茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶機理研究

程水明，雷霄宇，劉冰潔，劉瑩，王益，黃文，*（.廣東石油化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，廣東茂名55000；.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070）

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茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶機理研究

程水明1，雷霄宇2，劉冰潔2，劉瑩2，王益2，黃文2，*
（1.廣東石油化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，廣東茂名525000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070）

摘要：為明確茯苓皮中天然的三萜化合物抑制酪氨酸酶的保健功效，增強茯苓皮在生產(chǎn)加工中的應(yīng)用，提高其附加價值，采用體外生化酶學(xué)法研究茯苓皮三萜化合物對酪氨酸酶活性的抑制作用，初步探究茯苓皮三萜對酪氨酸酶的抑制的機理。結(jié)果表明氯仿萃取物對酪氨酸酶的抑制效果最好，氯仿是良好的萃取劑；茯苓皮三萜對酪氨酸酶的抑制屬于不可逆抑制。

關(guān)鍵詞：茯苓皮；三萜；酪氨酸酶；抑制率

茯苓［Poria cocos（Schw.）Wolf，茯苓的干燥菌核］，所屬多孔菌科真菌類，茯苓皮是在加工茯苓菌核時剝下的干燥表皮，呈不規(guī)則的片狀，體軟質(zhì)松，略有彈性，外表面是棕色或深至黑褐色，有瘤狀突起物；內(nèi)表面是白色至淡棕色，皮下部分常常有淡紅色［1］。在《四川中藥志》中，有關(guān)于茯苓皮的記載，稱其“性平，味甘淡，無毒”，并能“入腎、膀胱二經(jīng)”［2］?！夺t(yī)林篡要》中稱茯苓皮為“行皮膚之水”。《本草綱目》中有關(guān)茯苓皮的記載稱其“主水腫膚脹，能開水道，開腠理”［3］。并且與茯苓相比，茯苓皮在利水消腫的方面，其效果更是優(yōu)于茯苓［4］。

目前，經(jīng)常使用的酪氨酸酶活性抑制劑主要分為：化學(xué)合成物、微生物源材料和植物天然活性物質(zhì)［5］。但是由于化學(xué)合成物和微生物源材料具有毒性或穩(wěn)定性差等缺點，制約了其在實際應(yīng)用中的發(fā)展，而天然活性物質(zhì)對皮膚的刺激性小、且滲透性好、安全性高，因此具有抑制酪氨酸酶作用的天然活性成分越來越受到關(guān)注，有良好的研究價值。茯苓皮中的三萜類化合物作為天然活性物質(zhì)具有多種生理活性［6-7］，但在抑制酪氨酸酶機理方面的研究卻比較少。

本文研究了茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶酶活的活性及其產(chǎn)生作用的機制，旨在探討茯苓皮三萜的抑制酪氨酸酶的保健功效，為茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶機理的研究提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

原料及預(yù)處理：試驗中所用到的茯苓皮由湖北省九資河鎮(zhèn)提供，將茯苓皮風(fēng)干，用多功能粉碎機進行粉碎后過40目篩，防潮備用。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、VC、二甲亞砜（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；L-酪氨酸（生化試劑）：上海康達氨基酸廠。

1.2儀器與設(shè)備

722型可見分光光度計：上海新茂儀器有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠；AL203電子天平、Seven Easy pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RE-2000 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器有限公司；Apha2-4 LD冷凍干燥機：德國GHRIST公司。

1.3方法

1.3.1茯苓三萜的提?。?］

1.3.1.1茯苓皮中三萜化合物的提取

用溶劑浸提法對茯苓皮浸提，準(zhǔn)確稱量茯苓皮粉20g（過40目篩），萃取溶劑為甲醇，料液比為1∶20（g/mL），在70℃下水浴回流6 h，同樣條件下提取2次。每次提取后回收提取液，趁熱過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，低溫烘干或真空冷凍干燥，得到三萜粗提物干燥粉末。

1.3.1.2茯苓皮三萜的萃取

準(zhǔn)確稱取茯苓皮三萜粗提取物干燥粉末，混散于一定體積的蒸餾水中，分別用3倍劑量的萃取劑氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，直到萃取液為無色為止。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，低溫烘干或真空冷凍干燥，得到3種萃取物粉末。

