ISCOM型白血病瘤苗聯(lián)合1-甲基色氨酸免疫治療荷瘤小鼠療效觀察*

黃　琰，吳　隼，字友梅，張　媛，楊　滿，馬　棟，賀立山

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，河南新鄉(xiāng) 453100)

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論著·基礎(chǔ)研究

ISCOM型白血病瘤苗聯(lián)合1-甲基色氨酸免疫治療荷瘤小鼠療效觀察*

黃琰，吳隼，字友梅，張媛，楊滿，馬棟，賀立山

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，河南新鄉(xiāng) 453100)

[摘要]目的探討免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)型白血病腫瘤疫苗(簡稱瘤苗)聯(lián)合1-甲基色氨酸對荷瘤小鼠的治療作用。方法皂苷溶液中加入脂肪酶蛋白(1 mg/mL)7 ℃反應(yīng)12 h，加入80 μL脂類混合物溶液和5 mL皂苷溶液(1 mg/mL)制備ISCOM型白血病瘤苗。C57BL/6小鼠分為模型組、ISCOM型白血病瘤苗組、1-甲基色氨酸組和聯(lián)用組(ISCOM型白血病瘤苗+1-甲基色氨酸)，小鼠注射FBL-3細(xì)胞建立白血病荷瘤小鼠模型，模型組給予等量生理鹽水，其余各組接受對應(yīng)藥物治療4周后，記錄體質(zhì)量，NK細(xì)胞、Mφ細(xì)胞和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)細(xì)胞殺傷活性、血清IL-10和IL-12表達(dá)水平。結(jié)果聯(lián)用組瘤質(zhì)量低于1-甲基色氨酸組和ISCOM型白血病瘤苗組[(0.64±0.26)g vs.(2.49±0.91)g，P<0.01；(0.64±0.26)g vs.(1.28±0.73)g，P<0.05)]；聯(lián)用組Mφ細(xì)胞殺傷活性顯著高于1-甲基色氨酸組[(55.69±13.69)% vs.(69.47±14.79)%，P<0.01)]；聯(lián)用組NK細(xì)胞殺傷活性顯著高于1-甲基色氨酸組[(38.41±8.27)% vs.(67.22±12.74)%，P<0.01]；聯(lián)用組CTL細(xì)胞殺傷活性高于1-甲基色氨酸組和ISCOM型白血病瘤苗組[(43.77±8.89)% vs.(69.68±11.44)%，P<0.01；(58.87±9.45)% vs.(69.68±11.44)%，P<0.05)]；聯(lián)用組IL-10均顯著低于1-甲基色氨酸組、ISCOM型白血病瘤苗組[(76.2±6.82)pg/L vs.(98.3±13.4)pg/L，P<0.01；(76.2±6.82)pg/L vs.(202.3±44.5)pg/L，P<0.01)]；聯(lián)用組IL-12高于1-甲基色氨酸組、ISCOM型白血病瘤苗組[(381.2±47.3)pg/L vs.(332.1±30.2)pg/L，P<0.05；(381.2±47.3)pg/L vs.(291.2±17.3)pg/L，P<0.01)。結(jié)論ISCOM白血病瘤苗聯(lián)合1-甲基色氨酸具有較佳的抗瘤活性，其機(jī)制可能是通過介導(dǎo)IL-10和IL-12的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]ISCOM型瘤苗；1-甲基色氨酸；前體細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤；聯(lián)用

免疫治療是腫瘤治療研究的方向，免疫療法治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤倍受人們的關(guān)注，國內(nèi)外在主動免疫治療白血病方面研究甚熱。腫瘤疫苗(簡稱瘤苗)在現(xiàn)代腫瘤治療中作為腫瘤術(shù)后、化學(xué)治療、放射治療的一種輔助治療手段越來越受到關(guān)注[1-2]。1-甲基色氨酸能夠抑制免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中的2，3雙加氧酶活性，促進(jìn)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的活化、增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。免疫刺激復(fù)合物(immunostimulating complexes，ISCOM)是一種全新的抗原提呈系統(tǒng)，是荷載肽或蛋白質(zhì)抗原的脂類載體復(fù)合物，具有佐劑和抗原提呈的雙重功能。本研究在前期研究中發(fā)現(xiàn)ISCOM型白血病瘤苗可以改善荷瘤小鼠的免疫功能，發(fā)揮抗癌作用。本文擬通過聯(lián)合使用1-甲基色氨酸探討其與ISCOM型白血病瘤苗是否有協(xié)同抗癌作用。

