復(fù)合納米顆粒中白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白相互作用研究

管 驍，劉 靜，殷 婷，李景軍，廖麗麗

1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093 2. 上海海事大學(xué)信息工程學(xué)院，上海 200135 3. 江蘇長(zhǎng)壽集團(tuán)股份有限公司，江蘇 如皋 226500 4. 桂林西麥?zhǔn)称芳瘓F(tuán)，廣西 桂林 541004

復(fù)合納米顆粒中白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白相互作用研究

管 驍1，劉 靜2*，殷 婷1，李景軍3，廖麗麗4

1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093 2. 上海海事大學(xué)信息工程學(xué)院，上海 200135 3. 江蘇長(zhǎng)壽集團(tuán)股份有限公司，江蘇 如皋 226500 4. 桂林西麥?zhǔn)称芳瘓F(tuán)，廣西 桂林 541004

為闡明大麥醇溶蛋白包覆白藜蘆醇形成納米顆粒的分子機(jī)制，采用熒光光譜、紫外吸收光譜以及傅里葉紅外光譜和差示掃描量熱技術(shù)等研究了白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白分子間的相互作用。結(jié)果表明：白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白分子的相互作用，對(duì)其內(nèi)源性熒光具有猝滅作用，結(jié)合差示掃描量熱的結(jié)果，推測(cè)二者通過(guò)靜態(tài)猝滅過(guò)程形成了新的復(fù)合物；計(jì)算出兩者之間的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為KA(298 K)=2.21×105L·mol-1，KA(310 K)=1.53×104L·mol-1和n298 K=1.23，n310 K=0.94；依據(jù)熱力學(xué)參數(shù)和傅里葉紅外光譜判斷白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白之間的作用力為范德華力和氫鍵相互作用；根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移原理，計(jì)算出白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白的結(jié)合距離為3.25 nm，能量轉(zhuǎn)移效率為0.227；同步熒光檢測(cè)結(jié)果表明白藜蘆醇結(jié)合大麥醇溶蛋白分子后對(duì)其構(gòu)象產(chǎn)生了明顯影響，且該影響是由色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性變化所致。

白藜蘆醇；大麥醇溶蛋白；相互作用

引 言

白藜蘆醇是一種天然的多酚類(lèi)蒽醌萜化合物，又稱(chēng)茋三酚，具有廣泛的生理藥理活性。然而，白藜蘆醇也存在對(duì)光敏感、易氧化、水溶性差、生物利用度低等問(wèn)題，影響其在食品、保健品及醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[1]。有研究報(bào)道指出，為提高酚類(lèi)物質(zhì)的生物利用度，采用納米顆粒形式對(duì)其保護(hù)是目前有效的手段之一[2-5]。

大麥醇溶蛋白作為谷物類(lèi)醇溶蛋白的一種，具有來(lái)源廣泛、提取工藝簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、具有良好的生物相容性與可降解性, 同時(shí)可一定程度上抗胃酸分解，是一種納米給藥系統(tǒng)的理想載體材料[6]。本課題組前期已成功制備出白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白納米級(jí)復(fù)合顆粒，但對(duì)兩種物質(zhì)形成納米顆粒的機(jī)制及相互作用問(wèn)題還不甚了解。熒光光譜法是研究生物大分子與小分子相互作用的重要手段之一[7]。國(guó)內(nèi)外利用熒光光譜法對(duì)小分子與蛋白之間的相互作用已有大量研究[8-10]，但大多是研究各種小分子與血清白蛋白之間的相互作用機(jī)制，體系多為水溶液。大麥醇溶蛋白與血清白蛋白在分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)方面存在很大差異，它們與小分子相互作用的方式與機(jī)理是否相同仍未可知。同時(shí)，將差示掃描量熱技術(shù)和傅里葉紅外光譜技術(shù)與熒光光譜結(jié)合，對(duì)分子之間相互作用機(jī)制進(jìn)行探討的實(shí)驗(yàn)方法還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)將熒光光譜法、差示掃描量熱法及傅里葉紅外光譜法等方法結(jié)合在一起，研究了異丙醇溶液環(huán)境下白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白之間的結(jié)合作用，并考察了白藜蘆醇對(duì)大麥醇溶蛋白構(gòu)象的影響。可對(duì)白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白形成納米顆粒給藥系統(tǒng)的作用機(jī)理提供參考數(shù)據(jù)，對(duì)納米顆粒給藥系統(tǒng)制備條件的優(yōu)化具有指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Aqualog○R吸收和三維熒光掃描光譜儀(HORIBA Scientific)；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀(Thermofisher，美國(guó))；Q2000差示掃描量熱儀(TA，美國(guó))。

