基于拉曼光譜分析寒地水稻葉片的有機(jī)結(jié)構(gòu)

譚峰+才巧玲+馬志欣+孫雪成+侯召龍

摘要：為了從分子水平探討水稻病菌的傳播和發(fā)病機(jī)制，特別是與分子病理學(xué)和分子藥物學(xué)有關(guān)的研究項(xiàng)目的開展，需要研究細(xì)胞內(nèi)生物大分子的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。利用拉曼光譜儀對正常水稻葉片進(jìn)行拉曼光譜采集，指認(rèn)出水稻葉片細(xì)胞中重要組成成分的拉曼特征頻率，如羰基、亞甲基、巰基、氨基等多種官能團(tuán)，并對拉曼光譜曲線中出現(xiàn)的特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行理論分析和解釋。然后針對細(xì)胞組成的兩大成分，即蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)像進(jìn)行相應(yīng)的拉曼光譜分析。通過分析水稻葉片中各部分的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象給出全面的分析和解釋，實(shí)現(xiàn)了水稻葉片半定量分析的目的。為今后寒地水稻病害早期檢測的對比分析提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：拉曼光譜；蛋白質(zhì)；遺傳物質(zhì)；官能團(tuán)；二級結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S511.01

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0358-03

寒地水稻是指東北地區(qū)所產(chǎn)的單季晚稻品種。水稻病害是影響寒地水稻產(chǎn)量的重要因素之一，每年均有病害發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)可以減產(chǎn)40%～50%[1-2]。研究水稻病害內(nèi)部發(fā)病機(jī)制以及對水稻葉片結(jié)構(gòu)破壞的機(jī)制具有重要意義。對水稻葉片檢測通常采用透射電鏡、多光譜成像技術(shù)、高光譜成像技術(shù)等方法，這些方法已經(jīng)能夠較準(zhǔn)確地識別水稻病害情況，但仍存在識別方法普適性差、無損檢測方法缺失的問題[3]。拉曼光譜是一門基于拉曼散射效應(yīng)而發(fā)展起來的光譜分析技術(shù)，體現(xiàn)的是分子的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)信息，與常規(guī)化學(xué)分析方法相比，拉曼光譜技術(shù)具有無損、快速、環(huán)保、靈敏度高、穩(wěn)定性好且無需制樣等特點(diǎn)[4-5]。崔向榮等利用拉曼光譜技術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在電磁場照射后蛋白質(zhì)、脂類、核酸等結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化的可行性，得出3 000 Hz 脈沖電磁場對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生了分子層面的影響[6]。Waleed等利用拉曼光譜技術(shù)檢測PC12細(xì)胞裂解液在細(xì)胞內(nèi)DA水平的生化成分的變化[7]，同時(shí)確定拉曼光譜在檢測細(xì)胞外DA水平處理劑的變化與運(yùn)用高效液相色譜法結(jié)果一致。董蓉等應(yīng)用單細(xì)胞拉曼分析技術(shù)結(jié)合PCA方法，以枯草芽孢桿菌芽孢為對象，探究芽孢在強(qiáng)堿脅迫下的致死機(jī)制[8]。由此可見，利用拉曼光譜技術(shù)在生物、農(nóng)業(yè)等方面的應(yīng)用越來越廣泛，已經(jīng)成為一種有效的檢測手段。但目前利用拉曼光譜對水稻植株檢測的研究較少。因此，本研究利用拉曼光譜和水稻葉片細(xì)胞組織的知識理論進(jìn)行研究，以期為水稻病害早期檢測的對比分析提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

水稻葉片樣本2011—2014年采集于黑龍江省農(nóng)墾總局建三江分局下屬勝利農(nóng)場科技示范園區(qū)的26.67 hm2試驗(yàn)田，品種為墾稻19號。水稻是蒸騰作用非常強(qiáng)的農(nóng)作物，正常天氣采集下來的水稻葉片10 min之內(nèi)便會因?yàn)槿~片水分降低出現(xiàn)明顯的卷葉現(xiàn)象，所以采集樣本必須現(xiàn)場采摘葉片，并直接在附近的室內(nèi)進(jìn)行拉曼光譜采集。

