應(yīng)用比色法檢測(cè)枯草芽孢桿菌變異菌株中1-脫氧野尻霉素含量

龍玲 楊艷 朱乃碩

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 微生物與分子免疫學(xué)研究室，上海 200438）

應(yīng)用比色法檢測(cè)枯草芽孢桿菌變異菌株中1-脫氧野尻霉素含量

龍玲 楊艷 朱乃碩

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 微生物與分子免疫學(xué)研究室，上海 200438）

為尋找測(cè)定枯草芽孢桿菌黑色變種突變株Bacillus subtilis var. niger-231（B-231）的發(fā)酵液中1-脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）的新方法并提高其產(chǎn)發(fā)酵液中DNJ的含量。在有銅離子的存在下，DNJ與二硫化碳反應(yīng)，用有機(jī)溶劑對(duì)產(chǎn)物萃取后在440 nm進(jìn)行光度測(cè)定，得到DNJ含量。再采用紫外誘變方法處理突變株B-231。繪制了檢測(cè)DNJ標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)測(cè)定DNJ的新方法做了精密度、靈敏度、準(zhǔn)確度以及產(chǎn)物的穩(wěn)定性的探討，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化了反應(yīng)條件，并將此方法運(yùn)用到細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ含量的測(cè)定中，通過(guò)遺傳誘變手段處理原始細(xì)菌B-231，最終篩選到一株高產(chǎn)DNJ的菌株，命名為B. subtilis var. niger- 431（B-431），DNJ含量達(dá)87.3 mg/L，其產(chǎn)生DNJ的量較原始菌株原突變株提高了4.2倍。首次提出了一種快速測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵液中的1-脫氧野尻霉素的新方法，紫外誘變手段使細(xì)菌產(chǎn)生DNJ的能力有較大提高。

枯草芽孢桿菌；1-脫氧野尻霉素；α-糖苷酶抑制劑；紫外誘變

1-脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）通過(guò)抑制α-糖苷酶活力和小腸刷狀緣對(duì)葡萄糖的吸收來(lái)改善糖尿病狀況［1，2］。進(jìn)而改善餐后高血糖和胰島素敏感［2］。DNJ是一種小分子生物堿，其結(jié)構(gòu)和葡萄糖十分相似，是葡萄糖分子六元環(huán)上面的氧原子被氮原子取代，且1號(hào)碳原子連接的氧原子被脫去而成。從桑樹(shù)的根部和葉子提取到［3］，一些芽孢桿菌和鏈霉菌也可以產(chǎn)生DNJ［2，4，5］，Kim 等［6］2011年報(bào)道從Chungkookjang（快速發(fā)酵豆醬，韓國(guó)的一種傳統(tǒng)食品）分離出產(chǎn)強(qiáng)的α-糖苷酶抑制劑菌株B. subtilis B2，后者的結(jié)構(gòu)分析表明，它和在植物中提取到的DNJ結(jié)構(gòu)一樣［7，8］。由于DNJ的抑制糖苷酶活力的作用，其在治療糖尿?。?］，同時(shí)在艾滋病感染［10］和心血管疾?。?1］方面有潛在作用和應(yīng)用前景。然而，受其來(lái)源限制，桑葉中DNJ含量低且提取工藝復(fù)雜，而化學(xué)合成方法不很成熟且無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)［12］，因此，應(yīng)用微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)DNJ就顯得更加經(jīng)濟(jì)有效。

如前所述，一些芽孢桿菌和鏈霉菌可以產(chǎn)生DNJ。然而這些細(xì)菌是從石油中分離到的，要想把它們應(yīng)用到食品工業(yè)十分困難。Zhu等［13］報(bào)道了首次從發(fā)酵食品即豆渣分離到的枯草芽孢桿菌B. subtilis B2可以產(chǎn)生DNJ。用B. subtilis B2發(fā)酵的豆渣可能被用來(lái)生產(chǎn)食物來(lái)源的DNJ產(chǎn)品，可作為功能食品供糖尿病患者食用。然而，在凍干的發(fā)酵培養(yǎng)基中DNJ的含量?jī)H為0.7 mg/g，和桑葉中的DNJ含量相當(dāng)［14］。

