鼻咽癌組織拉曼光譜研究進(jìn)展

許智宏， 黃 偉，2*， 林 多， 戈小松， 林學(xué)亮， 馮尚源， 李永增， 陳 榮

1. 醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室， 福建省光子技術(shù)重點實驗室， 福建師范大學(xué)， 福建 福州 350007

2. 福建省計量科學(xué)研究院， 福建 福州 350003

鼻咽癌組織拉曼光譜研究進(jìn)展

許智宏1， 黃 偉1，2*， 林 多1， 戈小松1， 林學(xué)亮1， 馮尚源1， 李永增1， 陳 榮1

1. 醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室， 福建省光子技術(shù)重點實驗室， 福建師范大學(xué)， 福建 福州 350007

2. 福建省計量科學(xué)研究院， 福建 福州 350003

鼻咽癌是東南亞地區(qū)及中國南方地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤， 具有獨特的地理、 種族分布特點， 并且存在惡性程度高、 預(yù)后差、 早期診斷困難等問題。 拉曼光譜技術(shù)是基于非彈性光散射基本原理的一種快速且無損的檢測方法， 能夠在分子振動水平上提供生化成分等信息。 綜述基于拉曼光譜技術(shù)的鼻咽癌組織研究最新進(jìn)展。 主要介紹了國內(nèi)外小組采用拉曼光譜及表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)進(jìn)行鼻咽癌組織檢測研究的概況， 其中重點介紹該研究小組近期在鼻咽癌組織的高波數(shù)拉曼光譜、 鼻咽癌組織涂片的拉曼光譜， 以及研發(fā)的人活體鼻咽癌組織內(nèi)鏡檢測裝置及其臨床實驗情況。 最后， 對鼻咽癌組織拉曼光譜研究的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

鼻咽癌組織； 拉曼光譜； 高波數(shù)； 咽拭； 活體

引 言

鼻咽癌是一種發(fā)生在鼻咽頂部和側(cè)壁粘膜的頭頸部惡性腫瘤， 超過80%的鼻咽癌病例來自中國、 東南亞和一些亞洲國家。 常規(guī)鼻咽內(nèi)窺鏡白光檢查、 磁共振成像、 計算機(jī)斷層掃描等方法還不能夠?qū)崿F(xiàn)快速、 有效地對鼻咽癌進(jìn)行診斷。 最終確診還需依靠內(nèi)鏡下活檢取樣進(jìn)行病理分析， 但這種方法對鼻咽部具有創(chuàng)傷性， 給病人帶來痛苦， 同時還容易導(dǎo)致誤診和漏診。 因而， 尋求一種無損、 快速的檢測新方法是鼻咽癌診斷的重要研究課題。

拉曼光譜是一種無損、 快速、 有效的光學(xué)診斷技術(shù)。 拉曼光譜具有譜峰清晰尖銳、 拉曼頻移與入射光頻率無關(guān)、 水的影響小、 靈敏度高等優(yōu)點， 它在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域備受關(guān)注。 將拉曼光譜應(yīng)用于鼻咽癌等癌瘤疾病的研究一直是物理、 光學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[1]。