1.2 試驗(yàn)方法

選用由DeltaNu公司生產(chǎn)的Advantage 532型拉曼光譜儀，采用背向接收的方式采集拉曼光譜信號，在波段200～3 400 cm-1 范圍內(nèi)對現(xiàn)場樣本進(jìn)行拉曼光譜采集。采集到的原始數(shù)據(jù)，一是利用編寫的Matlab程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到樣本光譜的峰值，并顯示處理以后的光譜圖像；二是通過結(jié)合Berjot方法針對二級碳、三級碳、四級碳以及譜線展寬與水稻葉片內(nèi)結(jié)構(gòu)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，對照拉曼光譜特征頻率表，得到寒地水稻葉片中大部分關(guān)鍵化學(xué)鍵的拉曼光譜分析結(jié)果[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞中重要成分在拉曼光譜中的分析

利用拉曼光譜分析儀在中等激光強(qiáng)度、532 nm波長、曝光時(shí)間1 s、無偏振檢測的條件下采集正常水稻葉片的拉曼光譜，采集波數(shù)范圍為200～3 400 cm-1。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白是在植物中主要存在的物質(zhì)，其中半胱氨酸（cysteine）是幾丁質(zhì)結(jié)合域的主要特征。半胱氨酸分子式為HSCH2CH（NH2）COOH，它含有羰基—CO、亞甲基—CH2—、巰基—SH、氨基—NH2等多種官能團(tuán)。446、535 cm-1分別對應(yīng)半胱氨酸羧基（—COOH）的面內(nèi)搖擺振動(dòng)和面外搖擺振動(dòng)，是區(qū)別于胱氨酸、乙酰半胱氨酸的標(biāo)志特征峰。從峰值相對強(qiáng)度可以看出在水稻葉片中半胱氨酸含量相對較少，導(dǎo)致標(biāo)志特征峰強(qiáng)度低。695 cm-1為半胱氨酸的C—S鍵，其實(shí)此處譜峰是693、 695 cm-1 峰的疊加譜峰，但由于儀器分辨率不高，故只能看到1個(gè)明顯的拉曼峰。990、1 043 cm-1為半胱氨酸中的甲基（—CH3），它們同屬于甲基的面內(nèi)搖擺振動(dòng)。同時(shí)可以看到 990 cm-1峰的強(qiáng)度偏弱，再次說明半胱氨酸的含量較少。1 043 cm-1附近峰是個(gè)椅形結(jié)構(gòu)，在1 043 cm-1附近的幾個(gè)波數(shù)內(nèi)是一種水平結(jié)構(gòu)，這是由于受附近1 050 cm-1譜峰交疊影響而不能表現(xiàn)為突出的峰（圖1-a）。1 349、1 365、1 385、1 392、1 412 cm-1等為半胱氨酸分子中—CO的伸縮振動(dòng)與—O—H鍵偶合的拉曼譜峰，在這些拉曼譜峰中以波數(shù) 1 392 cm-1峰相對強(qiáng)度最大。1 348、2 966 cm-1為半胱氨酸中的亞甲基（—CH2）的伸縮振動(dòng)和變形振動(dòng)（圖1-b）。

1 680～1 710 cm-1為巰基（—SH）在周圍不飽和鍵化學(xué)環(huán)境影響下的吸收峰；1 700～1 640 cm-1為飽和鍵化學(xué)環(huán)境影響下的吸收峰。2 498 cm-1為巰基的伸縮振動(dòng)，說明在植物葉片中具有巰基的存在；同時(shí)，處在不飽和巰基頻率范圍段內(nèi)的峰值有1 687、1 699、1 710 cm-1等3個(gè)；在飽和巰基頻率范圍段內(nèi)的峰值有1 641、1 653、1 670、1 687、1 699 cm-1 等5個(gè)（圖1-c、圖1-d）。

