花椒根腐病生防芽孢桿菌的篩選鑒定及定殖和防治效果

李姝江，朱天輝，譙天敏，韓　珊

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，四川 成都 611130)

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花椒根腐病生防芽孢桿菌的篩選鑒定及定殖和防治效果

李姝江，朱天輝，譙天敏，韓珊

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，四川 成都 611130)

[摘要]【目的】 對花椒根腐病生防芽孢桿菌進(jìn)行分離、篩選、定殖和防效評價(jià)，為開發(fā)高效、穩(wěn)定、持久的生物農(nóng)藥提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。【方法】 采用稀釋平板涂布法分離健康花椒根際土中的芽孢桿菌，利用點(diǎn)菌法和打孔法2次篩選拮抗效果最佳的芽孢桿菌，根據(jù)形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)對其進(jìn)行初步鑒定，并測定其對1年生花椒根腐病的防治效果。用鏈霉素標(biāo)記拮抗芽孢桿菌，并檢測該菌在花椒根際及根內(nèi)土壤中的定殖動(dòng)態(tài)，以此為基礎(chǔ)，運(yùn)用灌根法對花椒根腐病進(jìn)行預(yù)防和治療處理，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果?！窘Y(jié)果】 在分離獲得的20株芽孢桿菌中，編號為B3的菌株拮抗作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)26.0 mm，高溫處理后仍具有活性，初步確定其為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，花椒根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)隨B3菌株發(fā)酵液稀釋倍數(shù)增加而增加，B3發(fā)酵液原液至稀釋200倍以下防治效果顯著。定殖動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明，無論病原菌存在與否，抗300 μg/mL鏈霉素的突變菌株均能在根際土壤和根內(nèi)定殖，但根際土菌量大于根內(nèi)，且早于根內(nèi)達(dá)到峰值，隨接種時(shí)間延長，定殖量下降并維持穩(wěn)定。田間試驗(yàn)中，突變菌株B3無論預(yù)防還是治療試驗(yàn)，均能發(fā)揮很好的效果，并優(yōu)于原始菌株和化學(xué)農(nóng)藥雙效靈?！窘Y(jié)論】 菌株B3能在花椒根際和根內(nèi)很好地定殖、排擠病原物，具有對花椒根腐病進(jìn)行生物防治的潛力和良好的發(fā)展前景。

[關(guān)鍵詞]花椒；根腐??；腐皮鐮刀菌；芽孢桿菌；生物防治

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)屬蕓香科花椒屬植物，是一種重要的油料、香料、藥材等多用途樹種，在中國栽培的范圍廣、產(chǎn)量高[1]，為目前四川省內(nèi)發(fā)展的主要經(jīng)濟(jì)林種之一。但花椒易受到根腐病[2]、流膠病[3]、銹病[4]和枯穗病[5]等20余種病害的危害，其中由腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani(Mart) Sacc.)[1-2]引起的花椒根腐病導(dǎo)致根系腐爛，地上部分葉片變小、枝條發(fā)育不全，最終導(dǎo)致整株枯死，嚴(yán)重影響花椒產(chǎn)量和品質(zhì)，給花椒產(chǎn)業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今對花椒根腐病病原鑒定及其生物學(xué)特性[1]、發(fā)生特點(diǎn)[2]及防治[6]研究較為廣泛。蔣其軍等[7]選用根腐凈、福美雙等藥劑對該病進(jìn)行田間防治，得到較好防效?；瘜W(xué)防治雖是一種有效的防治手段，但存在病原菌抗藥性、環(huán)境與食品安全、藥害等許多實(shí)際問題，一些化學(xué)殺菌劑在許多發(fā)達(dá)國家和地區(qū)已嚴(yán)格限制使用[8]。而與環(huán)境友好的生物農(nóng)藥越來越受到人們的青睞，是未來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分[9-10]。花椒根腐病是一種土傳根病，侵染循環(huán)尚不明顯，發(fā)病土壤環(huán)境相對穩(wěn)定，最適宜于生物防治。但目前有關(guān)花椒根腐病的生物防治，僅見朱天輝和楊啟智[11]采用腐皮鐮刀菌培養(yǎng)液誘導(dǎo)花椒抗根腐病的初步研究。

