口服法舒地爾治療EAE對(duì)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及TLR/NF-B通路的作用研究

于婧文　張輝　宋國(guó)斌　李自青　尉杰忠　劉春云　張海飛　劉建春王青　肖保國(guó)　李艷花　馬存根

037009 山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所(于婧文、張輝、宋國(guó)斌、李自青、尉杰忠、劉春云、肖保國(guó)、李艷花、馬存根)；037009 山西大同市第五人民醫(yī)院神經(jīng)科(張海飛)；030024 山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學(xué)研究中心 山西中醫(yī)學(xué)院(劉建春、王青、馬存根)；200025 復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所(肖保國(guó))

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于婧文張輝宋國(guó)斌李自青尉杰忠劉春云張海飛劉建春王青肖保國(guó)李艷花馬存根

037009 山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所(于婧文、張輝、宋國(guó)斌、李自青、尉杰忠、劉春云、肖保國(guó)、李艷花、馬存根)；037009 山西大同市第五人民醫(yī)院神經(jīng)科(張海飛)；030024 山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學(xué)研究中心 山西中醫(yī)學(xué)院(劉建春、王青、馬存根)；200025 復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所(肖保國(guó))

摘要：目的探討口服鹽酸法舒地爾(Fasudil)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)小鼠巨噬細(xì)胞及TLR/NF-B通路的作用。方法采用小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55 肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide，MOG35-55)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立EAE模型，將EAE小鼠隨機(jī)分為EAE模型組和Fasudil治療組，免疫后第3天給予Fasudil治療組小鼠Fasudil灌胃干預(yù)，直到免疫后第27天，EAE模型組同樣處理給予等量生理鹽水。光鏡觀察脊髓組織CD4+T細(xì)胞/CD68巨噬細(xì)胞表達(dá)的變化，Western blot法測(cè)定脊髓誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、Toll樣受體2(TLR-2)、TLR-4和磷酸化核因子B(p-NF-B)蛋白的表達(dá)，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)72 h脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的含量。結(jié)果與EAE模型組比較，F(xiàn)asudil組CD4+T細(xì)胞數(shù)和CD68巨噬細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，巨噬細(xì)胞M1表型iNOS表達(dá)減少(P<0.05)，M2表型Arg-1表達(dá)增加(P<0.01)，炎性通路蛋白p-NF-B、TLR-2和TLR-4表達(dá)減少(P<0.05)，外周細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)和IL-17分泌減少(P<0.05)，而IL-10分泌增加(P<0.05)。結(jié)論口服Fasudil可抑制CD4+T細(xì)胞/CD68巨噬細(xì)胞的激活，促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型M1向M2轉(zhuǎn)化，抑制脊髓組織中p-NF-B、TLR-2和TLR-4的表達(dá)，抑制外周免疫細(xì)胞炎性因子分泌，而增加IL-10的分泌。

關(guān)鍵詞：腦脊髓炎，自身免疫性，實(shí)驗(yàn)性；巨噬細(xì)胞；TLR/NF-B通路；神經(jīng)通路

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎性脫髓鞘疾病的理想動(dòng)物模型，它與多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)的臨床表現(xiàn)、免疫及病理特征相似[1]。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取C57BL/6雌性小鼠16只，鼠齡8～10周，體重18～20 g，購(gòu)自北京維通利華公司。

1.2主要試劑及儀器包括小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55 肽(MOG35-55，西安聯(lián)美生物科技有限公司合成)、完全福氏佐劑(Sigma公司)、結(jié)核分枝桿菌(TB，BD公司)、百日咳毒素(PTX，ENZO公司)、Bio-RAD凝膠成像分析(Bio-RAD 公司)、BCA蛋白定量試劑盒(欣科中晶生物技術(shù)有限公司)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)、ELISA試劑盒(Peprotech公司)。

1.3方法

1.3.1模型制備及分組：將4 mg MOG35-55肽段溶于0.8 mL生理鹽水，4 mg TB溶于0.8 mL 完全福氏佐劑(含0.8 mg TB)；將兩種溶液用針管混合器等體積充分混合為油包水樣乳白色混懸液，取一滴乳劑滴于水上，若乳劑不擴(kuò)散為合格。將實(shí)驗(yàn)小鼠按體重18、19、20 g分層后再隨機(jī)分入EAE模型組和Fasudil治療組，每組8只。給予小鼠皮下注射MOG35-55福氏完全佐劑0.1 mL/只，于免疫后當(dāng)天和48 h后注射PTX 300 ng。免疫后第3天Fasudil治療組小鼠給予5 mg/mL Fasudil灌胃200 μL(溶劑生理鹽水)直到免疫后第27天；EAE模型組以相同方式給予等量生理鹽水。模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)為：有EAE臨床癥狀且脊髓病理切片中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及髓鞘脫失。免疫后第10天EAE組小鼠開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病，在第14天進(jìn)入發(fā)病高峰期，發(fā)病率達(dá)100%。