2.2 水稻蛋白質(zhì)的主鏈構(gòu)象與二級結(jié)構(gòu)分析

從水稻葉片的拉曼光譜中可以得到許多可貴的信息，包括葉片蛋白質(zhì)中類似于芳香族組成的氨基酸的信息，進(jìn)一步得到的二級結(jié)構(gòu)的信息。蛋白質(zhì)的主鏈構(gòu)象的拉曼光譜復(fù)雜多樣，但它們主要由骨架C—C、C—N和肽鍵（—CONH—）引起。C—C伸縮振動(dòng)的譜線，α-螺旋區(qū)域在890～945 cm-1，無規(guī)卷曲區(qū)域在945～960 cm-1，且構(gòu)象靈敏；而C—N伸縮振動(dòng)在1 070～1 130 cm-1，且構(gòu)象靈敏。蛋白質(zhì)中的肽鍵可以引起多種類型的振動(dòng)模式，分別叫做酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ、酰胺Ⅳ。其中酰胺Ⅰ是肽鍵中的羰基（—CO）伸縮振動(dòng)，在自由結(jié)構(gòu)中的譜峰在1 670～ 1 700 cm-1，在結(jié)合結(jié)構(gòu)中在1 630～1 680 cm-1；酰胺Ⅲ是C—N鍵的伸縮振動(dòng)，在拉曼光譜中為強(qiáng)譜線，譜峰所在位置在1 290 cm-1附近。它們對蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化十分敏感，而酰胺Ⅰ峰在拉曼譜圖上明顯，但是拉曼譜圖上的酰胺Ⅱ峰及NH峰非常弱以致不好辨識。在研究蛋白質(zhì)的及多肽結(jié)構(gòu)時(shí)，由于譜峰過多，酰胺Ⅱ和酰胺Ⅳ就起不到作用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中某些氨基酸含有C—S鍵，它有2種構(gòu)象，其中632、646.5、661 cm-1為含有扭曲構(gòu)象的C—S鍵；704、721、743 cm-1為含有反式構(gòu)象的C—S鍵。1 410 cm-1附近為羧基（—COOH）對稱伸縮振動(dòng)；2 550～2 590 cm-1 之間存在巰基（—SH） （圖2）。

851、828 cm-1的雙峰為酪氨酸（C9H11NO3）對羥苯基環(huán)的呼吸振動(dòng)和環(huán)平面外彎曲振動(dòng)的倍頻之間的費(fèi)米共振引起的，且雙峰隨側(cè)鏈微環(huán)境而改變?，F(xiàn)在的強(qiáng)度比值I851/828=30 968/31 854=0.972，該值小于1，說明該酪氨酸的部分是埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部。對酪氨酸殘基進(jìn)行計(jì)算，其中酪氨酸的殘基滿足如下表達(dá)式：

N埋+N露=1；

0.5N埋+1.25N露=I851/828。（1）

得到N露≈0.63，N埋≈0.37。但需要注意，因?yàn)樗救~片光譜采集在有熒光處采集而非在暗室中采得，計(jì)算所得酪氨酸殘基誤差相對較大，但是在有誤差的情況下說明了一定的蛋白質(zhì)構(gòu)型問題。與酪氨酸對應(yīng)的譜線還有647、1 177、1 211、1 610、1 624 cm-1等5條譜線[9]。

色氨酸中具有吲哚環(huán)。吲哚是吡咯與苯并聯(lián)的化合物，別稱苯并吡咯，分子式為C8H7N。2種并合方式，分別稱為吲哚和異吲哚。吲哚是一種亞胺，具有弱堿性；雜環(huán)的雙鍵一般不發(fā)生加成反應(yīng)；在強(qiáng)酸的作用下可以生發(fā)二聚合和三聚合作用；在特殊的條件下，能進(jìn)行芳香親電取代反應(yīng)。色氨酸的吲哚環(huán)引起的譜線分別在759、875.5、1 012、1 334、1 367、1 550、1 624 cm-1附近。其中吲哚環(huán)的N—H彎曲振動(dòng)譜線在 1 435 cm-1 處，而1 367 cm-1的譜線對于周圍化學(xué)結(jié)構(gòu)環(huán)境的改變是非常敏感的，可以看出的譜線是鈍形峰，說明色氨酸中的吲哚還是暴露在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以外，如果色氨酸殘基是埋藏的，該譜線會呈尖銳峰形（圖2）。