芽孢桿菌作為自然界中分布最為廣泛且極易分離培養(yǎng)的一類細(xì)菌，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力[12]。目前，在植物病害生物防治領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，如在辣椒[13]、水稻[14]、小麥[15]、煙草[16]等多種植物上顯示出很好的防效，然而有關(guān)將花椒根際土壤中的芽孢桿菌應(yīng)用于根腐病這一經(jīng)濟(jì)林木重大病害防治的研究尚未見報(bào)道。此外，成功的生物防治必須具備兩個(gè)條件：生防菌能在引進(jìn)位點(diǎn)有效地定殖，并且能在侵染位點(diǎn)表現(xiàn)出與離體測定時(shí)相同的拮抗作用[17]。因此，探索生防菌的定殖動(dòng)態(tài)和消長規(guī)律成為生物防治研究的重要內(nèi)容。本研究以健康花椒根際土中芽孢桿菌為篩選對象，通過初篩、復(fù)篩、盆栽試驗(yàn)獲得目標(biāo)菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行定殖動(dòng)態(tài)和田間生物防治研究，以期為開發(fā)環(huán)保型生防制劑提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

供試花椒樣品為1年生大紅袍花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)苗木，由漢源清溪花椒種植林地提供，用四川于盆栽防效和定殖試驗(yàn)。

于四川漢源清溪花椒種植林地采集健康花椒根際土壤(表層10 cm以下)裝入無菌樣品袋帶回實(shí)驗(yàn)室，用于芽孢桿菌的分離。

供試盆栽試驗(yàn)土壤采自四川省雅安市大興鎮(zhèn)林木育種基地，采樣深度為0～30 cm，紫色土。土壤理化性質(zhì)為：pH 7.1，全磷含量1.8 g/kg，全鉀含量8.4 g/kg，全氮含量1.2 g/kg，速效磷含量25.32 mg/kg，速效鉀含量35.36 mg/kg，堿解氮含量31.56 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量24.3 g/kg。樣土混合均勻后，裝袋(5 kg/袋)，共計(jì)140袋，用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲醛溶液熏蒸滅菌。

供試病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani(Mart) Sacc.)，分離于四川漢源清溪花椒根腐病發(fā)病林地中發(fā)病花椒的根莖組織，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。將該菌于25 ℃培養(yǎng)7～10 d后，收集其分生孢子，用無菌水稀釋成105CFU/mL，用于盆栽防效和定殖試驗(yàn)。

抗生素為純度99.9%鏈霉素(streptomycin，Str)，購自上海生物工程有限公司。殺菌劑為20%雙效靈，購自四川瑞進(jìn)特科技有限公司。

1.2根際土芽孢桿菌的分離與純化

采用稀釋平板涂布法[18]。稱10 g采集的根際土壤樣品于盛有90 mL無菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分混勻后制成土壤懸浮液，100 ℃水浴加熱5 min。冷卻后，無菌條件下取1 mL加入裝有9 mL無菌水的試管中，充分混勻得到10-2的稀釋液，按照此法依次稀釋，分別獲得10-3，10-4，10-5和10-6的稀釋液，分別取各濃度土壤稀釋液0.1 mL，將其涂布在LB培養(yǎng)基上，倒置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，48 h后根據(jù)菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行平板劃線，保存于斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.3生防芽孢桿菌的篩選

初篩：將斜面培養(yǎng)的產(chǎn)孢的腐皮鐮刀菌用無菌水洗出分生孢子，用移液槍取1 mL加入無菌培養(yǎng)皿中，倒入45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基15 mL，充分混合均勻，冷卻后制成含菌平板。采用點(diǎn)菌法[19]，接種分離獲得的芽孢桿菌，倒置在30 ℃培養(yǎng)箱中，24 h后觀察有無抑菌圈產(chǎn)生。

復(fù)篩：將初篩篩選出的抑菌活性較強(qiáng)的芽孢桿菌菌株活化后分別接種于LB肉湯培養(yǎng)液中，30 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后，作為種子液以1∶1體積比加入含有葡萄糖的LB肉湯培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h后取出，取上清液，3 500 r/min離心5 min，再取上清液用打孔法[20]進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，24 h后觀察有無抑菌圈產(chǎn)生。