目前，DNJ的檢測(cè)方法有對(duì)硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法（PNPG）、反向高效液相色譜法（RP-HPLC）等。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用了一種新的方法，在有銅離子存在下，仲胺與二硫化碳反應(yīng)，生成有顏色的二烷基二硫代氨基酸銅［15，16］。DNJ與二硫化碳的反應(yīng)式如下：

生產(chǎn)的黃色銅絡(luò)合物可用有機(jī)溶劑萃取后，進(jìn)行光度測(cè)定。

紫外線誘變用于微生物育種的誘變處理有著悠久的歷史［17］。因此本研究采用簡(jiǎn)單的紫外線誘變手段來(lái)選育產(chǎn)DNJ的高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海博彩生物科技有限公司），搖床（上海博彩生物科技有限公司），低溫冷凍離心濃縮儀（上海和杰科技有限公司），通風(fēng)櫥（Hamilton Scientific），熒光多功能酶標(biāo)儀Spectrum M5（Molecular Devices）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 1-脫氧野尻霉素（上海世峰生物科技有限公司），二硫化碳、無(wú)水乙醇、吡啶、七水硫酸銅（試劑均為分析純），LB培養(yǎng)基（Sigma）。Bacillus subtilis var. niger-231（以下簡(jiǎn)稱B-231）為本室篩選并保藏的產(chǎn)DNJ突變株［18］。

1.2 方法

1.2.1 DNJ標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定方法 用移液器吸取試液100 μL至1.5 mL EP管中，加入二硫化碳200 μL，無(wú)水乙醇200 μL，吡啶20 μL和對(duì)應(yīng)量的硫酸銅溶液，充分振蕩后靜置分層，取上層有色液于另一干凈的1.5 mL EP管中，吸取100 μL至96孔板中，每份試樣做3個(gè)重復(fù)，在440 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。取去離子水100 μL 至1.5 mL EP管中，按上述操作設(shè)定空白對(duì)照。

1.2.2 測(cè)定DNJ標(biāo)準(zhǔn)品的最佳條件探索 實(shí)驗(yàn)試劑的種類、用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生諸多影響，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了不同的醇類（乙醇、異丙醇、異戊醇）和不同用量、不同的CuSO4濃度、吡啶不同加入量，以檢測(cè)這些條件對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。為減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)及確定各因子對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響程度我們?cè)O(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，按照四因素三水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（表1）。

表1 正交試驗(yàn)L9（34）正交表頭

1.2.3 紫外誘變方法處理 挑取在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d的單克隆B-231接種到盛有50 mL液體LB培養(yǎng)基的250 mL的三角燒瓶中，37℃、150 r/min培養(yǎng)60 h，在6 500 r/min 4℃下離心3 min，棄上清，沉淀用0.9%生理鹽水洗滌3次，最后用生理鹽水制成約106CFU/mL的菌懸液原液。將原液用生理鹽水按10-6、10-5和10-4三個(gè)稀釋度稀釋，每個(gè)稀釋度取5 mL菌懸液于直徑為9 cm培養(yǎng)皿中，置15 W紫外燈30 cm處分別照射1 min、2 min、3 min、5 min、8 min。設(shè)未經(jīng)紫外照射的菌液為對(duì)照組，各取0.1 mL菌液均勻涂布在LB平板上。

1.2.4 細(xì)菌發(fā)酵及發(fā)酵液的預(yù)處理 將LB平板上經(jīng)過(guò)紫外誘變處理和對(duì)照組生長(zhǎng)良好的單菌落用接種環(huán)轉(zhuǎn)接至含有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，在30℃，150 r/min條件下培養(yǎng)60 h。取細(xì)菌發(fā)酵液1 mL，10 000 r/min離心3 min，保留上清液。取上清800 μL至1.5 mL EP管中，用低溫冷凍離心濃縮儀濃縮凍干，5 h后加200 μL去離子水溶解制備成細(xì)菌發(fā)酵濃縮液，備用。