1 004 cm-1為苯丙氨酸的單基取代苯環(huán)是引人注意的強(qiáng)峰，但它的構(gòu)象不靈敏，如果蛋白質(zhì)沒有共價(jià)鍵斷裂，可以作為內(nèi)標(biāo)，屬于苯丙氨酸殘基的譜線還有624、1 609、1 624 cm-1等3條譜線。如果在純蛋白質(zhì)水溶液中，還有1 032、 1 203 cm-1 等2條譜線，但是由于殘基受到其他基團(tuán)的影響，在水稻葉片的蛋白質(zhì)拉曼光譜中沒有得到體現(xiàn)。S—S鍵有3種構(gòu)象，在（510±5） cm-1出現(xiàn)的譜線屬于扭曲-扭曲-扭曲構(gòu)象（gauche-gauche-gauche），在（525±5） cm-1的譜線屬于扭曲-扭曲-反式構(gòu)象（gauche-gauche-trans），在（540±5） cm-1的譜線屬于反式-扭曲-反式構(gòu)象（trans-gauche-trans）。

2.3 水稻核蛋白及遺傳物質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析

雖然組蛋白是蛋白質(zhì)成分的一部分，根據(jù)細(xì)胞組成來看，也不宜作為純蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，所以將其歸入遺傳物質(zhì)進(jìn)行拉曼光譜分析。核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，由DNA和組蛋白構(gòu)成。其中，DNA是細(xì)胞的主要遺傳物質(zhì)，是一種長鏈聚合物，由4種脫氧核苷酸，即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶組成，一般由C、H、O、N、P等5種元素組成。1個(gè)脫氧核苷酸分子由3個(gè)分子組成，即含氮堿基、脫氧核糖和磷酸。而糖類和磷酸分子借由酯鍵相連，組成長鏈骨架。由于細(xì)胞核內(nèi)相對濕度比較大，所以DNA的構(gòu)象是一種含水量大的構(gòu)象形式，其特征譜線大約在840 cm-1波數(shù)上。脫氧核酸的譜線有4根，分別為1 446、1 467、924、984 cm-1。脫氧核糖的譜線有934、1 012、1 051、1 066、1 446 cm-1等5條，其中 1 012、1 051 cm-1 的譜線屬于脫氧核糖的C—O伸縮振動(dòng)，721、1 223、1 306、1 335、1 505 cm-1屬于腺嘌呤一些基團(tuán)的譜線。1 492 cm-1 屬于鳥嘌呤的一些基團(tuán)的譜線。1 528、1 385、1 262 cm-1 的譜線分別屬于腺嘌呤和胞嘧啶，胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤，以及鳥嘌呤和胞嘧啶的一些基團(tuán)。屬于包括堿基之間氫鍵在內(nèi)的胸腺嘧啶羰基的伸縮振動(dòng)的譜線在 1 670 cm-1 處，當(dāng)堿基之間的氫鍵斷裂時(shí)該譜線會向低波數(shù)位移。1 197 cm-1的譜線屬于堿基外C—N伸縮振動(dòng)。DNA骨架磷酸基團(tuán)的譜線有2根，它們是在774 cm-1的磷酸二酯PO2對稱伸縮振動(dòng)的譜線和1 089 cm-1磷酸離子對稱伸縮振動(dòng)。