1 離體鼻咽癌組織的拉曼光譜

2003年， 加拿大BC癌癥研究中心Haishan Zeng等[2]， 對鼻咽癌離體組織率先開展拉曼光譜研究， 發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織和正常鼻咽組織的拉曼光譜在1 290～1 320， 1 420～1 470和1 530～1 580 cm-1這三個波數(shù)范圍存在明顯差異。 2009年， 黃偉等通過對比鼻咽癌組織離體后1～4 h內(nèi)不同時間的拉曼光譜差異， 指出應(yīng)該盡可能地縮短被測組織離開人體的時間， 可獲得到較滿意的拉曼測試結(jié)果。 2012年郭周義等[3]利用顯微共聚焦拉曼光譜儀對63位患者的鼻咽離體組織開展研究工作， 并結(jié)合基因算法(genetic algorithm, GA)和線性判別分析(linear discriminant analysis， LDA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)地分析， 其結(jié)果表現(xiàn)高特異性。 2013年本課題組李永增等[4]利用顯微共聚焦拉曼系統(tǒng)測量了74例鼻咽離體組織塊的拉曼光譜。 研究發(fā)現(xiàn)， 鼻咽正常組織和癌變組織表現(xiàn)幾個明顯的特征峰， 分別在853， 937， 1 094， 1 209， 1 268， 1 290， 1 340， 1 579和1 660 cm-1。 同年， Bingling Chen等[5]評估了拉曼光譜對鼻咽癌離體組織診斷的四種分類算法， 其中包括貝葉斯分類法(BC)， LDA， 主成分分析(PCA)， GA-LDA法。 通過分析， PCA-BC分類法顯示出最高的靈敏度、 特異性和總體癌癥診斷的準(zhǔn)確性。 實驗結(jié)果表明， 拉曼光譜結(jié)合BC方法在鼻咽癌的檢測和診斷上具有足夠大的潛力。 2015年李永增等[6]通過兩種診斷算法PCA-LDA， 偏最小二乘法-判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)對獲取的拉曼數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類分析， 其結(jié)果顯示利用PCA-LDA診斷算法對鼻咽癌離體組織的檢測靈敏度達(dá)81%， 特異性達(dá)87%； 而利用PLS-DA算法分析后， 可獲得85%的診斷靈敏度， 88%的診斷特異性。 2016年邱素芳等[7]深入分析了鼻咽癌TNM綜合分期的常規(guī)拉曼光譜測量， 發(fā)現(xiàn)早晚期鼻咽癌組織的拉曼光譜在1 004和1 209 cm-1峰位強(qiáng)度的顯著差異。 他們還指出不論在組織、 細(xì)胞、 血液或者其他癌組織中， 歸屬苯基丙氨酸C—C鍵對稱伸縮振動的1 004 cm-1譜峰位置都是穩(wěn)定存在的， 它可作為鑒別鼻咽癌早晚期的特征標(biāo)志拉曼峰。

2009年， 馮尚源等[8]基于金納米粒子的SERS技術(shù)對鼻咽癌組織手術(shù)切片開展研究， 同時利用SERS成像技術(shù)分析病變組織和正常組織的生化成分(圖1)。 研究發(fā)現(xiàn)， 涂有金膠的鼻咽癌切片組織的SERS光譜較常規(guī)拉曼光譜增強(qiáng)效果明顯(圖2)， 正常和癌變鼻咽組織切片的SERS光譜譜峰位置和相對峰值強(qiáng)度上存在差異。

圖1 (a)正常組織的962 cm-1(氨基酸分析)SERS成像圖； (b)癌組織的962 cm-1(氨基酸分析)拉曼成像圖

圖2 (a)涂有金膠的鼻咽癌組織的近紅外SERS光譜； (b) 未涂有金膠的鼻咽癌組織的拉曼光譜； (c) 金膠的拉曼背景信號

Fig.2 (a) NIR-SERS spectrum of the cancerous nasopharyngeal tissue section with Au colloid, (b) the Raman spectrum of cancerous nasopharyngeal tissue section without the gold sol, and (c) the background Raman signal of Au colloid[9]

以上針對離體鼻咽癌組織拉曼光譜的研究結(jié)果， 顯示了拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于鼻咽癌組織檢測分析的可行性和巨大潛力， 為開展進(jìn)一步研究提供了良好的基礎(chǔ)。

2 鼻咽癌組織的高波數(shù)拉曼光譜

以上針對鼻咽癌離體組織拉曼光譜研究主要集中在低波數(shù)指紋區(qū)(400～1 800 cm-1)， 該范圍能揭示細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)、 核酸等主鏈結(jié)構(gòu)的特定信息[4]。 然而， 人體組織的拉曼信號極其微弱， 易被人活體組織自體熒光信號湮沒， 這將嚴(yán)重影響低波數(shù)區(qū)拉曼光譜檢測效率。 而高波數(shù)(2 600～3 600 cm-1)拉曼光譜受自體熒光干擾較小， 已成為當(dāng)前組織拉曼光譜研究的重要趨勢之一[9-11]。