1材料與方法

1.1動物與細(xì)胞C57BL/6小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量18.0～22.0 g，雌雄各半，購自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。FBL-3細(xì)胞株購自中山大學(xué)實驗動物中心。

1.2試劑小鼠IL-10 ELISA試劑盒(華美生物工程公司)；小鼠IL-12 ELISA試劑盒(華美生物工程公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO,美國)；脂肪酶蛋白(SIGMA,美國)；卵磷脂(SIGMA,美國)；膽固醇(SIGMA,美國)；絲裂霉素C(SIGMA,美國)；胎牛血清(GIBCO,美國)；MTT(SIGMA,美國)；皂苷(SIGMA,美國)；Mega-10(Amresco,美國)。ISCOM型白血病瘤菌的制備[4]：皂苷溶液中加入脂肪酶蛋白(1 mg/mL)使其濃度為0.02 mg/mL，7 ℃反應(yīng)12 h，隨后加入80 μL脂類混合物溶液和5 mL皂苷溶液(1 mg/mL)，室溫下反應(yīng)4 h。冰浴超聲處理，透析，濃縮，4 ℃保存?zhèn)溆?。脂類混合物溶液的配制：將卵磷脂和膽固醇溶解?0%的Mega-10溶液中，調(diào)整濃度為10 mg/mL；皂苷溶液的配制：皂苷溶解于PBS溶液中，調(diào)整濃度為1 mg/mL。FBL-3細(xì)胞內(nèi)加入絲裂霉素C(100 μg/mL)，于37 ℃水浴中放置30 min，滅活[5]。

1.3方法[6]所有小鼠均建立荷瘤小鼠模型，F(xiàn)BL-3培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，取0.2 mL 1×106/mL細(xì)胞注射于鼠左肋皮下于3～7 d可觸及腫瘤后。取造模成功的小鼠40只分為模型組、ISCOM型白血病瘤苗組、1-甲基色氨酸組和聯(lián)用組，每組10只。 給藥：模型組給予等量生理鹽水，ISCOM型白血病瘤苗組治療時在腫瘤部位注射瘤苗0.2 mL，1周1次；1-甲基色氨酸組于飲用水中加入5 mg/mL 1-甲基色氨酸，自由飲水；聯(lián)用組在腫瘤部位注射瘤苗0.2 mL，同時飲用1-甲基色氨酸。治療維持4周。

1.4療效觀察及檢測指標(biāo)治療4周后，處死小鼠，分離瘤體，稱取質(zhì)量。參考文獻(xiàn)方法分離獲得NK細(xì)胞、Mφ細(xì)胞和CTL細(xì)胞，采用MTT考察測量各組治療后細(xì)胞殺傷活性。Mφ(NK/CTL)的殺傷活性=[1-與Mφ(NK/CTL)作用的L1210OD值/對照L1210OD值]×100%。分離小鼠腹主動脈血，靜置離心分離獲得血清，采用ELISA試劑盒測定IL-10和IL-12水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率比較治療結(jié)束后，模型組瘤質(zhì)量(4.08±2.09)g；1-甲基色氨酸組瘤質(zhì)量(2.49±0.91)g，抑瘤率為38.9%；ISCOM型白血病瘤苗組瘤質(zhì)量(1.28±0.73)g，抑瘤率為68.6%；聯(lián)用組瘤質(zhì)量(0.64±0.26)g，抑瘤率為84.3%。1-甲基色氨酸組瘤質(zhì)量低于模型組(P<0.05)，ISCOM型白血病瘤苗組和聯(lián)用組顯著低于模型組(均P<0.01)；聯(lián)用組瘤質(zhì)量低于1-甲基色氨酸組和ISCOM型白血病瘤苗組(P<0.01，P<0.05)。見圖1、表1。

