基于共聚焦顯微拉曼的真菌菌絲中幾丁質(zhì)的原位檢測研究

李曉麗，羅榴彬，周斌雄，胡小倩，孫嬋駿，何 勇*

1. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058 2. 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗站，浙江 杭州 310058

基于共聚焦顯微拉曼的真菌菌絲中幾丁質(zhì)的原位檢測研究

李曉麗1，羅榴彬1，周斌雄1，胡小倩2，孫嬋駿1，何 勇1*

1. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058 2. 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗站，浙江 杭州 310058

幾丁質(zhì)是真菌細胞壁中一種重要的結(jié)構(gòu)多糖，本文首次采用共聚焦顯微拉曼技術(shù)對山茶刺盤孢菌的氣生菌絲進行原位檢測研究，首先確定了采集菌絲拉曼光譜的最優(yōu)實驗參數(shù)，并獲得了菌絲，幾丁質(zhì)標準品和背景三種物質(zhì)的典型拉曼光譜，對其中的特征峰進行歸屬分析，發(fā)現(xiàn)菌絲光譜中有明顯的幾丁質(zhì)特征峰。然后對置于載玻片上菌絲的感興趣區(qū)域進行拉曼光譜面掃描，通過主成分分析法發(fā)現(xiàn)面掃描區(qū)域中，菌絲和背景兩種信號可以明顯區(qū)分開來，結(jié)合主成分的載荷因子圖得到了菌絲的兩個主要的特征差異峰1 622和1 368 cm-1，1 622 cm-1屬于菌絲中幾丁質(zhì)的特征峰，而1 368 cm-1是來源于菌絲中的果膠多糖。最后通過對幾丁質(zhì)在1 622 cm-1特征峰波段附近范圍積分，繪制了幾丁質(zhì)在菌絲中二維和三維的化學(xué)成像圖，直觀且無損的再現(xiàn)了幾丁質(zhì)在菌絲中的空間分布。

幾丁質(zhì)；真菌菌絲；共聚焦顯微拉曼；主成分分析；化學(xué)成像

引 言

植物真菌病害是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要病害, 發(fā)病率高(70%～80%)，病害種類最多，造成的損失也最大[1]。真菌感染農(nóng)作物的過程，事實上是真菌與作物的一個互相影響的過程，了解兩者的互作機制對預(yù)防真菌病害有重要意義。

對真菌菌絲進行定性識別和定位檢測是研究和揭示真菌致病機制的關(guān)鍵。傳統(tǒng)真菌檢測的方法主要有兩種，一種是植物病害制片技術(shù)，普通切片可以在光學(xué)顯微鏡下觀察，通過對染病組織進行染色，使得被觀察的真菌顯像清楚[2-3]。超薄切片需要電子顯微鏡下觀察，可以研究真菌更細微的形態(tài)特征以及與植物組織細胞更為密切的關(guān)系[4-5]。但是制片技術(shù)操作繁瑣，最重要的是在大量使用各種化學(xué)試劑之后，植物細胞和真菌已經(jīng)喪失了活力。另一種檢測技術(shù)是熒光蛋白標1記法[6-7]，通過在真菌中插入熒光蛋白分子，借助熒光顯微鏡，可對活細胞進行實時動態(tài)的追蹤[6]，近幾年來在微生物與植物之間的相互作用方面有較多的應(yīng)用。但是對真菌進行熒光蛋白標記操作復(fù)雜，且插入的這段蛋白對真菌本身的影響尚不明確。

共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)是拉曼光譜與顯微技術(shù)的有機結(jié)合，它不僅具有常規(guī)拉曼光譜快速無損、樣品需求量小，無需預(yù)處理等顯著特點，輔以高倍光學(xué)顯微鏡，還能對微觀物體進行高空間分辨率(<1 μm)的信號采集。隨著空間分辨率的不斷提高，使得拉曼光譜對單個細胞的研究成為可能，因此近幾年在微生物學(xué)方面的研究也已有涉足，如白腐菌及其代謝產(chǎn)物的研究[8]，釀酒酵母[9]的分類鑒別，微量元素對芽孢桿菌孢子產(chǎn)生內(nèi)生孢子的影響[10]，細胞色素在菌絲中分布[11]等。因此，用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)對真菌菌絲進行研究是一種全新且可行的手段。