1.3.2免疫組化：免疫第28天處死動(dòng)物，兩組小鼠各隨機(jī)選取4只，以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛灌流進(jìn)行體內(nèi)組織固定，分離脊髓，包埋后行冷凍切片，切片厚10 μm，切片以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛固定10 min，PBS洗5 min×3次；分別加抗大鼠一抗CD68(1∶1000)和抗大鼠CD4(1∶1000)，4℃ 孵育過(guò)夜。次日PBS再次洗3次，分別加 DyLight 488熒光標(biāo)記的抗大鼠的二抗(1∶1000)，室溫孵育2 h后，甘油封片，光鏡下觀察脊髓組織白質(zhì)區(qū)CD68和CD4陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度，并用Image pro plus 軟件計(jì)數(shù)小鼠脊髓白質(zhì)區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取均值。

1.3.4ELISA檢測(cè)：取兩組各4只小鼠脾細(xì)胞，研磨制備單細(xì)胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，于492 nm波長(zhǎng)測(cè)定細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-10、干擾素γ(IFN-γ)和IL-17吸光度。同時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定并計(jì)算各細(xì)胞因子分泌分泌水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism5.0進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組CD4+T細(xì)胞和CD68巨噬細(xì)胞表達(dá)Fasudil治療組小鼠脊髓CD4+T細(xì)胞與CD68巨噬細(xì)胞較EAE模型組明顯降低(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

表1　兩組小鼠脊髓CD4+T細(xì)胞與CD68

iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，Arg-1：精氨酸酶1，p-NF-B：磷酸化核因子B，TLR：Toll樣受體，表2同；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶圖2　Western blot檢測(cè)兩組小鼠脊髓各種蛋白表達(dá)

EAE：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，表1～3、圖2同；右側(cè)圖分別為左側(cè)圖中方框部分的放大圖像圖1　兩組小鼠脊髓CD4+T細(xì)胞和CD68巨噬細(xì)胞表達(dá)(免疫熒光染色)

組 別iNOS蛋白Arg-1蛋白p-NF-B蛋白TLR-2蛋白TLR-4蛋白EAE模型組0.33±0.090.14±0.040.10±0.020.34±0.040.23±0.03Fasudil治療組0.19±0.030.39±0.060.07±0.010.25±0.040.14±0.03t值2.506.082.733.133.680P值0.030.000.030.040.012

表3　ELISA檢測(cè)兩組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中各細(xì)胞因子表達(dá)水平

注：IL：白細(xì)胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子α；TNF-γ：γ干擾素

2.3ELISA檢測(cè)兩組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子表達(dá)Fasudil治療組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17和IFN-γ水平均低于EAE模型組(P<0.05)，而IL-10水平高于EAE模型組(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

3討論

目前針對(duì)MS的治療仍缺乏經(jīng)濟(jì)有效的手段，糖皮質(zhì)激素多用于MS 急性發(fā)作期的治療，但短期應(yīng)用對(duì)MS長(zhǎng)期功能恢復(fù)并無(wú)明顯療效；環(huán)孢素等免疫抑制劑對(duì)進(jìn)展型MS 有一定治療作用，但長(zhǎng)期應(yīng)用不良反應(yīng)較大；免疫球蛋白治療可縮短病程、加速神經(jīng)功能恢復(fù)，但價(jià)格昂貴且對(duì)多次復(fù)發(fā)者和進(jìn)展型MS效果不理想[11-13]。MS屬慢性病，上述藥物的給藥方式多為皮下注射和靜脈點(diǎn)滴，長(zhǎng)期用藥不便?？诜o藥是臨床上常用的給藥方式，具有方便安全的優(yōu)點(diǎn)。

在EAE發(fā)病情況下，CD4+T細(xì)胞通過(guò)血-腦脊液屏障進(jìn)入CNS，經(jīng)抗原提呈激活CNS內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，在小鼠發(fā)病28 d左右，進(jìn)入慢性損傷期，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 、IL-1等致炎性細(xì)胞因子，形成炎性微環(huán)境，更多的CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)入CNS，放大炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的變性死亡。而Fasudil可影響炎性細(xì)胞向CNS的移行[14]和改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性[15]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)asudil組CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)較少，外周巨噬細(xì)胞CD68進(jìn)入CNS極少。