1.3.2茯苓皮提取物三萜含量的測定［9］

1.3.2.1熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg溶于甲醇溶液并定容至50 mL，配制成0.05 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。分別量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL標(biāo)準(zhǔn)液，70℃條件下蒸干溶劑，之后的反應(yīng)條件參考易中宏等［9］所優(yōu)選出的條件進行試驗。最終在546 nm處測吸光值。由熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得回歸方程為：y = 0.064 2x- 0.010 4，其中R2= 0.99907。

1.3.2.2茯苓皮粗提取物和萃取物三萜含量的測定

準(zhǔn)備卻稱取茯苓皮三萜粗提取物和萃取物0.01 g，溶于100 mL甲醇溶液。量取2 mL該稀釋液，70℃條件下蒸干溶劑，之后的反應(yīng)條件參考易中宏等［9］所優(yōu)選出的條件進行試驗。最終在546 nm處測吸光值。

1.3.3樣品液的制備

分別精確稱取茯苓皮三萜粗提取物，用二甲亞砜溶解，依次配成1、3、5、7、9 mg/mL濃度梯度的樣品液備用。

分別精確稱取茯苓皮三萜氯仿、乙酸乙酯、正丁醇3種萃取物，分別用二甲亞砜溶解，依次配成1、3、 5、7、9 mg/mL濃度梯度的樣品液備用。

精確稱取VC，用蒸餾水溶解，依次配成1、3、5、7、9 mg/mL濃度梯度的樣品液備用。

1.3.4不同濃度抑制劑對酪氨酸酶活性的抑制［10-11］

酪氨酸酶活性抑制試驗利用L-酪氨酸作為底物進行催化反應(yīng)，用比色法于475 nm處測定吸光度變化。經(jīng)過前期試驗優(yōu)化結(jié)果選擇抑制反應(yīng)試驗條件為：反應(yīng)的溫度37℃，水浴恒溫時間10 min，反應(yīng)pH 6.8，反應(yīng)時間10min，加入的L-酪氨酸的濃度為0.6 mmol/mL，酶液的量為1.0 mL（97 IU/mL）。反應(yīng)中不同濃度樣品、二甲亞砜（DMSO）、磷酸緩沖液（PBS）、酪氨酸酶液、及L-酪氨酸的添加量如表1所示。

表1　各反應(yīng)成分的添加量Table 1 The additive content of different component

酪氨酸酶酶活的抑制率計算公式：

1.3.5茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶酶學(xué)機理研究［12-13］

1.3.5.1茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶酶活的機理

在5 mL磷酸緩沖液（pH 6.8）酶活測定體系中，固定底物L(fēng)-酪氨酸的濃度，改變加入的酪氨酸酶的量，測定不同濃度（1、3、5 mg/mL）茯苓皮三萜粗提物對酶催化L-酪氨酸氧化活力的影響，并用作圖法鑒別，用反應(yīng)速度對酶濃度作圖，如果作圖結(jié)果為一組直線且通過原點，則為可逆抑制；如果得到一組平行直線，則為不可逆抑制。

1.3.5.2抑制劑對酶的活力的反應(yīng)進程

以0.6 mmol/mL的L-酪氨酸為底物，測定茯苓皮三萜作為抑制劑對酪氨酸酶活力作用的影響。在5 mL的磷酸緩沖液（pH 6.8）體系中，加入1.0 mL L-酪氨酸溶液，3 mL磷酸緩沖液以及0.5 mL不同濃度的茯苓皮三萜溶液，37℃水浴10 min后加入1 mL酪氨酸酶?；靹蚝?，在37℃恒溫的條件下測定樣品的吸光度隨時間變化的增長變化曲線，從而得到反應(yīng)進程。

2　結(jié)果與分析

2.1茯苓皮粗提取物和萃取物三萜含量測定

茯苓皮粗提取物和萃取物三萜含量測定見表2。

表2　各種樣品中的三萜含量Table 2 The triterpenoids content of various samples

2.2抑制劑對酪氨酸酶的抑制作用

2.2.1不同濃度茯苓皮三萜粗提取物對酪氨酸酶的抑制作用

不同濃度的茯苓皮三萜粗提物對酪氨酸酶的抑制作用見圖1。

圖1　不同濃度茯苓皮三萜粗提取物對酪氨酸酶活性抑制作用Fig.1 The inhibition of different concentrations of crude extracts of Poria peel triterpenoids on tyrosinase activity