幾丁質(zhì)作為一類纖維狀物質(zhì)，是自然界中存在的唯一堿性同聚多糖[12]，存在于大多數(shù)真菌的細胞壁中，能夠增加細胞壁的機械強度[13]。幾丁質(zhì)處于絲狀真菌細胞壁最內(nèi)層，靠近質(zhì)膜層，是真菌菌絲尖端延長部位的主要組分，因此真菌菌絲的生長與幾丁質(zhì)的生成關(guān)系密切[12]。1988年，Roberts利用近紅外光譜法檢測了高羊茅組織中的幾丁質(zhì)，并測定了內(nèi)生真菌的含量，發(fā)現(xiàn)組織中幾丁質(zhì)的含量與內(nèi)生真菌感染程度相關(guān)性較高(校準系數(shù)和變異系數(shù)分別為0.86和0.84)[14]。由此可見幾丁質(zhì)的信號可以作為真菌存在與否的標記之一，是確定真菌的一種可靠方法。而共聚焦拉曼光譜技術(shù)在幾丁質(zhì)方面的研究已有相關(guān)報道，如對珊瑚中幾丁質(zhì)的研究[15]，幾丁質(zhì)及其乙?；苌锏难芯縖16]，以及對真菌細胞壁中幾丁質(zhì)定量分析的研究[17]等。但是對真菌菌絲中的幾丁質(zhì)進行定性分析，以及對幾丁質(zhì)在菌絲中的分布規(guī)律的定位研究，還未見報道。而此類對真菌菌絲中的幾丁質(zhì)進行的全面分析，是為后續(xù)以幾丁質(zhì)為線索，研究病菌的侵染機制的必要前提。

山茶刺盤孢菌(ColletotrichumcamelliaeMassee)是茶樹云紋葉枯病的病原菌，屬于半知菌亞門刺盤孢屬。是一種有隔的絲狀真菌，分生孢子長橢圓形或長卵形[1]。本文以該種菌屬為例，首次采用共聚焦顯微拉曼光譜原位檢測山茶刺盤孢菌菌絲的拉曼響應(yīng)特性，并著眼于菌絲中幾丁質(zhì)的研究，以期還原幾丁質(zhì)在真菌菌絲中的空間分布，探索菌絲中不同部位幾丁質(zhì)含量的分布規(guī)律。并為下一步以幾丁質(zhì)作為真菌的檢測信號來研究植物-真菌互作機制打下基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 菌絲的準備

山茶刺盤孢菌由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗站提供。保存在4℃冰箱里，然后依據(jù)王志坤[18]論文中所述方法進行活化處理，培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，光照條件下25 ℃培養(yǎng)約5天后，氣生菌絲稀疏，呈灰白色絨狀。用滅過菌的鑷子挑取部分氣生菌絲到一片干凈的載玻片上。在拉曼儀配套的Leica顯微鏡下觀察，50倍物鏡鏡頭下的菌絲狀態(tài)如圖1所示。

1.2 幾丁質(zhì)標準品

幾丁質(zhì)(Chitin)，別名Poly-(1→4)-β-N-acetyl-D-glucosamine，購于sigma公司，產(chǎn)品編號C9752。來源于蝦殼，是高純度粉末狀固體。

Fig.1 Optical microscope images of Colletotrichum camelliae Massee hypha under 50×

1.3 拉曼光譜采集

本研究采用的拉曼儀是英國生產(chǎn)的雷尼紹顯微共聚焦拉曼光譜儀(inVia-Reflex 532/XYZ)。配備固體激光器532 nm，最大激光功率為50 mW。將放置有菌絲的載玻片固定在載物臺上，激光束通過50X的物鏡聚焦到樣本的表面。在菌絲上選定一個感興趣區(qū)域進行拉曼光譜的面掃描，如圖2所示。面掃描區(qū)域一共包括110(11×10)個點，橫縱步長都為1.2 μm，每點采集的激光曝光時間為10 s，激光功率是0.5 mW，采集次數(shù)為一次，拉曼位移范圍為3 200～200 cm-1，整個實驗過程都是在恒溫(約25 ℃)條件下進行的。圖2(a)中的黑色小方框內(nèi)區(qū)域即為面掃描區(qū)域，圖2(b)是其放大示意圖，可以看到掃描區(qū)域包括菌絲和背景兩部分。圖2(c)是所有110個樣本點的拉曼光譜圖。圖2(d)是面掃描區(qū)域中第一行的11個樣本點處的拉曼光譜圖。

Fig.2 (a) Optical microscope images of scanning region(Rectangular box); (b) Cube figure of Raman acquisition; (c) Raman spectra of all sampling points; (d) Raman spectra of first row in the scanning region

