豬圓環(huán)病毒2型泰州株的分離鑒定

郭廣富+曹軍平+朱愛(ài)萍+金彩蓮+戴麗紅+陶宏衛(wèi)

摘要：2011年9月，泰州某豬場(chǎng)暴發(fā)疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征傳染性疾病。采集發(fā)病豬腹股溝淋巴結(jié)、脾臟和肺臟組織，研磨成組織混懸液，經(jīng)PCR檢測(cè)、陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序，陽(yáng)性病料懸液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后接種PK15細(xì)胞，連續(xù)盲傳5代后收取細(xì)胞病毒液并提取DNA，PCR檢測(cè)及間接免疫熒光鑒定，結(jié)果表明，該分離株為豬圓環(huán)病毒2型（PCV2），命名為TAIZ110926株，目標(biāo)序列提交給NCBI，獲得了序列號(hào)：KF039888。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；分離；鑒定；目標(biāo)序列

中圖分類號(hào)： S858.285.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0294-02

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒，具有豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）2種基因型。PCV2感染豬群能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎和腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）及懷孕母豬繁殖障礙（sow abortion and mortality syndrome，SAMS）等[1]。血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查證實(shí)，PCV2呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。本研究通過(guò)對(duì)泰州市某豬場(chǎng)疑似PMWS患豬采集肺臟及淋巴結(jié)等組織病料進(jìn)行PCV2的分離、鑒定，以期為今后深入研究和科學(xué)防控該病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征豬的腹股溝淋巴結(jié)、脾臟和肺臟等組織，于2011年9月26日采自泰州市某豬場(chǎng)。無(wú)PCV污染的PK15由江蘇省動(dòng)物流行病學(xué)研究中心保存?；蚪MDNA快速抽提試劑盒（動(dòng)物）、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2及10×PCR buffer均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品，100 bp DNA Ladder和6×DNA 凝膠載入染料（Loading Dye）購(gòu)自Fermentas公司。豬源抗PCV2陽(yáng)性血清，購(gòu)自VMRD公司；羊抗豬IgG-FITC，購(gòu)自SANTN CRUZ公司。胰酶細(xì)胞消化液，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；新生牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)[4]的方法，合成1對(duì)PCV2引物，片段針對(duì)PCV2 ORF2基因中的一段序列，長(zhǎng)487 bp。引物序列為上游引物：5′-CTgTTTTCgAACgCAgTgCC-3′；下游引物：5′-gCATCTTCAACACCCgCCT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病料處理

將采集的脾臟、淋巴結(jié)和肺等病變組織，研磨研碎，按1 ∶5 加入無(wú)菌含雙抗的PBS溶液，混勻，反復(fù)凍融3次，離心取上清，用孔徑0.22 μm濾器過(guò)濾后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病料的PCR檢測(cè)和測(cè)序

用基因組DNA快速抽提試劑盒，按說(shuō)明書(shū)上的操作方法提取組織病料DNA。以提取的組織病料DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用50 μL反應(yīng)體系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結(jié)果。

PCR產(chǎn)物的回收和純化：PCR產(chǎn)物電泳后，按Agrose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，回收純化預(yù)期大小的靶片段。

PCR產(chǎn)物的克隆、鑒定、序列測(cè)定：取3.2 μL回收純化產(chǎn)物與pGEM-T easy vector載體（Promega）4 ℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在IPTG+X-gal+Amp的LB平板上篩選白斑，常規(guī)方法小量提取質(zhì)粒。質(zhì)粒初步電泳驗(yàn)證后，進(jìn)行PCR鑒定。選擇陽(yáng)性克隆，送南京Genscript公司在ABI 3720 DNA測(cè)序儀上測(cè)序：T7和SP6或M13+和M13-雙向測(cè)序。

基因序列比對(duì)：采用Lasergene 7.1版（DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA）進(jìn)行序列的拼接編輯；使用NCBI網(wǎng)站提供的BLAST程序，查找同源率最高的核苷酸序列以進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 病毒的分離培養(yǎng)

將上述“1.3”節(jié)處理的經(jīng)PCR檢測(cè)呈PCV2陽(yáng)性的病料懸液接種于長(zhǎng)至半融合狀態(tài)的PK15細(xì)胞上，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗滌2次，加入維持液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞反復(fù)凍融3次后，取上清繼續(xù)在PK15細(xì)胞上盲傳5代。