1.2.5 突變DNJ高產(chǎn)菌株篩選 用移液器吸取濃縮菌液100 μL至1.5 mL EP管中，按1.2.1方法，每份試樣做3個(gè)重復(fù)，測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵濃縮液中DNJ的含量。同時(shí)設(shè)定LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。篩選出DNJ高產(chǎn)突變菌株。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取5 mg/mL 1-脫氧野尻霉素1 mL，以去離子水稀釋成0.0625 mg/mL，0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL，1.0 mg/mL的1-脫氧野尻霉素溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果（圖1）顯示，在一定范圍內(nèi)，DNJ濃度與OD值之間呈較好的線性關(guān)系，符合直線回歸方程：y = 1.2254x + 0.22，R2= 0.9961。

圖1 DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度

取0.16 mg/mL 1-脫氧野尻霉素溶液平行測(cè)定5次，結(jié)果如圖2 所示，DNJ溶液在440 nm處有強(qiáng)的吸收峰，對(duì)應(yīng)的吸光度OD值分別為：0.459 6，0.486 1，0.475 2，0.475 1和0.430 7，5次測(cè)定DNJ溶液吸光度的平均值為0.345 5，計(jì)算出5次測(cè)定的偏差分別是：-0.0057，0.020 8，0.009 9，0.009 8和-0.034 6。平均偏差d =0.016 2。

圖2 平行測(cè)定DNJ溶液在440 nm處吸收峰

2.3 靈敏度

對(duì)濃度為0.031 2 mg/mL和0.015 6 mg/mL的1-脫氧野尻霉素溶液進(jìn)行同上測(cè)定，得到吸光度分別為0.172 2和0.278 3。結(jié)果顯示，本法檢測(cè)DNJ標(biāo)準(zhǔn)品含量的最低檢測(cè)限為0.015 6 mg/mL，靈敏度為0.015 6 mg/mL。

2.4 回收實(shí)驗(yàn)（準(zhǔn)確度）

取0.125 mg/mL的1-脫氧野尻霉素溶液100 μL三份，按0.8，1.0，1.2倍DNJ量加入5 mg/mL的1-脫氧野尻霉素2.0 μL，2.5 μL，3.0 μL，每份做3個(gè)重復(fù)，共測(cè)定9次。測(cè)得回收率分別為108.5%、109.2%和109.8%。

2.5 穩(wěn)定性

取濃度為1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL和0.125 mg/mL，0.062 5 mg/mL的1-脫氧野尻霉素溶液按1.2.1的測(cè)定方法，在90 min內(nèi)，波長(zhǎng)440 nm處每隔10 min測(cè)一次吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖3。從上往下曲線依次對(duì)應(yīng)濃度為1.0 mg/mL，0.5 mg/mL，0.25 mg/mL，0.125 mg/mL，0.062 5 mg/mL，在90 min內(nèi)，隨著DNJ溶液濃度的提高，產(chǎn)物的OD值隨時(shí)間變化而降低得更快。

圖3 90 min內(nèi)DNJ溶液的吸光度變化

2.6 測(cè)定DNJ標(biāo)準(zhǔn)品的最佳條件

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，根據(jù)正交試驗(yàn)原理，極差越大，說(shuō)明該因子對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響越大。因此本次試驗(yàn)中，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響大?。捍碱?> CuSO4濃度 >醇加入量 > 吡啶加入量；K值越大，對(duì)應(yīng)因子的水平越好，因此本次實(shí)驗(yàn)最優(yōu)水平也即本法最有反應(yīng)條件為：乙醇，200 μL，CuSO4濃度0.03 mol/L，吡啶20 μL。