1.4 幾丁質(zhì)拉曼光譜的采集

幾丁質(zhì)標準品的拉曼光譜獲取采用跟真菌同樣的儀器參數(shù)，即10秒曝光時間，0.5 mW激光功率，連續(xù)采集6個點，取平均值作為幾丁質(zhì)標準品的拉曼光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌絲拉曼信號采集的參數(shù)優(yōu)化研究

樣本拉曼光譜采集的參數(shù)優(yōu)化是獲取高質(zhì)量譜線的關(guān)鍵。褚立強用拉曼光譜研究木質(zhì)纖維素類植物的時候，發(fā)現(xiàn)在激光的照射下，木質(zhì)素在1 601 cm-1左右的特征峰強會隨著激光照射時間的延長而逐漸減弱。這是由于木質(zhì)素的光降解引起的[19]。因此在研究真菌菌絲的拉曼信號之前，首先要確定真菌的拉曼信號是否也存在一個光降解的過程。

影響激光光強有兩個參數(shù)，激光功率和曝光時間。由于真菌是生物樣本，此類樣本的特點是拉曼信號相對較弱，且樣本容易被激光所灼傷。因此在盡量凸顯信號又不燒壞樣本的前提下，經(jīng)過反復(fù)嘗試優(yōu)化，設(shè)定激光功率為0.5 mW。接下來確定曝光時間，由于采集的范圍200～3 200 cm-1屬于全譜掃描，因此最短的曝光時間是10 s。圖3是菌絲上的某一采樣點在不同曝光時間下的拉曼光譜圖，一共有15條光譜，從下往上激光照射時間逐漸增長。第一條光譜的曝光時間為10 s，第二條為20 s，第三條30 s，以此類推，第十五條為150 s。從圖中可以看到，隨著激光照射時間的不斷增長，光譜的最大拉曼強度值在不斷增加，第十五條光譜的最大拉曼強度值是第一條光譜最大拉曼強度值的4倍左右。譜線中位于1 622 cm-1處的峰最為明顯，且在15條光譜中一直存在。從圖3中也可以看到，1 622 cm-1處的峰的峰強值也是呈一個逐漸上升的趨勢。

Fig.3 Comparison of Raman spectra of raw Colletotrichum camelliae Massee for various laser exposure time (acquisition time of each spectrum: 10 s)

由于峰的絕對高度值會受到背景，儀器信號的干擾，因此接下來用相對峰值來進行說明。在上述不同曝光時間下，通過1 622 cm-1處的峰值與所有波段200～3 200 cm-1的峰高之和的比值變化來說明菌絲的特征峰是否存在一個光降解過程。結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看到隨著激光的照射時間的不斷增長，1 622 cm-1處的相對峰強在逐漸減弱。這是因為激光的曝光時間越長，熒光包越大，背景信號的干擾越大，雖然1 622 cm-1處的峰的絕對高度在上升，但是這個峰的升高是由于熒光增強引起的。而且可以看到1 622 cm-1處的相對峰值基本上是呈一個指數(shù)下降的趨勢，第一點和第二點之間的變化最為明顯。說明前20 s之內(nèi)真菌的拉曼信號會急劇減弱，隨后減弱趨勢比較緩和。因此在前面設(shè)置實驗參數(shù)的時候曝光時間設(shè)定為10 s。

Fig.4 Relationship between exposure time and relative Raman intensity of 1 622 cm-1

2.2 菌絲典型拉曼光譜分析

首先選取面掃描區(qū)域內(nèi)位于菌絲上的一采樣點，提取其拉曼光譜信號。由于真菌樣本是置于載玻片上，并且處在一個和外界相連的環(huán)境下進行測量的，因此會有一系列的背景信號會對真菌的信號產(chǎn)生干擾，包括承載菌絲的載玻片信號，電腦顯示器光源信號，以及空氣信號等。因此同時也選取位于載玻片上但遠離菌絲的一點拉曼光譜作為背景信號用于與真菌信號進行對比。最后還采集了幾丁質(zhì)標準品的拉曼信號。三種物質(zhì)的拉曼光譜圖如圖5所示，黑色，紅色和藍色的譜線分別是幾丁質(zhì)，真菌和背景的信號。三條拉曼光譜都是經(jīng)過WIRE3.3軟件中基線校正和歸一化功能預(yù)處理過的。