與組織低波數(shù)區(qū)域拉曼光譜相比， 結(jié)合低波數(shù)和高波數(shù)拉曼光譜對組織檢測有以下優(yōu)勢： (1)低波數(shù)區(qū)域的組織拉曼光譜被強(qiáng)烈的組織自體熒光背景干擾湮沒， 而高波數(shù)區(qū)域的拉曼光譜還仍然具有診斷信息的強(qiáng)烈拉曼峰； (2)低波數(shù)區(qū)和高波數(shù)區(qū)的拉曼光譜信號， 能提供相互補(bǔ)充的生物分子層面的信息； (3)高波數(shù)區(qū)的拉曼光譜信號與激光的波數(shù)間隔較遠(yuǎn)， 對濾光系統(tǒng)的要求較低。 因此將低波數(shù)和高波數(shù)區(qū)域的拉曼光譜相結(jié)合， 能提高對組織光譜特征描述及其診斷效果[10]。 2015年， 由黃偉等[11]首次結(jié)合低、 高波數(shù)拉曼光譜對78例鼻咽癌與非癌組織開展研究， 發(fā)現(xiàn)在2 800～3 100 cm-1拉曼光譜范圍內(nèi)， 存在明顯的四個特征譜峰： 2 854， 2 874， 2 934和3 067 cm-1(圖3)， 這些特征可能與組織內(nèi)的脂質(zhì)、 蛋白質(zhì)相關(guān)。 結(jié)果還顯示， 與單獨采用低波數(shù)拉曼光譜或單獨采用高波數(shù)拉曼光譜進(jìn)行鼻咽癌檢測的結(jié)果相比， 將高波數(shù)和低波數(shù)的拉曼光譜相結(jié)合進(jìn)行判別分析， 能得到更高的靈敏度和特異性[11]。

圖3 鼻咽癌與非癌組織的低波數(shù)(800～1 800 cm-1)與高波數(shù)(2 800～3 100 cm-1)平均拉曼光譜圖

Fig.3 Mean intensities of FP/HW Raman spectra from NPC tissue and non-cancerous tissue[12]

3 鼻咽癌組織涂片的拉曼光譜

通過內(nèi)窺鏡活檢獲取鼻咽癌組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查或進(jìn)行離體拉曼光譜檢測， 這些方法過程復(fù)雜， 成本較高， 并給病人造成創(chuàng)傷與痛苦。 最近， 本研究提出一種將拉曼光譜技術(shù)與鼻咽拭子相結(jié)合的方法， 以探索鼻咽癌篩查的無損檢測方法。 2015年， 本研究與福州市第一醫(yī)院孫麗清等結(jié)合低、 高波數(shù)拉曼光譜對鼻咽癌和非癌組織咽拭涂片進(jìn)行了研究。 對74例鼻咽咽拭涂片樣本進(jìn)行光譜檢測， 均能采集到較高質(zhì)量的拉曼信號(圖4)。 經(jīng)過多元統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)， 鼻咽癌組織涂片通過采用常規(guī)拉曼方法， 分別能夠?qū)崿F(xiàn)87.2%的診斷靈敏度和85.7%的特異性[12]。 組織咽拭涂片拉曼光譜檢測還有待進(jìn)一步研究， 希望為鼻咽癌的無損(或微損)臨床篩查提供新方法。

4 活體鼻咽癌組織的拉曼光譜

要實現(xiàn)鼻咽癌的拉曼光譜早期診斷與定位， 最關(guān)鍵的是應(yīng)開展并實現(xiàn)人活體鼻咽癌組織的拉曼光譜檢測。 由于人體組織熒光信號強(qiáng)度遠(yuǎn)大于拉曼光譜信號， 而探測系統(tǒng)如光纖中的石英產(chǎn)生的拉曼及熒光信號也會對檢測造成干擾[11-12]。 人活體檢測要求快速準(zhǔn)確， 鼻腔組織檢測還必須借助內(nèi)窺鏡進(jìn)行， 而內(nèi)窺鏡活檢孔又限制對光纖探頭的尺寸。 人活體腔內(nèi)組織， 包括鼻咽癌組織的拉曼光譜檢測至今仍是國際性熱點與難點。 2012年至今， 福建師范大學(xué)項目組與加拿大BC癌研究中心曾海山教授聯(lián)合， 綜合采用拉曼光譜、 反射光譜與熒光圖像技術(shù)、 雙波長激光激發(fā)技術(shù)(785與690 nm)、 高波數(shù)與低波數(shù)拉曼光譜檢測技術(shù)， 研發(fā)了一種鼻咽癌內(nèi)鏡活