2.7 紫外誘變結(jié)果

菌懸液稀釋度為10-4的平板在誘變0 min、1 min、2 min、3 min、5 min及8 min后平均菌落數(shù)分別為131、89、44、18，3和1；菌懸液稀釋度為10-5的平板在誘變0 min、1 min、2 min、3 min、5 min及8 min后菌落數(shù)分別為28、15、6、4、1和0；菌懸液稀釋度為10-6的平板在誘變0 min、1 min、2 min、3 min、5 min和8 min后菌落數(shù)分別為6、2、0、1、0和0。菌落數(shù)在4個(gè)及以上時(shí)，隨機(jī)挑取4個(gè)單克隆液體發(fā)酵，菌落數(shù)小于4的則全部轉(zhuǎn)接至液體LB發(fā)酵。

2.8 應(yīng)用比色法測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵液中的DNJ含量

在發(fā)酵36 h、48 h和60 h之后，測(cè)得菌株B-231發(fā)酵液中的DNJ產(chǎn)量分別為17.6 μg/mL，20.4 μg/mL和33.8 μg/mL；測(cè)得誘變菌株發(fā)酵液中DNJ含量，發(fā)現(xiàn)其中有一株突變菌發(fā)酵液中DNJ含量特別高，在發(fā)酵36 h、48 h和60 h其發(fā)酵液中DNJ含量分別為48.7 μg/mL，55.6 μg/mL和87.3 μg/mL，該菌株編號(hào)為B. subtilis var. niger- 431（以下簡(jiǎn)稱B-431）。結(jié)果如表3所示。其余菌株誘變后其發(fā)酵液中DNJ含量沒(méi)有顯著提高（數(shù)據(jù)未附上）。

表3 誘變前后細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ含量

2.9 和RT-HPLC法測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ含量的比較

參照Kim等［19］柱前衍生化反向高效液相色譜法，取細(xì)菌發(fā)酵液20 μL至1.5 mL EP管，加入5 mmol/L FMOC-Cl 40 μL，再加入0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH8.5）50 μL，充分混勻后25℃反應(yīng)25 min，加入890 μL 0.1%乙酸，0.22 μm針濾，取10 μL上樣，測(cè)得B-431發(fā)酵60 h后DNJ含量為73.2 μg/mL。如圖4，F(xiàn)MOC-DNJ的出峰時(shí)間為第8.053-8.073 min。

3 討論

應(yīng)用比色法測(cè)定1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果在一定濃度范圍內(nèi)取得良好線性關(guān)系，擬合優(yōu)度R2= 0.996 1；5次平行測(cè)定平均偏差為0.878%，結(jié)果顯示出很好的重復(fù)性；加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)所得回收率在50%以上，準(zhǔn)確度良好；該方法檢測(cè)下限達(dá)到15.625 μg/mL DNJ水溶液；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，在半個(gè)小時(shí)內(nèi)完成對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè)，結(jié)果可行度比較高。本法靈敏度、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便快速，而PNPG法采用大鼠的腸黏膜α-糖苷酶作為催化劑，利用DNJ對(duì)α-糖苷酶的抑制作用從而間接得出DNJ含量。由于酶活性易受較多因素影響，如溫度、pH、各種離子濃度、抑制劑或活化劑、同源分子的干擾等，此法對(duì)測(cè)定結(jié)果帶來(lái)一定的誤差，且重復(fù)性較差［19］。RP-HPLC法中的衍生化反應(yīng)程度不易控制，硼酸鉀緩沖液的pH對(duì)衍生產(chǎn)物結(jié)果影響較大，衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定易降解［20］，并且檢測(cè)需要高效液相色譜儀器，檢測(cè)成本高。本研究采用的比色法檢測(cè)細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ的含量具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，與反向高效液相色譜法相比較，本法所測(cè)的細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ含量稍微偏高，這可能與細(xì)菌培養(yǎng)液中含有較多的氨基酸有關(guān)，后者帶來(lái)一定的系統(tǒng)誤差?？傮w來(lái)說(shuō)兩種方法測(cè)定結(jié)果比較接近，而在操作上RTHPLC更加繁瑣且成本更高。因此本法更適于測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ含量。由于本方法尚屬于初步建立，在實(shí)際應(yīng)用中可能存在各種干擾因素，目前僅用于測(cè)定高純度DNJ和細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ含量，后續(xù)工作中，我們正在實(shí)際應(yīng)用于其他樣品中以了解其各種干擾因素和可行性，目前正在試圖用該方法測(cè)定桑樹(shù)葉中的DNJ含量以證明該方法的普適性。