當(dāng)然菌絲中的拉曼信號中除了幾丁質(zhì)，還包括一些多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等，比如在1 444 cm-1的峰也出現(xiàn)在脂肪的拉曼光譜中[22]，1 368 cm-1的峰屬于果膠多糖[21]，而蛋白質(zhì)中的氨基在1 600 cm-1多也有很多特征峰[22]。

背景的拉曼峰如藍色線所示，可以看到主要有兩個較高的峰對樣本有干擾，分別是481和2 447 cm-1。這兩個峰在不放置任何樣本的時候，也會出現(xiàn)，因此可能是空氣[23]或者系統(tǒng)自帶的噪聲。表1對真菌中出現(xiàn)的屬于幾丁質(zhì)的特征峰所對應(yīng)的振動基團做出了總結(jié)。

Fig.5 Raman spectra of chitin, Colletotrichum camelliae Massee and background

Table 1 Raman bands assignment in hyphae

2.3 PCA聚類分析

通過菌絲典型譜線的分析，發(fā)現(xiàn)了菌絲中的特征峰，為了對所有菌絲樣本的譜線有整體的認識，采用主成分分析法對全部110個樣本的拉曼光譜進行了統(tǒng)計分析。由于菌絲的掃描區(qū)域包含了真菌和背景兩種信號，如圖2(b)中所示，顯然這兩種物質(zhì)的信號是明顯不同的?？梢源致缘膹膱D2(d)中看到，兩種物質(zhì)的拉曼強度有高低，拉曼的特征峰位置也不一樣。首先根據(jù)光學(xué)顯微鏡下面掃描區(qū)域圖，將這110個點分成兩類，一類是位于菌絲上的點，一共有37個點；另一類是位于載玻片上的點，有73個點。然后將這110條拉曼光譜用主成分分析法PCA進行統(tǒng)計分析。結(jié)果如圖6所示，可以看到樣本在主成分空間分布呈現(xiàn)兩種狀態(tài)，一類比較密集的藍色點是背景的信號，一類比較疏散的紅色點是菌絲的信號。由于背景信號主要由玻璃、空氣、光線等無機物組成，

Fig.6 PCA scores plot of Raman spectra from all 110 sampling points

在空間的分布比較均勻，因此信號相對穩(wěn)定，重復(fù)性高，所以呈密集分布。而菌絲作為生物組織，存在多樣性，因此在空間上的分布是多變的，所以信號比較分散，在得分圖中分布稀疏。

由于用前兩個主成分能夠解釋原始光譜中99%以上的信息，而且背景和菌絲的兩種樣本在主成分1和主成分2空間里分界線清晰，表明前兩個主成分分量能夠很好的反映兩類樣本的根本差異。而主成分分量與原始拉曼光譜數(shù)據(jù)的關(guān)系可以通過載荷因子來體現(xiàn)，所以分析主成分分量的載荷因子將有助于揭示兩類樣本的光譜特征差異，主成分1和主成分2的載荷因子圖如圖7所示，載荷因子圖中權(quán)重系數(shù)大的峰即是影響該主成分分量的主要因子。從圖7中可以看到，拉曼位移在481，1 368，1 622和2 447 cm-1對應(yīng)峰是影響主成分2的主要因子，而主成分1上明顯的峰僅有1 622 cm-1。用載荷因子圖分析的出來的這些峰恰恰都是前面對原始光譜分析中真菌和背景最主要的幾個信號位置。表明這四個峰是反應(yīng)菌絲和背景特性的特征峰，其中以1 622 cm-1處的峰最為明顯，可以作為ColletotrichumcamelliaeMassee真菌中幾丁質(zhì)的特征峰。