對篩選出的芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行121 ℃、15 min高溫處理，按照上述方法檢測拮抗活性的有無。

1.4生防芽孢桿菌的鑒定

根據(jù)菌體和菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色等，結(jié)合生理生化試驗(yàn)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]進(jìn)行鑒定。

1.5盆栽防效試驗(yàn)

取105CFU/mL的腐皮鐮刀菌分生孢子懸液50 mL，接種于1年生盆栽花椒苗木根系，7 d后用篩選出的生防菌采用1.3節(jié)中的方法發(fā)酵后，取其發(fā)酵液，分不同濃度(原液及稀釋50倍、100倍、200倍、500倍、1 000倍)，采用灌根法[22]對花椒苗進(jìn)行處理，每盆50 mL，并以無菌水和無菌培養(yǎng)液為對照，每處理10盆，30 d后進(jìn)行病害調(diào)查統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。病害分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，根部健康；Ⅰ級，1/5以下側(cè)根腐爛；Ⅱ級，1/5至1/3側(cè)根腐爛；Ⅲ級，1/3至2/3側(cè)根腐爛；Ⅳ級，2/3以上側(cè)根腐爛甚至整株死亡。

發(fā)病率=(發(fā)病株數(shù)/總接種株數(shù))×100%；

病情指數(shù)=[(各病級株數(shù)×代表級值)/(總株數(shù)×發(fā)病最高級的代表級值)]×100；

防治效果=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100%。

1.6生防芽孢桿菌在花椒根際及根內(nèi)土壤中的定殖動(dòng)態(tài)

1.6.1生防芽孢桿菌抗鏈霉素標(biāo)記及突變菌株的拮抗性和穩(wěn)定性參照譙天敏等[17]的方法，取芽孢桿菌發(fā)酵液100 μL涂布于含20 μg/mL鏈霉素的LB培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，確定天然抗藥性后，挑取單菌落依次在含40，60，120，180，240，300 μg/mL鏈霉素的LB培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，直至篩選出的突變體菌株對鏈霉素耐藥達(dá)300 μg/mL。

原始菌株與突變菌株活化后，與病原菌對峙培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)5 d，觀察培養(yǎng)皿中有無拮抗帶，記錄拮抗帶的寬度并計(jì)算抑制率，每處理重復(fù)3次。抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

參照周林等[23]的方法，將突變菌株在抗性平板上繼代培養(yǎng)，每隔3 d轉(zhuǎn)接1次，轉(zhuǎn)20次后保存LB斜面，30 d后將保存于斜面的菌株分別轉(zhuǎn)接于LB平板(含300 μg/mL鏈霉素)和LB培養(yǎng)液。觀察LB平板上突變菌株的生長情況；LB培養(yǎng)液中的突變菌株培養(yǎng)24 h后，涂布于LB平板，然后用滅菌牙簽隨機(jī)挑取100個(gè)菌落點(diǎn)接種到含300 μg/mL鏈霉素的LB平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，以突變菌株所占百分比計(jì)算其穩(wěn)定性。

1.6.2突變菌株在花椒根際及根內(nèi)土壤中的定殖與消長動(dòng)態(tài)突變菌株采用1.3節(jié)的方法發(fā)酵后，用無菌水調(diào)節(jié)菌液的OD值，制成108CFU/mL菌劑(平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)帶菌量)。分別用105CFU/mL腐皮鐮刀菌分生孢子懸液和無菌水各50 mL接種1年生盆栽花椒苗木根系，7 d后灌根法接種突變菌株菌劑100 mL，每處理30盆。于接種后的第1，5，10，20，40，80 天對根系組織和根際土進(jìn)行取樣，用含300 μg/mL鏈霉素的LB培養(yǎng)基檢測突變體菌株數(shù)量(每克根系組織或根際土的含菌量對數(shù)值)。

1.7生防芽孢桿菌對花椒根腐病的田間防治效果

田間防治試驗(yàn)在四川漢源清溪花椒種植林地進(jìn)行。

預(yù)防處理方法為：選擇1年生尚未發(fā)病花椒林地內(nèi)的花椒苗木，用1.3節(jié)制作的原始菌株和1.6.1中篩選的突變菌株菌劑原液及二者的10倍、100倍、500倍、1 000倍稀釋液灌根，每株100 mL，每處理30株，每年春季施用1次， 2011-2013年連續(xù)3年施用，以雙效靈1 000倍液、無菌水和無菌培養(yǎng)液為對照。