配制55%(V/V)的異丙醇(分析純)水溶液；大麥醇溶蛋白(實(shí)驗(yàn)室自制，純度91.7%)貯備液：稱(chēng)取0.2 g大麥醇溶蛋白，溶于55%異丙醇溶液并定容至100 mL，摩爾濃度為5×10-5mol·L-1；白藜蘆醇(純度≥98%，天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司)貯備液：稱(chēng)取28.5 mg白藜蘆醇，溶于55%異丙醇溶液并定容至100 mL，摩爾濃度為1.25×10-3mol·L-1。

1.2 方法

往一系列5 mL大麥醇溶蛋白貯備液中依次加入0，100，200，300，400和500 μL白藜蘆醇貯備液，并用55%異丙醇定容至25 mL，混勻后測(cè)定熒光光譜(Δλex=280 nm, Δλem=300～400 nm，298和310 K)、同步熒光光譜(298 K，Δλ=60 nm和Δλ=15 nm)及與蛋白質(zhì)分子比為1∶1的白藜蘆醇的吸收光譜(298 K)?；旌弦弘S之通過(guò)液-液分散法，自組裝得到白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白復(fù)合納米顆粒，顆粒粒徑約為70 nm，zeta電位約為9 mV。

對(duì)大麥醇溶蛋白納米顆粒、白藜蘆醇及白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白復(fù)合納米顆粒進(jìn)行差示掃描量熱分析。條件為：以空鋁盒作為參比，升溫速率為10 ℃·min-1，從室溫加熱到300 ℃。

對(duì)大麥醇溶蛋白納米顆粒、白藜蘆醇及白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白復(fù)合納米顆粒進(jìn)行衰減全反射傅里葉變換紅外光譜分析，波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白納米顆粒的形成機(jī)制

2.1.1 熒光猝滅機(jī)理法

Fig.1 Fluorescence quenching spectra of hordein by various concentrations of resveratrol

向大麥醇溶蛋白溶液中加入白藜蘆醇后，其熒光發(fā)生了規(guī)律性的猝滅，熒光猝滅光譜見(jiàn)圖1。

熒光猝滅可分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅。蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合的相互作用關(guān)系遵循Stern-Volmer方程[11]

F0/F=1+Kqτ0c=1+KSVc

(1)

式中：F0和F分別為加入白藜蘆醇前后大麥醇溶蛋白的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù);KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù);τ0為猝滅劑(白藜蘆醇)不存在時(shí)生物大分子(大麥醇溶蛋白)的平均壽命，一般為10-8s;c為猝滅劑的濃度。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理后作圖，如圖2所示。

Fig.2 The Stern-Volmer curves of fluorescence quenching of hordein by resveratrol

由直線(xiàn)的斜率計(jì)算出猝滅常數(shù)，見(jiàn)表1。從表1中可以看出，隨著溫度的升高，KSV減小，根據(jù)猝滅常數(shù)隨溫度變化的趨勢(shì)與猝滅類(lèi)型的關(guān)系[12]，說(shuō)明白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白二者之間發(fā)生了靜態(tài)猝滅，白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白形成了復(fù)合物。另一方面，298和310 K下對(duì)應(yīng)的Kq遠(yuǎn)大于生物分子的最大碰撞擴(kuò)散速率常數(shù)[2.0×1010L·(mol·s)-1][13]，進(jìn)一步推論，白藜蘆醇對(duì)大麥醇溶蛋白的熒光猝滅是由于白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白形成的復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅。