1.6 病毒的間接免疫熒光鑒定

將第5代分離株接種于長(zhǎng)滿單層的PK15細(xì)胞，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗滌2次，加入維持液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；同時(shí)以未接種病毒的PK15細(xì)胞作為陰性對(duì)照。待檢細(xì)胞使用PBS洗滌3次，冰甲醇室溫固定30 min；PBS洗滌3次，加入PCV2一抗（豬PCV2陽(yáng)性血清），37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次，再加入FITC標(biāo)記的羊抗豬二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次后，置于Olympus倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料的PCR檢測(cè)和測(cè)序

對(duì)疑似PCV2感染豬組織病料提取DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出片段大小為487bp的目的條帶，與預(yù)期的結(jié)果相符（圖1）。

將圖1所示靶片段回收純化連接測(cè)序，獲得了預(yù)期大小487 bp的序列，提交給NCBI，獲得了序列號(hào)：KF039888。通過(guò)BLAST，發(fā)現(xiàn)本研究所測(cè)毒株序列與GenBank中Porcine circovirus 2 isolate PCV-Y21 （KC515013）的核苷酸同源性最高（99.8%），說(shuō)明它們的相關(guān)基因起源可能相同。

2.2 病毒的分離培養(yǎng)

接種病料的PK15細(xì)胞培養(yǎng)72 h無(wú)細(xì)胞病變，而且盲傳5代也沒(méi)有出現(xiàn)。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)物的PCR檢測(cè)

第5代細(xì)胞毒液抽提DNA后經(jīng)PCR檢測(cè)，能夠擴(kuò)增出487 bp大小的特異性片段（圖2）。

2.4 病毒的間接免疫熒光鑒定

在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到了典型的特異性綠色熒光，未接種PCV2病毒的PK15細(xì)胞沒(méi)有觀察到任何特異性熒光。結(jié)果表明，該分離株為PCV2。將分離的PCV2命名為TAIZ110926株（圖3、圖4）。

3 結(jié)論與討論

PCV2主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，造成免疫抑制、免疫能力下降，從而有利于其他病原體的并發(fā)或繼發(fā)感染。PCV2在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，因而對(duì)該病病原的深入研究具有非常重要的意義。

感染豬的許多組織（如淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、腎臟或肝臟）內(nèi)含有PCV2病毒粒子，可采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法分離該病毒。PK15細(xì)胞是目前用于PCV2病毒分離的主要細(xì)胞系。由于PCV2在PK15細(xì)胞上雖能生長(zhǎng)，但不產(chǎn)生細(xì)胞病變，因而需要結(jié)合其他方法來(lái)確認(rèn)PCV2的存在。一般借助PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)或電子顯微鏡觀察，以確認(rèn)病毒分離結(jié)果。

本試驗(yàn)將PCR檢測(cè)后PCV2陽(yáng)性的病料經(jīng)研磨、過(guò)濾，接種PK15細(xì)胞，連續(xù)盲傳5代后進(jìn)行PCR檢測(cè)及間接免疫熒光鑒定，結(jié)果成功分離出泰州株P(guān)CV2。該毒株的獲得，為今后深入研究該病毒的分子生物學(xué)特性及開(kāi)發(fā)有效的免疫制劑提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Grau-Roma L，F(xiàn)raile L，Segales J.Recent advances in the epidemiology，diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type 2 [J]. Vet，2011，187（1）：23-32.

[2]Gillespie J，Opriessnig T，Meng X J，et al. Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated disease [J]. J Vet Intern Med，2009，23（6）：1151-1163.

[3]Opriessnig T，Meng X J，Halbur P G. Porcine circoviruses type 2 associated disease：update on current terminology，clinical manifestations，pathogenesis，diagnosis，and intervention strategies [J]. J Vet Diagn Investig，2007，19：591-615.

[4]胡 慧，賈艷艷，楊春華，等. 多重PCR檢測(cè)豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型的研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，44（4）：421-424.高 峰， 房興堂，顧斐翠. 三合激素、甲睪酮對(duì)雛雞雞冠及內(nèi)臟器官發(fā)育的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：296-298.