治療處理方法為：選擇3年生發(fā)病花椒林地內(nèi)的花椒植株，用1.3節(jié)制作的原始菌株及1.6.1中篩選的突變菌株菌劑原液和10倍、100倍、500倍、1 000倍稀釋液灌根，每株100 mL，每處理30株，春、夏各1次， 2011-2013年連續(xù)3年施用，以雙效靈1 000倍液、無菌水和無菌培養(yǎng)液為對照。

以上處理全部完成后80 d進(jìn)行病害調(diào)查，分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級，整株健康；1級，葉片變小、枝條發(fā)育不全；2級，整株死亡。按1.5節(jié)的方法計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

1.8數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 13.0軟件分析處理，采用LSD法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2結(jié)果與分析

2.1生防芽孢桿菌的初篩與復(fù)篩

根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、光學(xué)特性以及是否產(chǎn)生色素等特征進(jìn)行合并后，從花椒根際土壤中共分離獲得20株生防芽孢桿菌(表1)。采用點(diǎn)菌法進(jìn)行拮抗測定發(fā)現(xiàn)，20株芽孢桿菌均有一定的抑菌作用，其中B2、B3和B20 3株芽孢桿菌對花椒根腐病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，抑菌圈直徑均達(dá)到10.0 mm以上。B3菌株拮抗作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑均達(dá)到20.0 mm以上，其次是B2和B20，抑菌圈直徑均達(dá)到13.0 mm以上，顯著高于其他菌株。B11抑菌圈直徑最小，僅為4.0 mm。

采用打孔法進(jìn)一步復(fù)篩，結(jié)果表明B2、B20基本不產(chǎn)生抑菌圈，而B3菌株抑菌圈直徑達(dá)到26.0 mm，說明B3對腐皮鐮孢病菌具有較好的抑制作用。B3發(fā)酵濾液經(jīng)過121 ℃高溫處理15 min后仍具有拮抗活性(抑菌圈直徑為9.0 mm)，說明B3菌株具有耐熱性。

表 1　生防芽孢桿菌菌株篩選結(jié)果

注：表中數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著(LSD 法)。表3～5同。

Note:Data in the table are “mean±SD”.Different lowercase letters in the same column indicate significant differences atP<0.05 level by LSD test.The same for Table 3-5.

2.2目標(biāo)芽孢桿菌的鑒定

B3菌株經(jīng)LB瓊脂平板培養(yǎng)24 h后，菌落扁平，顏色為乳白色，不透明，表面略粗糙，呈白蠟狀，質(zhì)地軟，略有光澤，無色素，外形不規(guī)則近圓形，中部突起，邊緣不整齊。顯微鏡下革蘭氏染色呈陽性，菌體呈桿狀，末端鈍，為短或長鏈，芽孢橢圓中生或近中。B3芽孢桿菌的生理生化特征見表2。表2結(jié)果表明，接觸酶、硝酸鹽還原、V-P反應(yīng)、明膠液化、過氧化氫酶試驗(yàn)為陽性，苯丙氨酸脫氫酶、甲基紅、馬尿酸鹽水解試驗(yàn)為陰性，可利用檸檬酸鹽、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，不能利用木糖、甘露醇、阿拉伯糖、乳糖，厭氧、不能形成吲哚，5 ℃生長、50 ℃不生長。根據(jù)B3菌株菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色和生理生化特征測定結(jié)果，初步確定B3菌株為蠟樣芽孢桿菌(BacilluscereusFrankland)。

表 2　B3菌株的生理生化特征

注：“+”陽性；“-”陰性。

Note:“+” means positive;“-” means negative.