Table 1 Parameters of Stern-Volmer equation for the interaction between resveratrol and hordein

2.1.2 差示掃描量熱法

差示掃描量熱技術(shù)是一種檢測(cè)多種成分之間的熱力學(xué)兼容性的簡(jiǎn)便方法。對(duì)白藜蘆醇純品、大麥醇溶蛋白納米顆粒及白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白復(fù)合納米顆粒進(jìn)行差示掃描量熱分析，如圖3、圖4所示。

比較圖4中的b和c可知，在形成白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白納米顆粒后，體系的玻璃化轉(zhuǎn)化溫度由187 ℃降低到171 ℃，這可能是由于白藜蘆醇作為一種低分子量的化合物，連接在了大麥醇溶蛋白的肽鏈之間，促進(jìn)了肽鏈的流動(dòng)性。另一方面，圖3a中267 ℃處為白藜蘆醇的熔融峰，而在納米顆粒中，未觀(guān)察到這一特征峰，可證實(shí)白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白不是簡(jiǎn)單的物理性混合，而是形成了復(fù)合物[14]。

Fig.3 DSC thermograms of resveratrola, hordein nanoparticlesband resveratrol-hordein nanoparticlesc

Fig.4 DSC thermograms of hordein nanoparticles band resveratrol-hordein nanoparticles c

2.2 白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

從以上討論知白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白的猝滅作用屬于靜態(tài)猝滅，假設(shè)一個(gè)大麥醇溶蛋白分子與白藜蘆醇結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為n，熒光強(qiáng)度與結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和猝滅劑濃度之間符合下列方程[15]

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgcresveratrol

(2)

Fig.5 Plot of double logarithm for the fluorescence quenching of hordein by resveratrol

經(jīng)數(shù)據(jù)處理作出雙對(duì)數(shù)曲線(xiàn)，如圖5所示。求得n和KA，列于表1中。結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n約為1，表明1分子的大麥醇溶蛋白僅與1分子的白藜蘆醇相互作用。

2.3 白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白的相互作用力類(lèi)型

2.3.1 熱力學(xué)參數(shù)法

根據(jù)分子相互作用前后熱力學(xué)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)的相對(duì)大小可判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類(lèi)型。一般認(rèn)為，ΔH>0，ΔS>0時(shí)，分子間以疏水作用力為主；ΔS<0，ΔH<0以氫鍵和范德華力作用為主；ΔH<0，ΔS>0為靜電引力[16]。根據(jù)Van’s Hoff定律有

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS

(3)

lnKA=-ΔH/RT+ΔS/R

(4)

利用式(3)和式(4)求出白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果列于表2中。

Table 2 The binding constants (KA) and relative thermodynamic parameters of the resveratrol-hordein system at different temperatures

T/K298310KA/(L·mol-1)2.21×1051.53×104ΔG/(kJ·mol-1)-30.28-24.63ΔH/(kJ·mol-1)-170.76-170.76ΔS/(J·mol-1·K-1)-471.40-471.40

由表2中的數(shù)據(jù)可知ΔG<0，表明大麥醇溶蛋白與白藜蘆醇之間相互作用為自發(fā)進(jìn)行過(guò)程；ΔH<0，ΔS<0表明白藜蘆醇和大麥醇溶蛋白之間是通過(guò)范德華力和氫鍵的作用[17]而形成了復(fù)合納米顆粒。