體組織快速檢測裝置， 并在福建省腫瘤醫(yī)院投入實驗研究， 首次測量獲得了人活體鼻咽癌組織的拉曼光譜、 反射光譜與熒光圖像信息[13-16]。 目前這一研究還在繼續(xù)開展。

圖4 (a)鼻咽組織咽拭涂片的平均拉曼光譜圖， 陰影部分表示平均譜的標(biāo)準(zhǔn)偏差； (b) 鼻咽癌與非癌咽拭涂片拉曼光譜的晚驗概率分布圖

Fig.4 (a) Average Raman spectra of nasopharyngeal tissue smear samples, the shaded areas represent the standard deviations of the means; (b) Scatter plots of the posterior probability for noncancerous and cancerous nasopharyngeal tissue smear classification[12]

5 結(jié)束語

隨著現(xiàn)代光機(jī)電技術(shù)的發(fā)展， SERS技術(shù)、 高波數(shù)拉曼光譜以及鼻咽拭子方法等新技術(shù)新方法的應(yīng)用， 將大大促進(jìn)鼻咽癌組織拉曼光譜研究的開展。 鼻咽癌組織拉曼光譜研究已從離體進(jìn)入活體研究階段， 研究已獲重要進(jìn)展。 根據(jù)本工作的初步研究， 活體鼻咽癌組織的拉曼光譜與離體狀態(tài)有較大差異， 而達(dá)到最終臨床實用， 還應(yīng)實現(xiàn)對不同分期鼻咽癌， 特別是早期鼻咽癌的檢測。 為此， 仍還面臨著挑戰(zhàn)。 但堅信， 在物理、 光學(xué)以及醫(yī)學(xué)科學(xué)家的共同努力下， 拉曼光譜技術(shù)必將在鼻咽癌早期檢測研究中發(fā)揮重要作用。

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[16] CHEN Rong， HUANG Wei， FENG Shang-yuan， et al(陳 榮， 黃 偉， 馮尚源， 等). CN. Patent， 201620501385. 4， 2016. 5. 30.

[17] CHEN Rong， LIN Ju-qiang， FENG Shang-yuan， et al(陳 榮， 林居強(qiáng)， 馮尚源， 等). CN. Patent, 201620501385.4, 2016, 5: 30.

*Corresponding author

Advances in Raman Spectroscopy for Nasopharyngeal Carcinoma Tissue

XU Zhi-hong1， HUANG Wei1,2*， LIN Duo1， GE Xiao-song1， LIN Xue-liang1, FENG Shang-yuan1， LI Yong-zeng1，CHEN Rong1

1. Key Laboratory of OptoElectronic Science and Technology for Medicine， Ministry of Education， Fujian Normal University， Fuzhou 350007， China

2. Fujian Metrology Institute, Fuzhou 350003, China

Nasopharyngeal carcinoma is a unique malignant tumor that has a distinct geographic and racial distribution, with a high incidence in southeast Asia and southern China. High degree of malignancy, poor prognosis and difficulty in early diagnosis remain a problem in nasopharyngeal carcinoma. Raman spectroscopy technique based on inelastic scattering is a rapid and nonivasive detection method, which is capable of providing the information of biochemical components at molecular vibration level.This article reviewed the recent research progress of nasopharyngeal carcinoma based on Raman spectroscopy. It mainly introduces the study of detecting nasopharyngeal carcinoma tissue by using Raman spectroscopy as well as surface-enhanced Raman scattering spectroscopy (SERS). The emphasis is put on the latest works by our research group, including high wavenumber Raman spectroscopy of tissue, Raman spectroscopy of tissue smears, and a specially designed endoscopic device combined with Raman spectroscopy for in vivo nasopharyngeal cancerous tissue detection, which was firstly developed by our group. Finally, the prospects of the development of Raman spectroscopy for nasopharyngeal carcinoma were discussed.

Nasopharyngeal carcinoma； Raman spectroscopy； High wavenumber； Tissue smear； In vivo

Jun. 12, 2016; accepted Jul. 4, 2016)

2016-06-12，

2016-07-04

國家自然科學(xué)基金項目(61210016， 61178090， 61405036)， 長江學(xué)者和創(chuàng)新研究團(tuán)隊項目(IRT15R10)資助

許智宏， 1991年生， 福建師范大學(xué)光電與信息工程學(xué)院碩士研究生 e-mail： xzh91715@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail： huang84wei@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)08-2518-04