屬于堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的譜線如下：（1）屬于腺嘌呤（A）的有720、1 250、1 305、1 334、1 426、1 492、1 517 cm-1；（2）屬于鳥嘌呤（G）的有686、1 325、1 426、1 492 cm-1；（3）屬于胞嘧啶（C）的有1 250 cm-1；（4）屬于胸腺嘧啶（T）的有661、1 211、1 237、1 653 cm-1。

RNA骨架磷酸基團(tuán)有2根譜線。其中磷酸離子對稱伸縮振動(dòng)在1 103.5 cm-1處譜線是構(gòu)象不靈敏的，構(gòu)象靈敏的磷酸二酯PO2對稱伸縮振動(dòng)的譜線在813 cm-1處。若磷酸骨架處于有序的狀態(tài)時(shí)，會在813 cm-1處產(chǎn)生強(qiáng)的拉曼光譜。而若RNA的構(gòu)象變?yōu)闊o序時(shí)它將移位到808～795 cm-1 之間的某個(gè)譜線處。對于RNA的4種堿基特征拉曼譜線與DNA中相一致。

碳水化合物是組成細(xì)胞內(nèi)糖蛋白和糖脂的重要成分，它們在細(xì)胞通信和供應(yīng)細(xì)胞活動(dòng)所需的能源方面扮演了重要的角色。對于能以高度支鏈化形式及α、β-糖苷異構(gòu)形式存在的寡糖鏈，其種類和連接方式非常多，它能以最小的結(jié)構(gòu)單位承載最大的生物信息量而成為最理想的信息載體。糖蛋白的糖類部分與細(xì)胞的抗原結(jié)構(gòu)、受體、細(xì)胞免疫、細(xì)胞識別等有密切關(guān)系。根據(jù)譜圖分析，獲得該細(xì)胞內(nèi)的部分碳水化合物的信息：（1）屬于葡萄糖的有550、743、1 025、1 051、1 076、1 119、1 349 cm-1；（2）屬于D-甘露糖的有743、924、955、1 076、1 103 cm-1；（3）屬于葡萄糖醛酸的有564、743、1 025、1 051、1 076、1 119、1 349 cm-1；（4）屬于N-乙?；咸烟堑挠?43、984、1 025 cm-1。

3 結(jié)論與討論

本研究從細(xì)胞的化學(xué)成分入手，分析了包括羰基—CO、亞甲基—CH2—、巰基—SH、氨基—NH2等多種官能團(tuán)的拉曼特征振動(dòng)頻率，并對光譜曲線中出現(xiàn)的特殊結(jié)構(gòu)（如椅形結(jié)構(gòu)）進(jìn)行理論分析和解釋。然后針對細(xì)胞組成的兩大成分蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)像進(jìn)行相應(yīng)的拉曼光譜分析。在蛋白質(zhì)分析過程中，分析酪胺酸中埋藏的和暴露的殘基的比例關(guān)系，分析C—C單鍵伸縮振動(dòng)的α-螺旋、β-折疊、β-回折和無規(guī)卷曲方面的信息，同時(shí)著重對于氨基酸縮合肽鍵的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ譜線進(jìn)行較為細(xì)致的分析。遺傳物質(zhì)是每個(gè)生物體所具有重要結(jié)構(gòu)，本研究針對核小體以及組成DNA的脫氧核苷酸進(jìn)行構(gòu)型分析，同時(shí)也分析了RNA的骨架磷酸基團(tuán)的特征拉曼譜線；并總結(jié)得出水稻葉片中的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的多個(gè)對應(yīng)譜峰。針

對糖蛋白和糖脂的重要組成成分，分析了碳水化合物中葡萄糖、D-甘露糖、葡萄糖醛酸、N-乙?；咸烟堑?種構(gòu)象的拉曼特征譜線。由于植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不可能將立體結(jié)構(gòu)完全進(jìn)行構(gòu)象分析，所以通過水稻葉片中各種部分的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象分析，實(shí)現(xiàn)了水稻葉片半定量分析的目的，為今后拉曼光譜檢測寒地水稻病害對比分析提供了理論基礎(chǔ)。

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