2.3.2 傅里葉紅外光譜法

對(duì)白藜蘆醇純品、大麥醇溶蛋白納米顆粒和白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白復(fù)合納米顆粒進(jìn)行傅里葉紅外測(cè)試，結(jié)果如圖6所示。對(duì)于圖6a，3 240 cm-1處吸收峰代表酚類(lèi)的締合羥基，1 606，1 585，1 512以及1 450 cm-1附近的吸收峰代表苯環(huán)的骨架振動(dòng)。比較大麥醇溶蛋白納米顆粒(圖6b)和白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白復(fù)合納米顆粒(圖6c)的傅里葉變換紅外光譜圖可知，大麥醇溶蛋白分子中的氫鍵所對(duì)應(yīng)的3 424 cm-1處吸收峰在復(fù)合納米顆粒中紅移至3 405 cm-1，表明白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白之間形成了新的氫鍵，這在含有大量羥基的白藜蘆醇與大量酰胺基的大麥醇溶蛋白之間是可能發(fā)生的；同時(shí)純蛋白酰胺基的峰位置由1 541 cm-1紅移至復(fù)合物中的1 514 cm-1，可能是白藜蘆醇與蛋白之間存在的范德華力所致[17]。

Fig.6 FTIR spectra of resveratrola, hordein nanoparticlesband resveratrol-hordein nanoparticlesc

2.4 白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白之間的能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，能量轉(zhuǎn)移效率E與供體-受體間距離r0以及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間的關(guān)系為

(5)

式中：F為大麥醇溶蛋白和白藜蘆醇摩爾濃度比為1時(shí)大麥醇溶蛋白的熒光強(qiáng)度；F0為與白藜蘆醇作用前大麥醇溶蛋白的熒光強(qiáng)度；R0是E=50%時(shí)的臨界距離，滿(mǎn)足下式

(6)

式中，K2為偶極空間取向因子，N為介質(zhì)的折射指數(shù)，φ為供體的熒光量子產(chǎn)率，J為供體(大麥醇溶蛋白)熒光發(fā)射光譜與受體(白藜蘆醇)吸收光譜間的重疊積分，可表示為

J=∑F(λ)ε(λ)λ4dλ/∑F(λ)dλ

(7)

其中F(λ)為供體(大麥醇溶蛋白)在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度，ε(λ)為受體(白藜蘆醇)在波長(zhǎng)λ處的摩爾消光系數(shù)。

Fig.7 Overlap of fluorescence emission spectrum of hordein (a) and absorption spectrum of resveratrol (b)

T=298 K，chordein=cresveratrol=1.0×10-5mol·L-1

圖7所示為白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白分子數(shù)比為1∶1時(shí)白藜蘆醇的吸收光譜及大麥醇溶蛋白熒光發(fā)射光譜的重疊光譜圖。利用origin軟件求得重合積分J=1.454×10-14L·cm3·mol-1。通過(guò)同步熒光數(shù)據(jù)可知大麥醇溶蛋白的熒光由色氨酸和酪氨酸殘基共同貢獻(xiàn)，故取熒光量子產(chǎn)率φ為0.135，N取水和異丙醇的折射指數(shù)平均值1.36，K2取大麥醇溶蛋白-白藜蘆醇各向隨機(jī)分布的平均值2/3。把所有已知數(shù)據(jù)代入上述各式，求得E=0.227；R0=2.64 nm，r0=1.23R0=3.25 nm。由計(jì)算結(jié)果知白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白熒光性氨基酸殘基間的空間距離r0<7 nm，且0.5R0

2.5 白藜蘆醇對(duì)大麥醇溶蛋白構(gòu)象的影響

同步熒光光譜常用來(lái)分析蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[20]。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的間距Δλ=15 nm時(shí)，掃描得到Tyr的熒光峰，當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，掃描得到Trp的熒光峰。另外，相應(yīng)氨基酸殘基周?chē)h(huán)境極性的改變會(huì)導(dǎo)致氨基酸殘基熒光峰峰位的變化，故由熒光發(fā)射峰位的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

固定大麥醇溶蛋白的濃度，逐漸增加白藜蘆醇的濃度，繪制大麥醇溶蛋白的同步熒光光譜。圖8(a)和(b)分別為大麥醇溶蛋白中的酪氨酸和色氨酸殘基的熒光譜圖。可看出此實(shí)驗(yàn)條件下大麥醇溶蛋白的熒光由酪氨酸和色氨酸殘基共同貢獻(xiàn)，且隨著白藜蘆醇濃度增大，大麥醇溶蛋白中的酪氨酸殘基熒光峰位不變，而色氨酸殘基的熒光峰位發(fā)生一定程度的紅移(335→340 nm)，表明白藜蘆醇的加入引起大麥醇溶蛋白中色氨酸殘基的微環(huán)境極性增大，疏水性減弱，推測(cè)大麥醇溶蛋白由天然折疊態(tài)逐漸去折疊，結(jié)構(gòu)變得松散，構(gòu)象發(fā)生變化。