Fig.7 Loading weight plot of the first two principal components

2.4 幾丁質(zhì)的化學(xué)成像分析

化學(xué)成像是基于分子或化學(xué)成分所對應(yīng)的特征光譜頻率實現(xiàn)該分子或化學(xué)成分的定性、定量分析，同時結(jié)合空間信息還可以實現(xiàn)定位分析。是對樣本光譜和空間信息的同時測量來獲取其分子或化學(xué)成分分布的一種可視化分析，目前化學(xué)成像技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物分析和技術(shù)領(lǐng)域?；趲锥≠|(zhì)在1 622 cm-1波數(shù)附近的特征拉曼光譜對氣生菌絲中幾丁質(zhì)進行化學(xué)成像分析，化學(xué)成像過程如圖8所示。圖8(a)是菌絲在光學(xué)顯微鏡下的圖像，也是此次采集拉曼光譜的感興趣區(qū)域。圖8(b)是拉曼成像光譜的積分范圍，也是成像最關(guān)鍵的一步，我們以1 622 cm-1為中心，對1 620～1 625 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的拉曼強度進行積分，然后對氣生菌絲上各點在該波數(shù)范圍的積分進行二維成圖分析，得到如圖8(c)所示的氣生菌絲中幾丁質(zhì)的分布圖，可以看到幾丁質(zhì)在空間的分布和顯微鏡下菌絲的形狀基本上吻合，一方面說明化學(xué)成像圖反應(yīng)的的確是菌絲的信號，另一方面也說明了幾丁質(zhì)幾乎覆蓋了整個菌絲，這也恰恰驗證了幾丁質(zhì)是真菌細胞壁的一種重要成分。然后根據(jù)右邊的顏色棒，從黑色到紅色到黃色到白色的過程中，拉曼強度值在不斷上升，也就是說對應(yīng)的幾丁質(zhì)含量在增加。圖8(c)中，有一根主桿菌絲和兩根分支菌絲，可以看到幾丁質(zhì)在主桿菌絲上分布較多，且在分支點處含量最多，而兩根分支菌絲上的幾丁質(zhì)含量相對較少。分支菌絲由于是從主桿菌絲上分化而來，生成時間較主桿菌絲短，因此細胞壁中幾丁質(zhì)的積累量沒有主桿菌絲上的多。而分支點上高含量的幾丁質(zhì)可能是因為菌絲從這個點分化出去，需要有一定的支撐量，而幾丁質(zhì)作為一種結(jié)構(gòu)多糖，在維持細胞壁的形態(tài)，菌絲結(jié)構(gòu)方面有重要作用[13]，因此富集在這個分支點，對分支菌絲起到了一定的支撐作用。幾丁質(zhì)在這個菌絲分支區(qū)域的含量分布非常類似于Walter在研究細胞色素在菌絲分支區(qū)域的分布規(guī)律[11]，細胞色素同樣也是富集于分支點。因此可以猜想菌絲的分支區(qū)域是一個能量的富集中心。圖8(d)是幾丁質(zhì)在菌絲中分布的三維圖像，可以更加直觀的看到幾丁質(zhì)在菌絲中的分布。

Fig.8 Chemical images of Colletotrichum camelliae Massee on the chitin Raman bands (1 620～1 625 cm-1)

3 結(jié) 論

采用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)研究了山茶刺盤孢菌菌絲的典型拉曼光譜，分析發(fā)現(xiàn)菌絲中存在明顯的幾丁質(zhì)特征拉曼指紋譜帶，并進一步結(jié)合數(shù)學(xué)方法驗證了這些特征譜段具有統(tǒng)計學(xué)意義，基于1 622 cm-1處的指紋譜帶能夠?qū)崿F(xiàn)山茶刺盤孢菌菌絲的定性分析。同時基于這些特征峰以及菌絲的微觀圖像信息繪制出了幾丁質(zhì)在菌絲中的化學(xué)成像圖，分析發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)分布在整個菌絲中，并且在菌絲的分支點處含量最多，分支后的菌絲中的幾丁質(zhì)含量比原先菌絲上幾丁質(zhì)的含量少一些。本研究表明采用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)，利用山茶刺盤孢菌中幾丁質(zhì)的特征峰，可以實現(xiàn)真菌的定性定位分析，并獲得了幾丁質(zhì)在菌絲中的空間分布圖。為后續(xù)研究植物-真菌互作機制提供了新的視角。

[1] YE Gong-yin(葉恭銀). Plant Protection(植物保護學(xué)). Zhejiang: Zhejiang University Press(浙江：浙江大學(xué)出版社)，2006.

[2] YU Zhong-dong, LI Yan, LI Deng-wu(余仲東, 李 琰, 李登武). Journal of Wuhan Botanical Research(武漢植物學(xué)研究), 2005, 23(6): 588.

[3] LU Xiao-hong, ZHU Shu-sheng, LIU Xi-li(盧曉紅, 朱書生, 劉西莉). Acta Phytopathologica Sinica(植物病理學(xué)報), 2009, 39(4): 435.

[4] QUE You-xiong, SONG Xian-xian, XU Li-ping, et al(闕友雄，宋弦弦，許莉萍, 等). Letters in Biotechnology(生物技術(shù)通訊), 2009, 20(2): 282.

[5] LI Ai-zhen(李愛貞). Thesis of Doctor Degree of Agricultural University of Hunan(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士研究生學(xué)位論文), 2000.

