察了加蘭他敏皮下注射對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的影響，結(jié)果顯示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠存在明顯的學(xué)習(xí)記憶損傷，而給予加蘭他敏治療后，小鼠逃避潛伏期明顯下降，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，提示加蘭他敏可明顯改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。曾有報(bào)道指出，按體重2 mg/(kg·d)給予10月齡Tg2576小鼠加蘭他敏皮下注射10 d，可在一定程度上改善小鼠認(rèn)知損害[5]，按體重5 mg/(kg·d)給予腹腔注射加蘭他敏，持續(xù)14 d，可明顯提高紅藻氨酸誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶力能力[6]。提示隨著加蘭他敏使用劑量的增高，治療時(shí)間的延長(zhǎng)，其療效越為顯著。

研究結(jié)果顯示，APP/ PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)過量表達(dá)Aβ，表現(xiàn)為明顯的炎性反應(yīng)和Aβ斑塊周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生[7]。Aβ通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子及神經(jīng)毒性物質(zhì)，造成神經(jīng)元損傷[8]。GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白，其表達(dá)上調(diào)的程度反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化程度。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬區(qū)GFAP表達(dá)明顯增多，而加蘭他敏治療組小鼠海馬區(qū)GFAP表達(dá)明顯減少，表明AD模型小鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍，其腦組織損傷明顯；加蘭他敏可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生，減輕AD模型小鼠腦組織損傷。

在Aβ的作用下，AD腦內(nèi)海馬區(qū)C/EBP β蛋白和mRNA水平上調(diào)[9-10]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞受到各種炎性刺激，細(xì)胞核內(nèi)C/EBP β表達(dá)會(huì)增加，且與炎性基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合活性增強(qiáng)，是腦內(nèi)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[3，11]。本實(shí)驗(yàn)中蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織中C/EBP β表達(dá)顯著增加；通過免疫熒光雙染技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞核中C/EBP β的表達(dá)水平也顯著上調(diào)，提示AD可通過活化星形膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致其細(xì)胞核內(nèi)C/EBP β水平升高，從而導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而在加蘭他敏藥物干預(yù)后，小鼠海馬組織及星形膠質(zhì)細(xì)胞核中C/EBP β的表達(dá)較模型組明顯減少，同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化也被明顯抑制。

加蘭他敏是一種選擇性、可逆性、競(jìng)爭(zhēng)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿酯酶抑制劑，同時(shí)也是神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，因而可通過與煙堿型受體變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合而提高乙酰膽堿的內(nèi)在作用[12-14]。加蘭他敏改善AD模型小鼠的定向?qū)W習(xí)記憶能力與顯著增強(qiáng)膽堿能系統(tǒng)的生物活性相關(guān)[12]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，加蘭他敏也可能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，下調(diào)C/EBP β表達(dá)水平，從而有效抑制炎癥和免疫聯(lián)級(jí)反應(yīng)，改善AD的病理過程，進(jìn)而提高認(rèn)知功能，為加蘭他敏治療AD提供了新的臨床依據(jù)。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

Effect of galantamine on astrocyte activation and C/EBPβ expression in APP/PS1 transgenic mice

WUZhaoxuan，ZHANGYan*.

*DepartmentofNeurology，TheFirstClinicalHospitalof，HarbinMedicalUniversity，HarbinHeilongjiang150001，ChinaCorresponding author：ZHANG Yan，Email：1124998693@qq.com

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the effect of chronic galantamine treatment on cognitive performance，astrocyte activation and the expression of C/EBPβ in the transgenic APP/PS1 mouse model with Alzheimer disease(AD).MethodsGalantamine(5 mg/kg，i.p.)or 0.9% saline were administrated twice daily for eight weeks in 10-month-old male APP/PS1 mice as the treatment group and the model control group.In addition，a separate group of 10-month old male C57BL/6 wild type mice was included as a reference normal control group.Morris water maze was applied to evaluate the learning and memory abilities for 7 days.Astrocyte activation and C/EBPβ expression levels in hippocampus were observed by immunohistochemistry，immunofluorescence and Western blot methods. ResultsCompared with the normal control group，the model control group and the treatment group exhibited significantly longer escape latencies(P<0.05)and significantly decreased platform crossings numbers(P<0.05)as assessed by Morris water maze test on Days 5 and 6.Compared with the model control group，the treatment group exhibited significantly decreased escape latencies(P<0.05)and significantly increased numbers of platform crossings(P<0.05).Galantamine inhibited astrocyte activation and glial fibrillary acidic protein(GFAP)expression[(5.003±0.823)%] as assessed by immunohistochemistry as well as decreased C/EBPβ expression(87.711±14.622)as determined by immunofluorescence and western-blot within the hippocampus of transgenic APP/PS1 mice.There was significant difference between the treatment group and the model control group[(7.116±1.040)%，119.920±16.901](P<0.05，respectively). ConclusionsGalantamine improves the learning and memory abilities of APP / PS1 transgenic mice，the mechanism of which may involve inhibition of the activation of astrocytes and the expression of C/EBPβ.

Key words：galantamine；APP/PS1 transgenic mice；astrocyte；glial fibrillary acidic protein；C/EBPβ

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.03.004

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2013115)

通訊作者：張艷，Email：1124998693@qq.com

中圖分類號(hào)：R741.05

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2963(2016)03-0177-05

(收稿日期：2015-10-30)