一株產(chǎn)酯酶菌的分離鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究

段　俐，趙　一，王崇慧，王麗麗

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

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一株產(chǎn)酯酶菌的分離鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究

段俐，趙一，王崇慧，王麗麗

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

摘要：從土壤中分離得到一株產(chǎn)酯酶菌，經(jīng)16S rDNA 序列測(cè)定，屬于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，命名為S.mal SF-H。對(duì)該菌株產(chǎn)酶的誘導(dǎo)效應(yīng)及其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入5 g·L-1檸檬酸三正丁酯塑化劑，可以有效誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)生酯酶，所產(chǎn)酯酶對(duì)短鏈脂肪酸酯的水解活性有明顯底物特異性和差異性。以對(duì)硝基苯乙酸酯為底物時(shí)，酶液表現(xiàn)出良好的耐溫性，最適溫度為80 ℃，且70 ℃保溫2 h的相對(duì)酶活力為95%，最適pH值為9.0，在pH值為8.0時(shí)穩(wěn)定性最好；以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物時(shí)，酶的最適溫度為70 ℃，70 ℃保溫2 h的相對(duì)酶活力為51%，最適pH值為8.0，在pH值為8.0～10.0時(shí)穩(wěn)定性最好。所產(chǎn)酯酶的耐溶劑性表現(xiàn)基本一致，在66%丁醇和66%乙醇中相對(duì)酶活力均約為60%。

關(guān)鍵詞：酯酶；檸檬酸三正丁酯；16S rDNA；嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌

酯酶(esterase，EC3.1.1.1)是一類(lèi)特異水解短鏈脂肪酸酯的水解酶類(lèi)，廣泛存在于動(dòng)物、 植物和微生物中。研究發(fā)現(xiàn)，酯酶可以在有機(jī)相中完成酯化、轉(zhuǎn)酯、酯交換等多種反應(yīng)[1]，特別是可專(zhuān)一性地制備許多化學(xué)法難以合成的手性化合物和聚合物[2-3]。閻家麒[4]采用牛肝酯酶催化了紫杉醇側(cè)鏈的手性合成。王博[5]篩選得到了一種高活性和高選擇性的水解酶(酯酶Escherichia coliBioH)，該酶對(duì)仲醇類(lèi)化合物具有非常好的手性選擇性，在水溶液中可以將一系列仲醇乙酸酯較好地拆分，ee值最高可達(dá)98%。鞠鑫[6]篩選得到了一株以高活力和高對(duì)映選擇性催化S-乙?；馓宜崴獾募賳伟鶳seudomonassp.ECU1011，其能以乙酰基扁桃酸及扁桃酸甲酯和乙酯為目標(biāo)底物酶促水解生成手性扁桃酸。Li等[7-8]從古生物球菌中提取了一種嗜熱酯酶，在甲苯溶液中于70 ℃催化ε-己內(nèi)酯開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)，反應(yīng)24h時(shí)產(chǎn)率達(dá)到99%。與化學(xué)法相比，酯酶催化反應(yīng)的條件溫和，可避免使用有毒催化劑。

塑化劑，也稱(chēng)增塑劑，是在塑料加工中添加的一種高分子助劑，以增強(qiáng)塑料的柔韌性和可加工性。目前，塑化劑的生產(chǎn)都是通過(guò)化學(xué)法完成的，探索酶法合成檸檬酸酯類(lèi)塑化劑的途徑，是綠色生物技術(shù)的研究方向之一。由于酯酶具有水相分解、有機(jī)相催化合成的功效，因此，作者在此篩選能夠水解檸檬酸酯類(lèi)塑化劑的酯酶，并對(duì)其進(jìn)行鑒定和酶學(xué)性質(zhì)研究。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料、試劑與培養(yǎng)基

土壤樣本，取自多地。

對(duì)硝基苯乙酸酯、對(duì)硝基苯丁酸酯、對(duì)硝基苯辛酸酯、對(duì)硝基苯月桂酸酯、對(duì)硝基苯棕櫚酸酯，北京百靈威科技有限公司；塑化劑檸檬酸三正丁酯(LM30)，江蘇雷蒙化工科技有限公司。

ZM-CD液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1L)：(NH4)2SO44g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O1g、NaCl0.5g、Fe2+1mg、Zn2+1mg、Mn2+0.5mg、Cu2+0.5mg，調(diào)pH=7.0，121 ℃下高溫滅菌，無(wú)菌GF(1mL/400mL)。

篩選固體培養(yǎng)基(1L)：ZM-CD液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入瓊脂22g及LM30 10g。