A：模型組；B：1-甲基色氨酸組；C：ISCOM型白血病瘤苗組；D：聯(lián)用組。

圖1　　各組腫瘤大小

a:P<0.05，b：P<0.01,與模型組比較;c:P<0.05，d：P<0.01,與聯(lián)用組比較。-:此項無數(shù)據(jù)。

2.2各組Mφ、CTL和NK細(xì)胞殺傷活性比較1-甲基色氨酸組、ISCOM型白血病瘤苗組和聯(lián)用組Mφ細(xì)胞殺傷活性均顯著高于模型組(均P<0.01)，聯(lián)用組Mφ細(xì)胞殺傷活性顯著高于1-甲基色氨酸組(P<0.01)；ISCOM型白血病瘤苗組和聯(lián)用組NK細(xì)胞殺傷活性顯著高于模型組(均P<0.01)，聯(lián)用組NK細(xì)胞殺傷活性顯著高于1-甲基色氨酸組(P<0.01)；1-甲基色氨酸組、ISCOM型白血病瘤苗組和聯(lián)用組CTL細(xì)胞殺傷活性均顯著高于模型組(均P<0.01)，聯(lián)用組CTL細(xì)胞殺傷活性高于1-甲基色氨酸組和ISCOM型白血病瘤苗組(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2　　各組Mφ、CTL和NK細(xì)胞殺傷活性比較

b:P<0.01,與模型組比較;c:P<0.05，d:P<0.01,與聯(lián)用組比較。

2.3各組IL-10和IL-12比較1-甲基色氨酸組、ISCOM型白血病瘤苗組和聯(lián)用組IL-10均顯著低于模型組(均P<0.01)，聯(lián)用組IL-10均顯著低于1-甲基色氨酸組、ISCOM型白血病瘤苗組(均P<0.01)；1-甲基色氨酸組、ISCOM型白血病瘤苗組和聯(lián)用組IL-12均高于模型組(P<0.05，P<0.01)，聯(lián)用組IL-12高于1-甲基色氨酸組、ISCOM型白血病瘤苗組(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3　　各組IL-10和IL-12比較

a:P<0.05，b:P<0.01，與模型組比較;c:P<0.05，d:P<0.01,與聯(lián)用組比較。

3討論

白血病目前的治療仍然以化學(xué)治療為主，但化學(xué)治療產(chǎn)生的不良反應(yīng)及耐藥性限制了其的使用，造血干細(xì)胞移植可以治愈白血病，但受制于供體少、手術(shù)死亡率高和費用高等因素[7]。白血病的主動免疫治療日益受到重視，主動免疫的機(jī)理是特異性腫瘤抗原通過抗原呈遞細(xì)胞激活T淋巴細(xì)胞成為CTL，CTL識別腫瘤細(xì)胞后釋放多種殺傷因子[8]。

本研究前期研究中發(fā)現(xiàn)ISCOM型白血病瘤苗能夠分別通過增強(qiáng)荷瘤小鼠的Mφ細(xì)胞活性和CTL細(xì)胞活性達(dá)到改善荷瘤小鼠非特異性免疫和細(xì)胞免疫功能的作用，且該瘤苗制備簡單、使用方便。1-甲基色氨酸是吲哚2，3雙加氧酶的競爭性抑制劑，通過封閉黑色素瘤細(xì)胞系中吲哚2，3雙加氧酶的表達(dá)，能顯著增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫功能[9-10]。采用吲哚2，3雙加氧酶的競爭性抑制劑1-甲基色氨酸和傳統(tǒng)化學(xué)治療、放射治療結(jié)合可以取得更佳的治療效果，而通過1-甲基色氨酸可以增強(qiáng)LLC/DC融合疫苗的抗腫瘤效果，誘導(dǎo)強(qiáng)CTL反應(yīng)[11]。為此本研究中考察了ISCOM型白血病瘤苗聯(lián)合1-甲基色氨酸在荷瘤小鼠中的治療效果。研究結(jié)果顯示，聯(lián)用組抑瘤率為84.3%，瘤質(zhì)量顯著低于甲基色氨酸組和ISCOM型白血病瘤苗組(P<0.05)。Mφ細(xì)胞、CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞殺傷活性中，聯(lián)用組顯著優(yōu)于1-甲基色氨酸組，但與ISCOM型白血病瘤苗組效果相當(dāng)，僅CTL優(yōu)于ISCOM型白血病瘤苗組，該結(jié)果與其他研究類似，可能與1-甲基色氨酸對于CTL具有較強(qiáng)作用有關(guān)[12]。