Fig.8 Synchronous fluorescence spectra of hordein by various concentrations of resveratrol

chordein=1×10-5mol·L-1;cresveratrol(a→f) are (0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5)×10-5mol·L-1

3 結(jié) 論

利用熒光光譜法、紫外吸收光譜法、差示掃描量熱法以及傅里葉紅外光譜法，研究了白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白納米顆粒中白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白的相互作用問(wèn)題，結(jié)果表明白藜蘆醇對(duì)大麥醇溶蛋白的熒光猝滅作用是由于形成復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅和發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移作用。進(jìn)一步計(jì)算了白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白之間的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，分別為KA(298 K)=2.21×105L·mol-1，KA(310 K)=1.53×104L·mol-1和n298 K=1.23，n310 K=0.94，初步判斷兩者之間主要通過(guò)氫鍵和范德華力結(jié)合，因此可以考慮通過(guò)改變反應(yīng)體系的溶劑類(lèi)型、溫度、pH值等來(lái)增大它們之間的氫鍵和范德華力，從而提高結(jié)合的強(qiáng)度和增強(qiáng)形成的復(fù)合納米顆粒的穩(wěn)定性。通過(guò)非輻射能量轉(zhuǎn)移原理計(jì)算出白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白之間的結(jié)合距離為3.25 nm。同步熒光光譜法表明白藜蘆醇的加入導(dǎo)致大麥醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)變得松散。本研究建立的白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白相互作用的體系，不僅有利于深入了解兩者之間相互作用機(jī)制，同時(shí)對(duì)優(yōu)化白藜蘆醇-大麥醇溶蛋白復(fù)合納米顆粒的制備條件具有重要指導(dǎo)作用。

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*Corresponding author

Study on the Interaction in Resveratrol-Hordein Nanoparticle

GUAN Xiao1, LIU Jing2*, YIN Ting1, LI Jing-jun3, LIAO Li-li4

1. School of Medical Instruments and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China

2. College of Information Engineering, Shanghai Maritime University, Shanghai 200135, China

3. Jiangsu Changshou (Group) Co. Ltd., Rugao 226500, China

4. Guilin Ximai Food Company, Guilin 541004, China

In order to clarify the interaction mechanism of the formation of the resveratrol-hordein nanoparticle, the fluorescence, UV-Vis spectroscopic, FTIR and DSCwere used to study the binding reaction between resveratrol and hordein. The fluorescent emission of hordein was inhibited by resveratrol in a dose dependent manner. Fluorescence spectroscopy and DSC indicated that resveratrol interacted with hordein and formed a new complex by a static process. The binding constant(KA(298 K)=2.21×105L·mol-1，KA(310 K)=1.53×104L·mol-1) and the number of binding sites(n298 K=1.23，n310 K=0.94)were calculated based on the quenching effect of resveratrol on hordein. Thermodynamic parameter and FTIR indicated that the interaction force between resveratrol and hordein was mainly hydrogen binding and van der Waals force. The binding distance(r0=3.25 nm)between resveratrol and hordein and the energy transfer efficiency (E=0.227) were obtained according to non-radiative energy transfer theory. The effect of resveratrol on the conformation of hordein was further analyzed by using synchronous fluorescence spectrometry. The results indicated that resveratrol changed the hydrophobicity of tryptophan residue, which caused an obvious influence on the conformation of hordein.

Resveratrol; Hordein; Interaction

Nov. 13, 2014; accepted Mar. 12, 2015)

2014-11-13，

2015-03-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101348)，上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(14ZR1419200)資助

管 驍，1979年生，上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院副教授 e-mail: gnxo@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: Jingliu@shmtu.edu.cn

TS21

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0163-06