由圖1可知，茯苓皮三萜粗提取物對酪氨酸酶的抑制率與三萜的濃度有一定的相關(guān)性。抑制率先隨著樣品濃度的增大而增大，直至達到最大值，而后隨著樣品濃度的增大而快速降低，當(dāng)樣品濃度達到最大值9 mg/mL時，茯苓皮三萜提取物的抑制率降到最低點。茯苓皮三萜粗提取物濃度在5 mg/mL時對酪氨酸酶的抑制率達到最大值，抑制率可達43.4%。

對一些天然產(chǎn)物的活性研究發(fā)現(xiàn)，有部分天然產(chǎn)物對酪氨酸酶的抑制具有雙向作用［14-15］。本試驗中，茯苓皮三萜化合物對酪氨酸酶的抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，原因可能是由于抑制劑的量增加會增強其對酪氨酸酶的抑制效果，同時茯苓皮三萜化合對酪氨酸酶的抑制也具有雙向作用，所以抑制率曲線會出現(xiàn)一定的波動，抑制率有所下降，但是由于試驗中三萜樣品的濃度為達到文獻中所報道的激活酪氨酸酶的濃度，試驗結(jié)果只是表現(xiàn)出了一定的波動性，而并沒有顯示出其對酪氨酸酶的激活效果。

VC是目前公認(rèn)的酪氨酸酶抑制劑，因此本試驗選擇用VC做為茯苓皮三萜抑制作用的陽性對照。茯苓皮三萜提取物的抑制率與陽性對照品VC相比，茯苓皮三萜粗提取物在中間濃度5 mg/mL時，對酪氨酸酶的抑制效果明顯好于VC，在此濃度下，茯苓皮三萜對酶的抑制率比VC的抑制率高6%。在3 mg/mL時，茯苓皮三萜粗提取物對酪氨酸酶的抑制率也稍稍高于VC。而在其他濃度時，VC對酪氨酸酶的抑制效果均好于茯苓皮三萜粗提取物的抑制效果。

2.2.2不同濃度茯苓皮三萜氯仿萃取物對酪氨酸酶的抑制作用

不同濃度的茯苓皮三萜氯仿萃取物對酪氨酸酶活性抑制作用見圖2。

圖2　不同濃度茯苓皮三萜氯仿萃取物對酪氨酸酶活性抑制作用Fig.2 The inhibition of different concentrations of chloroform extract of Poria peel triterpenoids on tyrosinase activity

由圖2可知，茯苓皮三萜氯仿萃取物對酪氨酸酶的抑制率會隨著其濃度的變化而改變，呈先增大后減小的趨勢。氯仿萃取物對酶的抑制率在較低濃度時就能達到最大值，即3 mg/mL時達到最大抑制率52.6%。之后隨著樣品濃度的增大抑制效果降低，最低抑制率為22.8%。從總體來看，氯仿萃取物對酪氨酸酶的抑制率均比較高，尤其是在低濃度的范圍內(nèi)，其抑制率就能達到44%以上，在較高濃度范圍內(nèi)，抑制率雖有下降，但是仍然保持相對較高的抑制率。

氯仿萃取物對酶的抑制率在較低濃度范圍內(nèi)就能達到最大值，分析原因可能是由于氯仿萃取物中三萜的含量較高，其含量為56.51%，明顯高于茯苓皮三萜粗提取物和其他兩種萃取物中的三萜含量，因此能在相對較低的濃度時達到最大抑制率。氯仿萃取物3 mg/mL～9 mg/mL濃度范圍內(nèi)對酪氨酸酶抑制率會有所下降，可能是由于抑制劑量過多，與酪氨酸酶競爭性結(jié)合導(dǎo)致抑制劑之間相互干擾影響抑制效果［16］。

茯苓皮三萜氯仿萃取物的抑制率與陽性對照品VC相比，茯苓皮三萜氯仿萃取物在1 mg/mL至5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，其對酪氨酸酶的抑制效果均明顯好于VC。在5 mg/mL之后，抑制率逐漸降低，濃度高于7 mg/mL時，VC對酪氨酸酶的抑制效果好于茯苓皮三萜提取物的抑制效果。

2.2.3不同濃度茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物對酪氨酸酶的抑制作用

不同濃度的茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物對酪氨酸酶活性抑制作用見圖3。

圖3　不同濃度茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物對酪氨酸酶活性抑制作用Fig.3 The inhibition of different concentrations of ethylacetate extract of Poria peel triterpenoids on tyrosinase activity