IL-10是一種由Th2細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和角化細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，IL-10 具有免疫抑制作用，可以抑制抗原提呈細(xì)胞、CTL 細(xì)胞及 NK 細(xì)胞的活力[13-14]。而IL-12是一種抗原提呈細(xì)胞和 B 細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是最有效的CTL 和 NK 細(xì)胞活性激活因子[15]。本研究顯示聯(lián)用組能顯著抑制IL-10的表達(dá)，促進(jìn)IL-12的產(chǎn)生，這可能是聯(lián)用1-甲基色氨酸和ISCOM型白血病瘤苗發(fā)揮抗瘤的作用機(jī)制。

綜上所述，聯(lián)用1-甲基色氨酸和ISCOM型白血病瘤苗具有更佳的抗瘤活性，主要增加了CTL細(xì)胞殺傷活性，而對IL-10和IL-12表達(dá)的調(diào)節(jié)可能為其作用機(jī)理。

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The treatment effect of ISCOM leukemia vaccine combination with 1-methyl tryptophan on tumor burden mice*

HuangYan,WuSun,ZiYoumei,ZhangYuan,YangMan,MaDong,HeLishan

(DepartmentofHematology,theFirstHospitalAffiliatedtoXinxiangMedicineCollege,Xinxiang,Henan453100,China)

[Abstract]ObjectiveInvestigated the treatment effect of ISCOM leukemia vaccine combination with 1-methyl tryptophan on tumor burden mice.MethodsSaponin was added lipase protein (1 mg/mL) 7 ℃ for 12 h,adding 80 μL lipid mixed solution and 5 mL saponin solution (1 mg/mL) to prepare ISCOM leukemia vaccine.C57BL/6 mice were randomly divided into model group,ISCOM leukemia vaccine group,1-methyl tryptophan group and combination group,Mice were injected FBL-3 cell to built leukemia tumor-burdened mice model.After treatment for 4 weeks,tumors weight,NK and Mφ and CTL cell killing activity,serum levels of IL-10,IL-12 were detected.ResultsTumor weight in combination group was less than 1-methyl tryptophan and ISCOM leukemia group [(0.64±0.26)g vs.(2.49±0.91)g,P<0.01,(0.64±0.26)g vs.(1.28±0.73)g,P<0.05];NK cell killing activity in combination group was higher than 1-methyl tryptophan group[(38.41±8.27)% vs.(67.22±12.74)%,all P<0.01)];Mφ activity in combination group was significantly higher than 1-methyl tryptophan group[(55.69±13.69)% vs.(69.47±14.79)%,P<0.01];CTL activity in combination group was significantly higher than 1-methyl tryptophan group and ISCOM leukemia group[(43.77±8.89)% vs.(69.68±11.44)%,P<0.01,(58.87±9.45)% vs.(69.68±11.44)%,P<0.05];IL-10 in combination group were significantly lower than 1-methyl tryptophan group and ISCOM leukemia group [(76.2±6.82)pg/L vs.(98.3±13.4)pg/L,P<0.01,(76.2±6.82)pg/L vs.(202.3±44.5)pg/L,P<0.01];IL-12 in combination group were significantly higher than 1-methyl tryptophan group and ISCOM leukemia group[(381.2±47.3)pg/L vs.(332.1±30.2)pg/L,P<0.05,(381.2±47.3)pg/L vs.(291.2±17.3)pg/L,P<0.01].ConclusionCombination with 1-methyl tryptophan and ISCOM leukemia vaccine has a well antitumor effect,its mechanism may be through mediated and the expression of IL-12 and IL-10.

[Key words]ISCOM leukemia vaccine;1-methyl tryptophan;precursor cell lymphoblastic leukemia/lymphoma;combination

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.013

基金項目：河南省教育廳基金資助項目(2006320039)。

作者簡介：黃琰(1976-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事白血病的免疫治療。

[中圖分類號]R733

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)01-0037-03

(收稿日期：2015-06-16修回日期：2015-09-21)