Fasudil不僅可抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而且可以調(diào)節(jié)M1和M2型巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答的平衡。巨噬細(xì)胞根據(jù)其特有的表型和功能不同，分為經(jīng)典活化M1炎性巨噬細(xì)胞，以分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS/CD11b+、CD16/32、iNOS、IL-12或IL-23增加為特征；替代性活化的M2抗炎巨噬細(xì)胞以分泌IL-10、Arg-1/CD11b+、CD206、IL-10、CD23或IL-4/13增加為特征。本研究選取iNOS和CD68為CNS M1型巨噬細(xì)胞的表型標(biāo)志，Arg-1為M2型表型標(biāo)志，結(jié)果顯示，F(xiàn)asudil可抑制CNS中iNOS和CD68表達(dá)，增加Arg-1表達(dá)，促使致炎性的M1型巨噬細(xì)胞向抗炎保護(hù)性M2型轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制外周免疫細(xì)胞分泌炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17和IFN-γ表達(dá)，增加 IL-10表達(dá)。

在MS急性期和復(fù)發(fā)期，TLR2能夠促進(jìn)CNS大量的促炎性因子表達(dá)以及巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)[17]。TLR4與配體結(jié)合后，可導(dǎo)致CNS小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活產(chǎn)生炎性因子，損傷神經(jīng)元。體外實(shí)驗(yàn)證明，用丙泊酚或Fasudil干預(yù)經(jīng)過(guò)LPS刺激的BV2細(xì)胞，其TLR4蛋白表達(dá)和炎性因子表達(dá)受到抑制，推測(cè)Fasudil通過(guò)下調(diào)TLR4受體表達(dá)，從而抑制抗炎性反應(yīng)因子(如IL-10)的過(guò)度釋放，發(fā)揮對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用[18-19]。這與本研究的結(jié)果一致。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

YUJingwen，ZHANGHui，SONGGuobin，LIZiqing，YUJiezhong，LIUChunyun，ZHANGHaifei，LIUJianchun，WANGQing，XIAOBaoguo，LIYanhua，MACungen*.

*InstituteofBrainScience，ShanxiDatongUniversity，Datong037009，China；“2011”CollaborativeInnovationCenter/ReaserchCenterofNeurobiology，ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Taiyuan030024，ChinaCorresponding author：MA Cungen，Email：macungen2001@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the effect and mechanism of oral fasudil on macrophages and TLR/NF-B pathway in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) .MethodsEAE models were induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide(MOG35-55) in C57BL/6 mice.The models were randomly divided into the EAE group and the fasudil group.Mice in the fasudil group were intragastrically infused with fasudil one time every day from the 3rd day after immunization to the 27th day.Mice in the EAE group were treated with the same dosage of saline.CD4+T cells and CD68 macrophages expressions in the spinal cord tissue were observed by light microscope.The expression of iNOS，Arg-1，TLR -2，TLR-4 and p-NF-B in spinal cord were detected by western blot.The cytokine of splenocyte cells cultured for 72 h were analyzed by ELISA. ResultsThe number of CD4+T cells and CD68 macrophages decreased in the fasudil group(P<0.01).iNOS phenotype of macrophages M1 was inhibited(P<0.05)，and the expression of M2 phenotypic Arg-1 increased(P<0.01).The expression of inflammatory signaling pathway proteins including p-NF-B，TLR-2 and TLR-4 reduced(P<0.05).Macrophage inflammatory cytokines including IL-6，IL-1β and TNF-α decreased(P<0.05)，and secretion of IL-10 increased(P<0.05)，T cells inflammatory cytokine IL-17 and IFN-γ decreased(P<0.05).ConclusionsOral treatment with fasudil inhibits CD4+T cells/CD68 macrophages activation，improves the conversion from macrophage phenotype M1 to M2，and inhibits the expression of p-NF-B，TLR-2 and TLR-4 in spinal cord.Inflammatory cytokines secreted by macrophages and T cells in spleen are inhibited，and the secretion of IL-10 increases.

Key words：encephalomyelitis，autoimmune，experimental；macrophages；TLR/NF-B pathway；neural pathways

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.03.003

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金2012年面上項(xiàng)目(81272163)；山西中醫(yī)學(xué)院“2011”培育計(jì)劃項(xiàng)目(2011PY-1)；山西省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2013081058)；山西省回國(guó)留學(xué)人員重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目(2014-重點(diǎn)7)；大同大學(xué)?？蒲许?xiàng)目(2015Q15)

通訊作者：馬存根，Email：macungen2001@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R744.5+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-2963(2016)03-0172-05

(收稿日期：2015-12-23)