由圖3可知，茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物在1mg/mL 至9 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，對酪氨酸酶的抑制作用呈先下降后上升，達到最高點之后又逐漸下降的趨勢。圖3顯示，在3 mg/mL時，乙酸乙酯萃取物對酪氨酸酶的抑制率低于1 mg/mL時的抑制率；并且在5 mg/mL時，抑制效果最好，抑制率達到40.8%；在較高濃度范圍內(nèi)，乙酸乙酯萃取物對酪氨酸酶的抑制率逐漸降低，最低為6.8%。

茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物對酪氨酸酶的抑制率與陽性對照品VC相比，茯苓皮三萜乙酸乙酯萃取物在低濃度和高濃度范圍內(nèi)，對酪氨酸酶的抑制效果均不如VC。只有在中間濃度5 mg/mL時，乙酸乙酯萃取物對酪氨酸酶的抑制率高于VC。

2.2.4不同濃度茯苓皮三萜正丁醇萃取物對酪氨酸酶的抑制作用

不同濃度的茯苓皮三萜正丁醇萃取物對酪氨酸酶活性抑制作用見圖4。

圖4　不同濃度茯苓皮三萜正丁醇萃取物對酪氨酸酶活性抑制作用Fig.4 The inhibition of different concentrations of n-butanol extract of Poria peel triterpenoids on tyrosinase activity

由圖4可知，在所測定濃度范圍內(nèi)，茯苓皮三萜正丁醇萃取物對酪氨酸酶的抑制作用與乙酸乙酯萃取物相似，同樣是先降低后升高，達到最高值后再次呈下降的趨勢。在5 mg/mL時，抑制效果最好。

茯苓皮三萜正丁醇萃取物對酪氨酸酶的抑制率與陽性對照品VC相比，茯苓皮三萜正丁醇萃取物在中間濃度5 mg/mL時，其抑制率高于VC。在7 mg/mL時，正丁醇萃取物的抑制率與VC相等。其他濃度樣品對酪氨酸酶抑制率均小于VC在該濃度的抑制。

2.3茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶的酶學(xué)抑制機理研究

2.3.1茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶的機理

在茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶活性反應(yīng)體系中，固定L-酪氨酸的濃度，改變酪氨酸酶的濃度，測定不同濃度茯苓皮三萜對酪氨酸酶催化L-酪氨酸氧化活力的影響，用反應(yīng)速度對酶濃度作圖，得到了茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶的機理，見圖5。

圖5　茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶活力抑制機理Fig.5 Activity inhibition mechanism of Poria peel triterpenoids inhibit tyrosinase

由圖5可知，酪氨酸酶在含茯苓皮三萜提取物的抑制體系中，酶的活力與加入酶濃度作圖，得到一組平行線且此組平行線并未通過原點。隨著茯苓皮三萜提取物濃度的增大，直線與X軸的交點逐漸右移，說明茯苓皮三萜提取物可能會與酪氨酸酶的活性部位以共價鍵的方式結(jié)合從而會引起酶活力的降低，此抑制作用屬于不可逆過程。

2.3.2茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶活力的反應(yīng)進程

以茯苓皮三萜提取物為效應(yīng)物，測定馬鈴薯酪氨酸酶催化L-酪氨酸反應(yīng)生成黑色素的反應(yīng)進程，以時間為橫坐標(biāo)，生成黑色素的吸光度為縱坐標(biāo)作圖，反應(yīng)進程曲線見圖6。

從圖6中的試驗結(jié)果表明，隨著酪氨酸酶催化反應(yīng)體系中茯苓皮三萜提取物濃度的增大，酪氨酸酶催化反應(yīng)時間有明顯遲滯現(xiàn)象（曲線直線部分與X軸的交點表示遲滯時間），催化反應(yīng)達到穩(wěn)定態(tài)時的斜率明顯減小。因此，茯苓皮三萜對馬鈴薯酪氨酸酶活性具有明顯的抑制效應(yīng)。同時，隨著茯苓皮三萜提取物濃度的增大，酪氨酸酶的穩(wěn)定態(tài)的活力顯著降低。

圖6　茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶活力的反應(yīng)進程Fig.6 The reaction process of Poria peel triterpenoids inhibit tyrosinase