2.3目標(biāo)芽孢桿菌的盆栽生防效果

由表3可以看出，接種B3發(fā)酵液30 d后，對花椒根腐病具有不同的防治效果，發(fā)病率和病情指數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而增大，防治效果隨稀釋倍數(shù)的增加而降低。其中，無菌水和無菌培養(yǎng)液的對照花椒苗發(fā)病率高達(dá)94%以上，B3發(fā)酵原液至稀釋200倍以下效果顯著，特別是稀釋50倍以下，可基本上控制病害不發(fā)生，而稀釋500倍以上防治效果低于50%。

表 3　B3菌株對花椒根腐病的盆栽防治效果

2.4抗鏈霉素突變菌株的拮抗性和穩(wěn)定性

逐步增加鏈霉素質(zhì)量濃度獲得抗300 μg/mL的突變菌株B3，將原始菌株和突變菌株分別與腐皮鐮刀菌對峙培養(yǎng)5 d后，測量拮抗帶的寬度和病原菌直徑，結(jié)果顯示，突變菌株拮抗帶寬度為1.57 cm，抑制率為77.20%；原始菌株拮抗帶寬度為1.59 cm，抑制率為77.87%，二者無顯著差異，說明突變菌株對病原菌仍有較強(qiáng)的抑制作用。

測定結(jié)果顯示，繼代培養(yǎng)后突變菌株在含300 μg/mL的LB平板上生長后形態(tài)和生長速度與原始菌株相似。選取100個(gè)菌落點(diǎn)接種后，突變菌株丟失率為0，說明所獲得的突變菌株B3具有很好的抗藥穩(wěn)定性。

2.5突變菌株在花椒根際及根內(nèi)的定殖和消長動(dòng)態(tài)

花椒根際和根內(nèi)分離的突變菌株數(shù)量結(jié)果(圖1)表明，根際和根內(nèi)的定殖量和消長規(guī)律有顯著差異，無論在有或沒有腐皮鐮刀菌存在的情況下，突變菌株B3均能在根際和花椒根內(nèi)定殖。對比根際和根內(nèi)的定殖量可知，根際土中菌量比根內(nèi)更早達(dá)到峰值，下降維持穩(wěn)定的菌量要遠(yuǎn)大于根內(nèi)部，說明突變菌株B3更易于在花椒根際土中定殖生長。同時(shí)，1～80 d內(nèi)無菌水處理的花椒根際和根內(nèi)菌量都要顯著高于病原菌處理。

圖1A顯示，在接種后1～80 d內(nèi)病原菌處理與無菌水對照在根際的定殖動(dòng)態(tài)變化規(guī)律相似，1～5 d內(nèi)下降，5～10 d上升，10 d時(shí)達(dá)到最大值，之后下降，40～80 d內(nèi)維持穩(wěn)定狀態(tài)。其中，10 d時(shí)無菌水處理的菌量為6.70×106CFU/g，顯著高于病原菌處理的菌量(3.32×106CFU/g)，二者到80 d時(shí)仍有9.75×103CFU/g和4.57×103CFU/g的菌量。

圖1B顯示，接種后1～20 d內(nèi)無菌水和病原菌處理花椒根內(nèi)的菌量呈緩慢上升趨勢，20 d時(shí)均達(dá)到最大值，分別為4.47×105CFU/g和1.35×105CFU/g，之后下降，40～80 d保持穩(wěn)定，且差異不顯著，80 d時(shí)根內(nèi)仍然能檢測到突變菌株B3，菌量分別為1.61×103CFU/g和0.80×103CFU/g。

圖 1　突變菌株B3在花椒根際(A)和根內(nèi)(B)的定殖動(dòng)態(tài)

2.6生防芽孢桿菌B3的田間防治效果

原始菌株和突變菌株B3對花椒根腐病的田間預(yù)防效果見表4。

表 4　原始菌株和突變菌株B3對花椒根腐病的田間預(yù)防效果

由表4可以看出，B3原始菌株和突變菌株菌劑原液、50～1 000倍稀釋液沿根系幅面灌根，對花椒根腐病都有一定的預(yù)防效果，隨稀釋倍數(shù)的增大發(fā)病率和病情指數(shù)升高，而預(yù)防效果變差。無菌水和無菌培養(yǎng)液對根腐病無預(yù)防作用，發(fā)病率均超過30%。突變菌株原液稀釋500倍以下的預(yù)防效果顯著優(yōu)于雙效靈1 000倍液，而突變菌株1 000倍液與雙效靈1 000倍液相當(dāng)。相比而言，原始菌株菌劑稀釋200倍以下的預(yù)防效果與突變菌株相同，但500倍和1 000倍稀釋液發(fā)病率顯著高于突變菌株，相應(yīng)預(yù)防效果也較差；1 000倍稀釋液的預(yù)防效果僅為52.34%，而突變菌株菌劑均超過80%。