富集液體培養(yǎng)基(1L)：ZM-CD液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入LM30 10g及溴甲酚紫0.04g(變色pH值范圍：5.2～6.8，黃色～紫色)，pH=7.0。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基(1L)：ZM-CD液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同濃度的蛋白胨、酵母粉、碳源、LM30等。

1.2方法

1.2.1菌株的富集與篩選

將100份土壤樣品稀釋后，分別涂布到篩選固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃下培養(yǎng)3d；挑取生長(zhǎng)良好的菌落，分別接種到50mL/250mL富集液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180r·min-1下培養(yǎng)3d，淘汰溴甲酚紫不變色的搖瓶，保留變成黃色的搖瓶；10%接種，轉(zhuǎn)接到新的富集液體培養(yǎng)基中，連續(xù)富集培養(yǎng)5代。每一代均保留變色時(shí)間短、生長(zhǎng)快的搖瓶，將最后一代富集液梯度稀釋分離，得到純化優(yōu)勢(shì)菌株。

1.2.2菌株的鑒定

擴(kuò)增菌株后，進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增及序列分析，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn搜索[9]，獲得與其同源性相近的序列，再使用MEGA6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3酯酶酶活力的測(cè)定

菌株液體培養(yǎng)30h后，于6 500r·min-1下離心10min，取上清液作為粗酶液，參照文獻(xiàn)[10-11]方法測(cè)定酯酶酶活力。

酶活力單位：每分鐘釋放出1μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

相對(duì)酶活力：處理樣品的酶活力與最大酶活力的百分比。

1.2.4酶液的濃縮及SDS-PAGE凝膠電泳

使用10kDa的截止離心膜過(guò)濾器(Millipore公司，美國(guó))對(duì)上清液進(jìn)行超濾濃縮[12]，12mL粗酶液在5 000g、4 ℃的條件下離心40min，得到200μL的粗酶濃縮液。將所得粗酶濃縮液處理后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.2.5酶學(xué)性質(zhì)分析

以粗酶液為檢測(cè)對(duì)象，測(cè)定反應(yīng)溫度、pH值、有機(jī)溶劑等對(duì)酶活力的影響。

2結(jié)果與討論

2.1菌株的篩選及鑒定

培養(yǎng)基以塑化劑LM30作為唯一碳源，若胞外酯酶分解LM30，會(huì)使檸檬酸的羧基游離，溶液pH值下降，酶活力提高，分解速度加快，當(dāng)培養(yǎng)基pH值下降到5.2以下時(shí)會(huì)由紫色變成黃色。因此，對(duì)變色最快的菌株進(jìn)行多輪富集培養(yǎng)，再稀釋分離純化，并經(jīng)液體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)3 d后，測(cè)定酯酶酶活力，篩選出酶活力較高的菌株，作進(jìn)一步的鑒定[13-14]，并將其命名為SF-H。

菌株SF-H在固體培養(yǎng)基上于30 ℃下培養(yǎng)24 h后，菌落呈灰黃色，圓形，表面較黏稠而濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊。顯微鏡下個(gè)體形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色為陰性。

對(duì)菌株SF-H進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增、序列分析，結(jié)果表明，該菌株與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)16S rDNA的一致性為99%，鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SF-H(StenotrophomonasmaltophiliaSF-H，縮寫(xiě)為S.malSF-H)，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示。

圖1　菌株S.mal SF-H與Stenotrophomonas maltophilia屬內(nèi)各菌種間基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2S.mal SF-H菌株生長(zhǎng)與酯酶產(chǎn)生關(guān)系的研究

菌株S.malSF-H在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，每隔6 h取樣測(cè)定其在600 nm下的吸光度(OD600值)及上清液酶活力，以菌株生長(zhǎng)和相對(duì)酶活力(以最高值為100%)對(duì)時(shí)間作圖得到S.malSF-H菌株生長(zhǎng)曲線和酯酶產(chǎn)生曲線，如圖2所示。

圖2　S.mal SF-H菌株生長(zhǎng)曲線與酯酶產(chǎn)生曲線

由圖2可知，菌株在12 h時(shí)達(dá)到最大菌體量，18 h后菌體量開(kāi)始逐漸減少；在0～30 h時(shí)，相對(duì)酶活力逐漸增大，30 h時(shí)達(dá)到最大值，超過(guò)30 h后，相對(duì)酶活力逐漸降低。因此，發(fā)酵周期定為30 h。

2.3塑化劑LM30對(duì)產(chǎn)酶的誘導(dǎo)效應(yīng)

將菌株S.malSF-H分別在含有和不含有塑化劑LM30的發(fā)酵培養(yǎng)基(含麥芽糖、酵母粉、蛋白胨3種有機(jī)物)中培養(yǎng)30 h后，離心獲得上清液，分別超濾濃縮60倍后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。