遲滯現(xiàn)象是酪氨酸酶單酚酶活性的特征現(xiàn)象，分析茯苓皮三萜類物質(zhì)在抑制酪氨酸酶活性的過程中產(chǎn)生遲滯現(xiàn)象的原因，可能是因為酪氨酸酶的自身結(jié)構(gòu)特點使L-酪氨酸與酪氨酸酶結(jié)合的過程中空間位阻變大，導(dǎo)致傳質(zhì)速度降低進而對酪氨酸酶抑制作用的反應(yīng)速度產(chǎn)生影響，使其反應(yīng)速度降低。茯苓皮三萜作為抑制劑使L-酪氨酸更難與酪氨酸酶活性位點結(jié)合，因此導(dǎo)致遲滯時間延長。

3　結(jié)論與討論

通過對比不同茯苓皮三萜對酪氨酸酶的最大抑制率可知，在濃度為3 mg/mL時茯苓皮三萜氯仿萃取物對酪氨酸酶的抑制率為52.6%。在濃度為5 mg/mL時茯苓皮三萜粗提取物對酪氨酸酶的抑制率可達43.4%，抑制效果僅次于茯苓皮三萜氯仿萃取物。從經(jīng)濟成本的角度來講，茯苓皮為生產(chǎn)廢料，使用成本低并且有較好的抑制酪氨酸酶的功效，因此具有較高的經(jīng)濟利用價值。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對酪氨酸酶的抑制率雖相對較低，但在一定濃度范圍內(nèi)抑制率均高于VC。

結(jié)合茯苓皮三萜粗提取物及萃取物中三萜化合物的含量可以推斷，提取物中三萜化合物的含量對抑制酪氨酸酶的活性有直接的影響，提取物中三萜物質(zhì)含量高，其對酪氨酸酶的抑制作用越強；另外，氯仿萃取物表現(xiàn)出了較好地抑制效果，所以氯仿可作為茯苓皮三萜化合物良好的萃取劑。

通過研究茯苓皮三萜對酪氨酸酶抑制機理和反應(yīng)進程，結(jié)果表明：茯苓皮三萜對酪氨酸酶活性具有明顯的抑制效應(yīng)，屬于不可逆抑制；同時，隨著茯苓皮三萜提取物濃度的增大，酪氨酸酶的穩(wěn)定態(tài)的活力顯著降低，說明茯苓皮三萜是通過降低酶活力的穩(wěn)定態(tài)從而達到抑制酶活的效果。劉有停［17］在對熊果苷抑制酪氨酸酶的動力學(xué)機制研究中發(fā)現(xiàn)，α-熊果苷對酪氨酸酶的抑制屬于不可逆抑制，對酶活力的影響表現(xiàn)為降低蘑菇酪氨酸酶的穩(wěn)態(tài)酶活力，同樣會延長酶催化反應(yīng)的遲滯時間。而有一些天然活性物質(zhì)對酪氨酸酶的抑制會表現(xiàn)為可逆型抑制作用，造成抑制類型不同的原因可能是由于其活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同從而使天然抑制劑與酶產(chǎn)生了不同的作用方式［18］。

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Analysis of the Whitening Active of Triterpenoids from Poria cocos Peel and Mechanism of Tyrosinase Inhibition

CHENG Shui-ming1，LEI Xiao-yu2，LIU Bing-jie2，LIU Ying2，WANG Yi2，HUANG Wen2，*
（1. College of Environmental and Bioengineering，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000，Guangdong，China；2. College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，Hubei，China）

Abstract：In order to investigate the healthgiving benefit of triterpenoids in Poria cocos peel on the inhibition against tyrosinase and enhance both the applications of Poria peel in production and processing and its added value，the inhibition of triterpenoids from Poria cocos peel against tyrosinase was tested using in vitro biochemical enzymatic method and its mechanism was explored initially. The results showed that the inhibitory effect of chloroform extract on tyrosinase was the best and chloroform was a good extraction agent；meanwhile the inhibition was irreversible.

Key words：Poria cocos peel；triterpenoids；tyrosinase；inhibition rate

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.005

基金項目：廣東省高等學(xué)校人才引進專項基金（粵財教［2012］41號）

作者簡介：程水明（1966—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品微生物學(xué)。

*通信作者

收稿日期：2015-03-16