基于psbA基因的噬藻體遺傳多樣性研究進(jìn)展

李　樾，劉婷婷，劉　麗，夏雪山

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明　650500)

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基于psbA基因的噬藻體遺傳多樣性研究進(jìn)展

李樾，劉婷婷，劉麗①，夏雪山

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650500)

摘要：噬藻體作為一類感染藍(lán)藻的特異性病毒，廣泛分布于不同水生態(tài)系統(tǒng)中。隨著水體富營養(yǎng)化的加劇，藍(lán)藻水華頻繁爆發(fā)，具有潛在控藻能力的生物因子——噬藻體的研究備受關(guān)注。目前對于噬藻體的研究主要集中在其分離純化及生物學(xué)特性等，因缺乏廣泛通用的分子標(biāo)記致使其遺傳多樣性研究受限。以編碼光合作用反應(yīng)中心D1蛋白的psbA基因?yàn)榘谢?，綜述了海洋、淡水環(huán)境中噬藻體psbA基因遺傳多樣性的最新研究進(jìn)展，分析了噬藻體在不同自然環(huán)境中的分布及差異，同時(shí)也提出了噬藻體多樣性研究中存在的一些問題。

關(guān)鍵詞：噬藻體；psbA基因；遺傳多樣性

藍(lán)藻又名藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria),是一類能夠進(jìn)行光合作用的自養(yǎng)型原核生物[1]。噬藻體(cyanophage) 是一類能夠?qū)Ｒ恍愿腥舅{(lán)藻的雙鏈DNA病毒,是水體中最為豐富的一類浮游病毒,廣泛分布于不同水生環(huán)境中。國際病毒學(xué)分類委員會(huì)(ICTV)細(xì)菌病毒分類會(huì)參照噬菌體的分類方式,根據(jù)噬藻體形態(tài)不同將其分為3個(gè)科[2]:肌病毒科(Myoviridae)有一個(gè)中央管和一條具有伸縮能力的尾巴;長尾病毒科(Styloviridae)具有一條長的、不能收縮的尾巴;短尾病毒科(Podoviridae)含有一條短尾。作為水生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成因子,噬藻體與宿主藍(lán)藻的新陳代謝和生命循環(huán)有密切的聯(lián)系,噬藻體通過裂解宿主影響水中微生物及浮游植物群落結(jié)構(gòu)和多樣性,對調(diào)節(jié)藍(lán)藻種群豐度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)演替、介導(dǎo)基因水平轉(zhuǎn)移等起著重要作用。此外,噬藻體是一類具有種屬特異性的藍(lán)藻致死因子,在防治藍(lán)藻水華上潛力巨大,被認(rèn)為是一種具有潛在控藻能力的生物因子而引起廣泛關(guān)注。對于噬藻體的研究,目前多集中在噬藻體的分離純化及其生理生化等生物學(xué)特性上,其遺傳多樣性的研究較少,主要原因在于不同形態(tài)的噬藻體之間差異性很大,目前尚未發(fā)現(xiàn)其基因中存在類似原核生物16S rDNA和真核生物18S rDNA的共有保守序列,因而缺乏廣泛通用的遺傳標(biāo)記基因用于遺傳多樣性研究[3]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,噬藻體的分離純化及全基因組測序研究發(fā)現(xiàn)部分種的噬藻體中存在個(gè)別的共有保守基因,如G20基因、DNA聚合酶基因、G91基因、光合作用基因psbA等,針對保守基因序列設(shè)計(jì)簡并性引物,采用PCR技術(shù)可直接擴(kuò)增出不同噬藻體基因序列用于遺傳多樣性分析。筆者以能夠編碼光合反應(yīng)中心D1蛋白的psbA基因?yàn)檫z傳標(biāo)記基因,結(jié)合近年來有關(guān)海洋、淡水和稻田中噬藻體psbA基因遺傳多樣性的最新研究進(jìn)展,分析噬藻體的遺傳多樣性,了解噬藻體及其與宿主藍(lán)藻的關(guān)系,從而促進(jìn)其對藍(lán)藻水華的治理。

1噬藻體遺傳多樣性的分子標(biāo)記

自然界中,某一物種的遺傳多樣性具有顯著生態(tài)功能,遺傳多樣性越豐富,其對環(huán)境的適應(yīng)能力和對新環(huán)境的拓展能力也越強(qiáng),在自然環(huán)境中的分布范圍也越廣,而且某一物質(zhì)遺傳變異的大小與其進(jìn)化速率呈正相關(guān)[4]。研究噬藻體的遺傳多樣性有助于分析其進(jìn)化歷程,完善噬藻體的分類,進(jìn)一步深入探討噬藻體間的進(jìn)化關(guān)系、噬藻體與藍(lán)藻間的相互作用關(guān)系,通過測試噬藻體基因組的大小、序列和結(jié)構(gòu),獲得有關(guān)噬藻體遺傳多樣性的更多知識[5]。然而,噬藻體是高度差異性的病毒類群,缺乏廣泛通用的分子標(biāo)記。目前,噬藻體遺傳多樣性常用的靶基因主要有G20基因、DNA聚合酶基因、G91基因和psbA光合作用基因等。