M.上樣Marker　1.空白培養(yǎng)基　2.未加

由圖3可知，加入LM30后胞外蛋白產(chǎn)物明顯增多，特別是分子量大小在20 kDa左右的兩條蛋白帶。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的基因組信息顯示，Stenotrophomonasmaltophilia含有6個(gè)酯酶基因，其中有2個(gè)基因產(chǎn)物的分子量大小都在20 kDa左右，可推測(cè)圖3中20 kDa的蛋白帶為酯酶的2個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物，表明LM30有明顯的產(chǎn)酯酶誘導(dǎo)作用。

2.4S.mal SF-H菌株所產(chǎn)酯酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1酯酶的底物特異性

用0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)分別配制5種底物溶液：對(duì)硝基苯乙酸酯(pNPC2)、對(duì)硝基苯丁酸酯(pNPC4)、對(duì)硝基苯辛酸酯(pNPC8)、對(duì)硝基苯月桂酸酯(pNPC12)、對(duì)硝基苯棕櫚酸酯(pNPC16)。用等量酶液分別水解5種底物，在pH=8.0、37 ℃下水浴5 min后，測(cè)定產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的產(chǎn)量，進(jìn)而比較酶活力大小，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　S.mal SF-H菌株所產(chǎn)酯酶的底物特異性

由圖4可知，對(duì)硝基苯乙酸酯作為底物的相對(duì)酶活力最大，對(duì)硝基苯丁酸酯作為底物的相對(duì)酶活力次之，其它3種底物的相對(duì)酶活力很小，有明確的底物特異性。表明，菌株S.malSF-H產(chǎn)生的胞外蛋白均為酯酶，而非脂肪酶。

2.4.2酯酶的最適反應(yīng)溫度

分別以對(duì)硝基苯乙酸酯、對(duì)硝基苯丁酸酯為底物，測(cè)定不同反應(yīng)溫度(30～80 ℃)下的相對(duì)酶活力(以最大值為100%)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，相對(duì)酶活力逐漸升高；當(dāng)反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí)，以對(duì)硝基苯乙酸酯為底物的相對(duì)酶活力仍在升高，而以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物的相對(duì)酶活力開(kāi)始下降，但仍有92%。說(shuō)明該酯酶有較高的溫度耐受性[15-16]，以對(duì)硝基苯乙酸酯為底物時(shí)，酶的最適溫度為80 ℃，以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物時(shí)，酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃。

2.4.3反應(yīng)溫度對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響

將酶液分別置于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、 70 ℃和80 ℃的水浴中，反應(yīng)2 h后恢復(fù)到37 ℃，分別測(cè)定以對(duì)硝基苯乙酸酯和對(duì)硝基苯丁酸酯為底物的相對(duì)酶活力(以4 ℃下保存的酶活力為最大值100%)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5　反應(yīng)溫度對(duì)酯酶活力的影響

圖6　反應(yīng)溫度對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，在50 ℃下，以對(duì)硝基苯乙酸酯為底物的相對(duì)酶活力為96%，以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物的相對(duì)酶活力為63%；在70 ℃下，以對(duì)硝基苯乙酸酯為底物的相對(duì)酶活力為95%，以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物的相對(duì)酶活力為51%；在80 ℃下，以對(duì)硝基苯乙酸酯為底物的相對(duì)酶活力為85%，以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物的相對(duì)酶活力為39%。該結(jié)果進(jìn)一步表明，菌株S.malSF-H產(chǎn)生的酯酶的耐溫性對(duì)不同底物有明顯差別。

2.4.4酯酶的最適pH值

分別配制pH值為5.0～10.0的緩沖液(磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH值為5.0～8.0，硼砂-氫氧化鈉緩沖液pH值為9.0～10.0)[17]，測(cè)定不同pH值下的相對(duì)酶活力(以最大值為100%)，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，當(dāng)pH=9.0時(shí)，以對(duì)硝基苯乙酸酯為底物的相對(duì)酶活力最高為100%；當(dāng)pH=8.0時(shí)，以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物的相對(duì)酶活力最高為100%。表明，菌株S.malSF-H產(chǎn)生的酯酶以對(duì)硝基苯乙酸酯、對(duì)硝基苯丁酸酯為底物時(shí)的最適反應(yīng)pH值分別為9.0、8.0。

2.4.5pH值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

將酶液室溫下分別置于不同pH值(5.0～10.0)的緩沖液中作用2 h后，恢復(fù)到正常條件下測(cè)定相對(duì)酶活力(以最高值為100%)，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖7　pH值對(duì)酯酶活力的影響