由表5可以看出，B3原始菌株和突變菌株菌劑原液、50～1 000倍稀釋液沿根系幅面灌根，對花椒根腐病都有一定的治療作用，隨稀釋倍數(shù)的增大發(fā)病率和病情指數(shù)升高，而治療效果變差。突變菌株菌劑稀釋200倍以下的治療效果顯著優(yōu)于雙效靈1 000倍液，500倍稀釋液與雙效靈1 000倍液差異不顯著，但均超過50%。而原始菌株菌劑稀釋200倍以下治療效果才高于50%，500倍和1 000倍稀釋液的療效顯著低于突變菌株和雙效靈1 000倍液。以上結(jié)果說明，在自然條件下，菌株B3對花椒根腐病既能治療又能預(yù)防；無論在未發(fā)病還是已發(fā)病的花椒林地，突變菌株的防治效果均比原始菌株更好，更能適應(yīng)環(huán)境并定殖及繁殖。

表 5　原始菌株和突變菌株B3對花椒根腐病的田間治療效果

3討論

眾多研究表明，細(xì)菌有著其他微生物所不具備的優(yōu)點(diǎn)，如種類和數(shù)量龐大，繁殖快速，作用方式多樣等，因此在植物病害生物防治中有著非常重要的地位。目前，已發(fā)現(xiàn)有18個(gè)屬的細(xì)菌在植物病害生物防治上具有應(yīng)用潛力[24]，特別是芽孢桿菌屬(Bucillus)的細(xì)菌，由于其抗逆性強(qiáng)、商貯性好，更是受到生防工作者的重視。其中，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是土壤中的優(yōu)勢菌，不僅能防治植物病害，而且還能促進(jìn)植物生長，屬于目前研究比較多的植物根際促生菌[25]。本研究所分離的蠟樣芽孢桿菌對花椒根腐病菌拮抗作用強(qiáng)，能抗高溫，易繁殖，是一種極具開發(fā)價(jià)值的生防菌。但劉國紅等[26]指出，芽孢桿菌屬細(xì)菌的表型特征范圍較廣泛，較難準(zhǔn)確對其進(jìn)行屬種確定，因而結(jié)合張艷東等[27]的報(bào)道，還應(yīng)對所得B3菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定進(jìn)而印證本研究的菌株分類鑒定結(jié)果。

植物根標(biāo)存在大量的有益微生物，現(xiàn)已從多種植物根際分離到對病害具有良好抑制效果的微生物[28-29]。但是，生防菌在植物根際或根部有效定殖是防治根部病害成功與否的關(guān)鍵[17]。將DNA和RNA探針[30]、基因標(biāo)記[31]、熒光顯微鏡[32]等方法應(yīng)用于生防微生物在植物根部定殖均已見報(bào)道；利用抗生素標(biāo)記具有經(jīng)濟(jì)、簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)。周林等[23]以鏈霉素標(biāo)記枯草芽孢桿菌，檢測其在香蕉體內(nèi)及根際的定殖動(dòng)態(tài)，獲得理想效果。本試驗(yàn)使用鏈霉素標(biāo)記也成功獲得蠟樣芽孢桿菌B3抗300 μg/mL鏈霉素的突變菌株，經(jīng)與原始菌株比較拮抗活性、穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，其性狀穩(wěn)定，拮抗活性較優(yōu)。在定殖和消長動(dòng)態(tài)測定中，B3突變菌株在根際土中定殖量大于根內(nèi)，且達(dá)到峰值的時(shí)間早于根內(nèi)。這與劉慶豐等[33]關(guān)于枯草芽孢桿菌在大白菜根圍的定殖結(jié)果相似，生防菌從根際土拓展到根系內(nèi)部是一個(gè)漸進(jìn)的過程，在此過程中可能受到諸多因素影響，如植物與土壤的相互作用、土壤溫度、濕度、植物氣孔開放程度等。此外，本研究結(jié)果僅是利用灌根法接種B3突變菌株，結(jié)合孫建波等[22]、周林等[23]的報(bào)道，說明該菌株可主動(dòng)穿過根皮層進(jìn)入花椒體內(nèi)，顯示出較強(qiáng)的定殖能力。再者，無論環(huán)境中有無病原菌存在，該突變菌株均能很好地定殖于花椒的根系和根際土中，有利于其在根部占據(jù)有利生態(tài)位點(diǎn)，這為抑制花椒根腐病菌奠定了良好的基礎(chǔ)。因此，將定殖能力與拮抗活性相結(jié)合，可作為優(yōu)良高效持久的生防菌篩選的重要指標(biāo)。

