應(yīng)用新型LAMP檢測(cè)技術(shù)診斷犬副流感病毒感染

秦海斌　溫 海

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應(yīng)用新型LAMP檢測(cè)技術(shù)診斷犬副流感病毒感染

秦海斌溫 海

注：本項(xiàng)目系公安部應(yīng)用創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2007YYCXNJJQS161）及公安部技術(shù)交流培訓(xùn)計(jì)劃項(xiàng)目

犬傳染性呼吸系統(tǒng)疾病，即“犬窩咳”是由多種細(xì)菌、病毒引起的，以發(fā)熱、咳嗽、流涕及呼吸困難等為臨床特征的犬類呼吸道感染性疾病，其中犬副流感病毒CPIV是主要致病微生物之一。CPIV屬于副粘病毒科副粘病毒屬，為單鏈不分節(jié)的負(fù)鏈 RNA 病毒，編碼8 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。迄今為止，CPIV感染已波及全世界，在我國(guó)亦出現(xiàn)了普遍流行的趨勢(shì)，病毒可廣泛感染伴侶犬、實(shí)驗(yàn)犬和軍警犬，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、流涕和咳嗽，也可引起急性腦脊髓炎和腦內(nèi)積水，臨床表現(xiàn)為后驅(qū)麻痹和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀，不僅嚴(yán)重危害犬類的健康生長(zhǎng)，在軍犬和警犬中還能導(dǎo)致嗅覺障礙。

CPIV的病原學(xué)診斷以病毒分離、免疫熒光、血清學(xué)診斷、血凝/血凝抑制試驗(yàn)、RT-PCR、膠體金快速檢測(cè)試紙條等方法為主，上述方法在靈敏度、準(zhǔn)確性、特異性、時(shí)效性上存在一定缺陷，臨床診斷中仍缺乏一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的診斷方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，在恒溫條件下40～60min即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，與其他的檢測(cè)技術(shù)相比，具有靈敏、特異、穩(wěn)定、方便快捷、不需要特殊設(shè)備、結(jié)果判斷直觀的特點(diǎn)。本文利用LAMP檢測(cè)技術(shù)，建立了快速檢測(cè)CPIV病毒的LAMP檢測(cè)方法，并采集了2015年“犬窩咳”流行期間的發(fā)病犬鼻拭子25份，對(duì)LAMP檢測(cè)方法的臨床診斷性能進(jìn)行了初步應(yīng)用和評(píng)價(jià)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

一、 LAMP檢測(cè)方法的建立

表1　CPIV-LAPM引物名稱及序列

（二）RNA模板的制備：以本實(shí)驗(yàn)室保存CPIV細(xì)胞培養(yǎng)物為陽性對(duì)照，對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，RNA采用TaKaRa RNA提取試劑盒進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)提取。

（三）LAMP檢測(cè)體系：LAMP反應(yīng)總體積25 μL，5μL引物（1 μmol/L的F3，1 μmol/L的B3，8 μmol/L的FIP，8 μmol/L的BIP，4 μmol/L的LB，上述引物各1μL）、2.5 μL 10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、4.0 μL 5.0 mmol/L Betaine、4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs mixture、1μL （8 U） Bst DNA polymerise、1μL AMV（5 U/μL），5μL RNA模板，ddH2O補(bǔ)足體積到25μL。

（四）反應(yīng)溫度的優(yōu)選：LAMP方法在60℃～65℃范圍內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)高效的擴(kuò)增，本文選擇63℃作為反應(yīng)溫度，在LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)系統(tǒng)LA-320中進(jìn)行擴(kuò)增，通過擴(kuò)增速率曲線、擴(kuò)增產(chǎn)物柱狀圖判定引物及檢測(cè)體系的優(yōu)劣。圖1結(jié)果顯示63℃下的擴(kuò)增的速率曲線良好，25～35min為擴(kuò)增發(fā)生時(shí)間，45min內(nèi)已經(jīng)完成全部擴(kuò)增，因此將反應(yīng)條件優(yōu)選為63℃恒溫?cái)U(kuò)增45min。