[6] PAN Hong, LEI Zhen-zhen, XU Ke-jing, et al(潘 虹, 雷珍珍, 許可靜, 等). Guangdong Agricultural Sciences(廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)), 2012, 3: 150.

[7] Czaikowski R, deBoer W J, Velvis H, et al. The American Phytopathological Society, 2010, 100(2): 134.

[8] Yamashita H, Tsubokawa S, Endo A, et al. The Journal of Antibiotics, 1985, 38: 605.

[9] Rodriguez S B, Thornton M A, Thornton R J. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79: 6264.

[10] Stockel S, Meisel S, Bohme R, et al. Journal of Raman Spectroscopy, 2009, 40: 1469.

[11] Walter A, Erdmann S, Bocklitz T, et al. Analyst, 2010, 5: 908.

[12] DAI Yang-yong, CAO Jian, LI Lang, et al(代養(yǎng)勇, 曹 健, 李 浪, 等). Journal of Zhengzhou Institute of Technology(鄭州工程學(xué)院學(xué)報), 2004, 25(3): 88.

[13] ZHOU De-qing(周德慶). Microbiology(微生物學(xué)). Beijing: Higher Education Press(北京：高等教育出版社), 2002.

[14] Roberts C A, Barton F E, Moore K J. Agronomy Journal, 1988, 80: 737.

[15] Bo M, Bavestrello G, Kurek D, et al. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 51: 129.

[16] Zhang K, Geissler A, Fischer S, et al. Journal of Physical Chemistry B, 2012, 116: 4584.

[17] Lee C M, Cho E M, Yang S I, et al. Bulletin of the Korean Chemical Society, 2013, 34(3): 943.

[18] WANG Zhi-kun, TAN Wan-zhong, ZHANG Ke-cheng, et al(王志坤, 譚萬忠, 張克誠, 等). Henan Agricultural Science(河南農(nóng)業(yè)科學(xué)), 2008, 4: 67.

[19] Chu L Q, Masyuko R, Sweedler J V, et al. Bioresource Technology, 2010, 101: 4919.

[20] Szymańska-Chargot M, Cybulska J, Zdunek A. Sensors, 2011, 11(6): 5543.

[21] Himmelsbach D S, Akin D E. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(3): 991.

[22] Schulz H, Baranska M. Vibrational Spectroscopy, 2007, 43(1): 13.

[23] LIU Chang-ling, YE Yu-guang, LU Hai-long, et al(劉昌嶺, 業(yè)渝光, 盧海龍, 等). Geoscience(現(xiàn)代地質(zhì)), 2008, 22(3): 480.

[24] Gussem K D, Vandenabeele P, Verbeken A, et al. Spectrochimica Acta Part A, 2005, 61: 2896.

[25] Martin R, Hild S, Walther P, et al. The Biological Bulletin, 2007, 213(3): 307.

*Corresponding author

In Vivo Study of Chitin in Fungal Hyphae Based on Confocal Raman Microscopy

LI Xiao-li1，LUO Liu-bin1，ZHOU Bin-xiong1, HU Xiao-qian2，SUN Chan-jun1，HE Yong1*

1. College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China

2. Agricultural Experiment Station, Zhejiang University，Hangzhou 310058，China

Chitin is an important structural polysaccharide of fungal cell wall. In this paper, aerial hyphae ofColletotrichumcamelliaeMassee was first studied by confocal Raman microscopy in vivo. Firstly, the optimal experimental parameters of hyphae for collecting the Raman spectra were determined, and the typical Raman spectra of hyphae, chitin standard and background were acquired. By comparing analysis, characteristic peaks of chitin were found in hyphae. Then, a region of interesting on hyphae was selected for Raman scanning. Through principal component analysis, the Raman signal of hyphae and background in the scanning area can be separated clearly. Combined with loading weight plot, two main characteristic peaks of hyphae were obtained, 1 622 cm-1was belong to chitin and 1 368 cm-1was assigned to pectic polysaccharide. Finally, two and three dimension chemical images of fungal hyphae were realized based on Raman fingerprint spectra of chitin in a nondestructive way.

Chitin; Fungal hyphae; Confocal Raman microscopy; Principal components analysis; Chemical imaging

Aug. 12, 2014; accepted Dec. 10, 2014)

2014-08-12，

2014-12-10

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目(2014C32091)，國家自然科學(xué)基金項目(61201073, 31471417)資助

李曉麗，女，1982年生，浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院副教授 e-mail: xiaolili@zju.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: yhe@zju.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0119-06