蠟樣芽孢桿菌應(yīng)用于植物病害生物防治時(shí)都要經(jīng)過發(fā)酵使細(xì)胞富集，進(jìn)而可以直接制成活菌制劑，但是在實(shí)際應(yīng)用過程中，菌株效能不穩(wěn)定是制約其開發(fā)的重要條件之一。本研究利用突變菌株進(jìn)行田間防治試驗(yàn)，取得了優(yōu)于原始菌株及化學(xué)農(nóng)藥(雙效靈)的預(yù)防和治療效果，結(jié)合定殖結(jié)果來看，突變菌株B3可能更適應(yīng)自然環(huán)境，能更好地定殖、排擠病原物，其防效更持久、穩(wěn)定，具有良好的應(yīng)用前景，可成為防治花椒根腐病的一種新途徑。

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Screening,identification,colonization and control effect of biocontrolBacillussp.against root rot ofZanthoxylumbungeanumMaxim.

LI Shu-jiang,ZHU Tian-hui,QIAO Tian-min,HAN Shan

(CollegeofForestry,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

Abstract:【Objective】 Biocontrol Bacillus sp.was isolated and screened and its colonization and control effect were evaluated to provide theoretical and practical basis for developing efficient,stable and abiding biopesticides.【Method】 Bacillus sp.was isolated from rhizosphere soil of healthy prickly ash Zanthoxylum bungeanum Maxim.Bacillus sp.with optimal antagonistic effect was screened twice by point bacteria and stiletto methods,and identified by morphological characteristics and physiological-biochemical tests.The control effect on one-year-old Chinese prickly ash root rot was also dertermined.The antagonistic Bacillus sp.was marked by streptomycin and the colonization dynamic was analyzed in the root interior and rhizophere of Chinese prickly ash.Then,Chinese prickly ash root rots were treated by preventing and controling treatments,and the incidence,disease index,and control effect were calculated.【Result】 Among the 20 Bacillus sp.strains obtained,the antagonistic effect of strain B3 was the strongest with the inhibition zone diameter of 26.0 mm.It kept activity after high-temperature treatment,and was preliminarily identified as Bacillus cereus.Pot experiment showed that the incidence and disease index increased along with the dilution time,and the control effects of strain B3 fermentation liquid diluted by less than 200 times were remarkable.The colonization dynamic results showed that the mutational strain against streptomycin of 300 μg/mL could colonize in the root interior and rhizophere no matter the pathogen existing or not.But the quantity in the rhizophere was more and the peak value appeared earlier than root interior.The colonization quantity declined and maintained stably along with the increase of inoculation time.In field experiment,the mutational strain B3 had good effects and was better than the original strain and mixed amino acid copper complex (CCMA) in both prevent testing and control testing.【Conclusion】 Strain B3 can commendably colonize in the root interior and rhizophere of Chinese prickly ash and supplant the pathogen.Thus,it has biocontrol potential against Chinese prickly ash root rot and favourable developed prospect.

Key words:Zanthoxylum bungeanum Maxim.;root rot;Fusarium solani (Mart) Sacc.;Bacillus sp.;biocontrol

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.016

[收稿日期]2014-09-10

[基金項(xiàng)目]國家自然科技資源共享平臺(tái)項(xiàng)目(2005DKA21207-13)

[作者簡介]李姝江(1983-)，女，四川宜賓人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事林木病害生物防治研究。

[通信作者]朱天輝(1963-)，男，重慶開縣人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事林木病害及其防治研究。

[中圖分類號]S435.73

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)04-0114-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.032.html

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