圖8　pH值對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響

由圖8可知，以對(duì)硝基苯乙酸酯為底物時(shí)，在pH=8.0時(shí)，相對(duì)酶活力最高為100%，穩(wěn)定性最好，在pH值為9.0～10.0時(shí)，相對(duì)酶活力在75%以上，在pH<8.0之后相對(duì)酶活力明顯下降，在pH≤7.0之后，相對(duì)酶活力低于75%；在以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物時(shí)，相對(duì)酶活力隨pH值的增大而升高，在pH=10.0時(shí)相對(duì)酶活力最高100%。說(shuō)明該酯酶有較好的耐堿性，在堿性條件下酶活力更高[18-20]。

2.4.6酯酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性

酶液分別與99%正丁醇、99%乙醇、50%乙醇以1∶2(體積比，下同)混合，混合后實(shí)際有機(jī)溶劑含量分別為66%正丁醇、66%乙醇、33%乙醇。穩(wěn)定2 h后，在37 ℃水浴、pH=8.0的條件下測(cè)定相對(duì)酶活力(以酶液與水1∶2混合液作對(duì)照為100%)，結(jié)果見(jiàn)圖9。

由圖9可知，在加入有機(jī)溶劑后，2種底物的相對(duì)酶活力均明顯降低，在66%正丁醇、66%乙醇條件下，相對(duì)酶活力只有約60%，而且在有機(jī)溶劑中2種底物表現(xiàn)基本一致。但總的說(shuō)來(lái)，該酯酶具有較強(qiáng)的有機(jī)溶劑耐受性。

3結(jié)論

從土壤中分離到一株酯酶產(chǎn)生菌，經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定，屬于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，命名為S.malSF-H。該菌培養(yǎng)基中加入5 g·L-1塑化劑檸檬酸三正丁酯，可以有效誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)生酯酶，SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后胞外酶蛋白明顯增多，且存在對(duì)短鏈脂肪酸酯的底物特異性和差異性。以對(duì)硝基苯乙酸酯為底物時(shí)，酶液表現(xiàn)出良好的耐溫性，最適溫度為80 ℃，且70 ℃保溫2 h的相對(duì)酶活力為95%，最適pH值為9.0，在pH值為8.0時(shí)穩(wěn)定性最好；以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物時(shí)，酶的最適溫度為70 ℃，70 ℃保溫2 h的相對(duì)酶活力為51%，最適pH值為8.0，在pH值為8.0～10.0時(shí)穩(wěn)定性最好。所產(chǎn)酯酶在不同有機(jī)溶劑中的耐受性基本一致，在66%丁醇和66%乙醇中相對(duì)酶活力均約為60%。但總的說(shuō)來(lái)，該菌產(chǎn)生的酯酶都有較高的耐溫性和耐有機(jī)溶劑性，為今后在檸檬酸酯類(lèi)塑化劑合成的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖9　酯酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性

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Isolation and Identification of An Esterase-Producing Strainand Its Enzymatic Properties

DUAN Li,ZHAO Yi,WANG Chong-hui,WANG Li-li

(CollegeofBioscience&Bioengineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang050018,China)

Abstract：An esterase-producing strain was isolated from the soil.It was identified as Stenotrophomonas maltophilia by 16S rDNA sequence analysis and named as S.mal SF-H.The inductive effects of esterase producing and the enzymatic properties of the strain were studied.Results showed that adding 5 g·L-1tributyl citrate(TBC) to the medium could effectively induce the strain to produce esterases.The esterases had significant substrate specificity and diversity on hydrolytic activity among short-chain aliphatic esters.When using p-nitrophenyl acetate as a substrate,S.mal SF-H exhibited great temperature tolerance.The optimum temperature was 80 ℃,and the relative enzyme activity was 95% after water bath at 70 ℃ for 2 h,the optimum pH value was 9.0,and enzyme stability was the best at pH=8.0.When using p-nitrophenyl butyrate as a substrate,the optimum temperature was 70 ℃,and the relative enzyme activity was 51% after water bath at 70 ℃ for 2 h,the optimum pH value was 8.0,and enzyme stability was the best at pH=8.0～10.0.However,the solvent resistance for all esterases were similar,the relative enzyme activities were about 60% in 66% butanol or 66% ethanol solvents.

Keywords：esterase;tributyl citrate;16S rDNA;Stenotrophomonas maltophilia

基金項(xiàng)目：國(guó)家863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014AA022102)

收稿日期：2016-01-13

作者簡(jiǎn)介：段俐(1990-)，女，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向：工業(yè)微生物及其應(yīng)用，E-mail:byzzywyfwz2426@163.com；通訊作者：王麗麗，教授，E-mail：88632wanglili@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.05.005

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 556

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)05-0020-06