紫外線誘變育種的原理是，通過(guò)紫外線照射使DNA雙鏈之間或同一條鏈上的兩個(gè)相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，并阻礙雙鏈的分開(kāi)、復(fù)制和堿基的正常配對(duì)，從而引起基因突變，最終導(dǎo)致微生物表形變化，紫外誘變是一種最常用的物理誘變因素，它經(jīng)常被用于微生物育種。 因此本文采用紫外誘變來(lái)選育產(chǎn)DNJ高產(chǎn)菌株。通過(guò)紫外光照射處理細(xì)菌B-231，最終篩選到一株高產(chǎn)DNJ的菌株，命名為B-431，其產(chǎn)生DNJ的量較原始菌株B-231提高了4.2倍，DNJ含量達(dá)87.3 mg/L，比Zhu等［13］31 mg/L的DNJ含量也有了很大提高。最佳發(fā)酵時(shí)間為60 h，這與Zhu等［21］的最佳發(fā)酵時(shí)間66 h結(jié)論較為一致。

圖4 RT-HPLC法測(cè)定B-431發(fā)酵液DNJ

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用比色法測(cè)定1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果在一定濃度范圍內(nèi)取得良好線性關(guān)系，采用遺傳誘變手段來(lái)處理枯草芽孢桿菌，使其DNJ產(chǎn)量達(dá)87.3 mg/L，較原始菌株原突變株提高了4.2倍。

［1］ Kwon HJ, Chung JY, Kim JY, et al. Comparison of 1-Deoxynojirimycin and aqueous mulberry leaf extract with emphasis on postprandial hypoglycemic effects：in vivo and in vitro studies.［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59（7SI）：3014-3019.

［2］ Lee S. 1-Deoxynojirimycin isolated from a Bacillus subtilis stimulates adiponectin and GLUT4 expressions in 3T3-L1 adipocytes. ［J］. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 23（5）：637-643.

［3］ He H, Lu YH. Comparison of inhibitory activities and mechanisms of five mulberry plant bioactive components against alpha-glucosidase.［J］. J Agric Food Chem, 2013, 61（34）：8110-8119.

［4］ Niwa T, Tsuruoka T, Goi H, et al. Novel glycosidase inhibitors, nojirimycin-b and d-mannonic-delta-lactam - isolation, structure determination and biological property［J］. Journal of Antibiotics, 1984, 37（12）：1579-1586.

［5］ Onose S, Ikeda R, Nakagawa K, et al. Production of the α-glycosidase inhibitor 1-deoxynojirimycin from Bacillus species. ［J］. Food Chemistry, 2013, 138（1）：516-523.

［6］ Kim HS, Lee JY, Hwang KY, et al. Isolation and identification of a Bacillus sp producing alpha-glucosidase inhibitor 1-deoxynojirimycin. ［J］. Korean Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 39（1）：49-55.

［7］ Nakagawa K, Kubota H, Kimura T, et al. Occurrence of orally administered mulberry 1-deoxynojirimycin in rat plasma［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55（22）：8928-8933.

［8］ Shibano M, Fujimoto Y, Kushino K, et al. Biosynthesis of 1-deoxynojirimycin in commelina communis：a difference between the microorganisms and plants［J］. Phytochemistry, 2004, 65（19）：2661-2665.

［9］ Asano N, Oseki K, Tomioka E, et al. N-containing sugars from morus-alba and their glycosidase inhibitory activities［J］. Carbohydrate Research, 1994, 259（2）：243-255.

［10］ Gruters RA, Neefjes JJ, Tersmette M, et al. Interference with HIV-induced syncytium formation and viral infectivity by inhibitors of trimming glucosidase［J］. Nature, 1987, 330（6143）：74-77.