圖1 CPIV陽性樣本的LAPM擴(kuò)增速率圖

圖2 CPIV-LAPM特異性鑒定柱1，CPIV GN株；2，CDV GN株；3，CAV GN株；4，CIV NJ株；5，BB-ATCC31124株；6，陰性對(duì)照。

二、LAMP特異性鑒定

針對(duì)“犬窩咳”中的主要致病微生物，提取CPIV GN株、CDV GN株、CAV GN株、CIV NJ株、BBATCC31124株的RNA/DNA，進(jìn)行特異性驗(yàn)證。圖2結(jié)果顯示，本文中建立的LAMP方法除了陽性對(duì)照物CPIV GN株的RNA能夠發(fā)生有效擴(kuò)增外（柱1），對(duì)其他病原無擴(kuò)增（柱2、3、4、5、6均為陰性擴(kuò)增），方法具有良好的特異性。

三、靈敏度驗(yàn)證

提取CPIV GN株的RNA，測(cè)定RNA濃度，然后進(jìn)行10倍倍比稀釋作為樣本系列進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，圖3結(jié)果顯示，RNA稀釋至105倍后仍然能夠擴(kuò)增出條帶，以提取的RNA初始濃度為12.3μg/mL計(jì)算，本方法的檢測(cè)極限為0.62pg，靈敏度高。

四、LAMP結(jié)果可視化效果檢測(cè)

分別以CPIV GN株和蒸餾水作為陽性和陰性對(duì)照，在LAMP體系中按照1∶100的比例向LAMP反應(yīng)管中加入SYBR Green I，擴(kuò)增完成后在紫外照光下觀察本方法的目視化效果。圖4顯示陽性擴(kuò)增產(chǎn)物可發(fā)出綠色熒光，陰性對(duì)照不發(fā)出熒光，證明本方法具備良好的目視化檢測(cè)能力。

五、與RT-PCR診斷方法的比較和應(yīng)用

以CPIV GN株和蒸餾水作為陽性和陰性對(duì)照，對(duì)25份臨床病料應(yīng)用LAMP、RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者的符合率和檢出率的高低，表2顯示，兩種方法的陽性、陰性符合率分別為81.8%、87.5%，LAMP方法在25分樣本中檢測(cè)出11份陽性樣本，比RT-PCR具備更高的檢出率。

圖3 CPIV-LAPM靈敏度鑒定1-8為CPIV GN株RNA由100稀釋至10-7。

圖4 CPIV-LAPM目視化檢測(cè)效果鑒定1、2為CPIV GN株；3、4為蒸餾水陰性對(duì)照。

表2　CPIV-LAPM與RT-PCR診斷效果比較

六、討論

CPIV是引起犬上呼吸道感染和腦脊髓炎的主要病原，在自然條件下，CPIV常與支氣管鮑特桿菌（BB）、2型腺病毒（CAV-Ⅱ）、犬瘟熱病毒（CDV）、犬流感病毒（CIV）等混合感染，引起犬上呼吸道感染和嗅覺上皮損傷，對(duì)犬的健康和嗅探作業(yè)造成巨大障礙，但目前臨床診斷中仍缺乏CPIV病毒與其他窩咳病病原的快速有效的鑒別方法?；诖艘?，本文利用LAMP技術(shù)建立了CPIV病毒的LAMP快速診斷方法，方法能在45min內(nèi)判定結(jié)果，對(duì)窩咳病的其他病原無非特異性擴(kuò)增，檢測(cè)下限為0.62pg RNA，能夠在水浴鍋中完成擴(kuò)增，通過目視就能判定結(jié)果?？傮w上具備了快速、特異、靈敏、不依賴貴重設(shè)備、適于臨床檢測(cè)的基本特點(diǎn)，在初步的臨床應(yīng)用中與RT-PCR相比展現(xiàn)出了更好的檢測(cè)效果。本文建立了一種具備良好檢測(cè)效果的CPIV病毒LAMP診斷方法，對(duì)犬窩咳病的防控具有重要意義，具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

（作者單位：公安部南京警犬研究所，210012）

（編輯：李冰）

（一）引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中登錄的CPIVNP基因序列，在NP基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)5條LAMP引物（見表1），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。