［11］ Butters TD, Dwek RA, Platt FM. Therapeutic applications of imino sugars in lysosomal storage disorders［J］. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2003, 3（5）：561-574.

［12］ Kang KD, Cho YS, Song JH, et al. Identification of the genes involved in 1-deoxynojirimycin synthesis in Bacillus subtilis MORI 3K-85［J］. Journal of Microbiology, 2011, 49（3）：431-440.

［13］ Zhu YP, Yamaki K, Yoshihashi T, et al. Purification and identification of 1-Deoxynojirimycin（DNJ）in Okara fermented by Bacillus subtilis B2 from Chinese traditional food（Meitaoza）［J］. Journal of Agricultural and Food Fhemistry, 2010, 58（7）：4097-4103.

［14］ Kimura T, Nakagawa K, Kubota H, et al. Food-grade Mulberry powder enriched with 1-Deoxynojirimycin suppresses the elevation of postprandial blood glucose in humans［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55（14）：5869-5874.

［15］ 張志賢.實(shí)用有機(jī)定量分析［M］. 上海, 上?？萍汲霭嫔纾?965.

［16］ 張志賢, 張瑞鎬.有機(jī)官能團(tuán)定量分析［M］. 北京, 化學(xué)工業(yè)出版社：1990.

［17］ 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］. 北京, 高等教育出版社：2006.

［18］ 白豆, 龍玲, 朱乃碩. 一株1-脫氧野尻霉素(DNJ)枯草芽孢桿菌黑色變種的誘變育種研究［J］. 復(fù)旦學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2006（1）：104-111.

［19］ Yamaki K. and Mori Y. Evaluation of a-glucosidase inhibitory activity in colored foods：a trial using slope factors of regression curves［J］. Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology-Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2006, 53（4）：229-231.

［20］ Kim JW, Kim SU, Lee HS, et al. Determination of 1-deoxynojirimycin in Morus alba L. leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography［J］. Journal of Chromatography a, 2003, 1002（1-2）：93-99.

［21］ Zhu YP, Li XT, Teng C, et al. Enhanced production of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtilis B2 using response surface methodology［J］. Food and Bioproducts Processing, 2013, 91（3）：264-270.

（責(zé)任編輯 李楠）

Colorimetric Method in the Determination of 1-Deoxynojirimycin Isolated from the Mutant Strain of Bacillus subtilis

LONG Ling YANG Yan ZHU Nai-shuo
（Laboratory of Microbiology and Molecular Immunology，State Key Laboratory of Genetic Engineering，School of Life Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200438）

This work is to seek a novel method to detect 1-Deoxynojirimycin（DNJ）in the culture broth of Bacillus subtilis var. niger-231（B-231）and to improve DNJ production. DNJ reacts rapidly with carbon disulfide while Cu2+existing，and the final product extracted by organic solvent was measured by spectrophotometer at 440 nm，thus DNJ content was determined. Then mutant strain B-231 was induced with ultraviolet. The standard curve for measuring standard DNJ was drawn，and the precision，sensitivity，accuracy and stability of the products while using the novel method of measuring DNJ were studied. Orthogonal test was designed to obtain the optimal reaction condition. The novel method was applied to measure the content of DNJ in the culture broth of bacteria. A high-yield DNJ strain was screened and named as B. subtilis var. niger- 431（B-431）by mutagenizing the B-231. The content of DNJ by B-431 was up to 87.3 mg/mL，and increased 4.2 times compared to B-231. This study established a novel method to determine 1-deoxynojirimycin in the culture broth of DNJ-producing strain for the first time. The induction by ultraviolet increased the capacity of this bacterium producing DNJ.

Bacillus subtilis；1-deoxynojirimycin；α-glucosidase inhibitor；ultraviolet mutation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.027

2015-05-22

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX10002006-002-003），上海市科委科學(xué)基金項(xiàng)目（13431900602）

龍玲，女，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：13210700143@fudan.edu.cn

朱乃碩，男，教授，研究方向：微生物感染與分子免疫；E-mail：nzhu@fudan.edu.cn