G20基因是編碼噬藻體衣殼組裝蛋白的基因,與T4噬菌體編碼衣殼蛋白的基因同源性很高。來源不同的噬藻體S-PM2、S-BnM1和S-WHM1中均有一段具有高度保守性的序列(G20),可用作噬藻體遺傳多樣性研究的分子標(biāo)記物。到目前為止,依據(jù)G20基因保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物有很多,如:CPS1/CPS2[6]、CPS1/CPS8[7]、CPS1/CPS4[8]、CPS1.1/CPS8.1[9]和CPS4/G20-2[10]等。但使用G20基因作為噬藻體遺傳多樣性的標(biāo)記基因存在一定局限性,一方面,侵染藍(lán)藻的噬藻體廣泛分布在肌尾病毒科、短尾病毒科和長尾病毒科中,而G20基因只存在于肌尾科噬藻體中;再者,G20基因與T4噬菌體編碼衣殼蛋白的基因高度同源,在PCR擴(kuò)增中可能出現(xiàn)假陽性導(dǎo)致最終分析結(jié)果有誤。因此,G20基因主要用于肌尾科噬藻體遺傳多樣性研究。

G91基因是侵染銅綠微囊藻噬藻體編碼衣殼尾鞘蛋白的基因,TAKASHIMA等[11]分離純化了3株感染銅綠微囊藻的噬藻體,并與噬藻體Ma-LMM01的序列對比發(fā)現(xiàn)了G91基因,為噬藻體的多樣性研究拓增了新的方法。隨后YOSHIDA等[12]利用G91基因保守序列設(shè)計(jì)PCR引物,對日本Mikata湖進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻豐度降低而噬藻體豐度增加,并且噬藻體中G91基因只能感染部分銅綠微囊藻群體。G91作為遺傳分子標(biāo)記物主要用于銅綠微囊藻噬藻體的研究。

DNA聚合酶(DNA polymerase)是細(xì)胞復(fù)制DNA的作用酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成。在噬藻體中DNA聚合酶基因主要存在于短尾病毒科中,短尾病毒科噬藻體具有嚴(yán)格宿主專一性和能快速裂解宿主的能力。2009年,CHEN等[13]對比已知的6種海洋短尾科噬藻體的基因序列,發(fā)現(xiàn)這些噬藻體中的DNA聚合酶基因具有一定的保守性,并根據(jù)該基因設(shè)計(jì)出引物,對美國切薩皮克海灣的表層、中層及底層水域中的短尾科噬藻體進(jìn)行持續(xù)2 a夏、冬2季的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),切薩皮克海灣短尾科噬藻體具有豐富的遺傳多樣性,也具有明顯的季節(jié)性變化,其夏季噬藻體的結(jié)構(gòu)組成與冬季有所不同。由于DNA聚合酶主要存在于短尾科噬藻體中,因此將DNA聚合酶作為噬藻體多樣性研究的分子標(biāo)記物同樣存在缺陷。

噬藻體輔助代謝基因(AMGs)是編碼噬藻體的一類特殊功能基因。盡管AMGs基因普遍存在于噬藻體中,但是不同種類的噬藻體所攜帶的AMGs類型具有很大差異。因此將AMGs作為噬藻體分子遺傳標(biāo)記,對不同水域的噬藻體遺傳多樣性的認(rèn)識還存在一些不確定性[14]。

藍(lán)藻進(jìn)行光合作用需要2個(gè)光反應(yīng)系統(tǒng)(PSⅠ和PSⅡ),目前已發(fā)現(xiàn)在噬藻體基因組中存在一系列與宿主藍(lán)藻同源的光合作用基因序列,包括psbA和psbD、petE和F以及hli等[15]。光合作用基因在噬藻體中的廣泛存在,是基于噬藻體與宿主藍(lán)藻基因片段之間、噬藻體基因片段之間的基因水平轉(zhuǎn)移和交換重組[16]。psbA和psbD是編碼光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心蛋白主要成分D1和D2蛋白亞基的基因[17]。petE、F基因則分別編碼光合電子傳遞的質(zhì)體藍(lán)素蛋白和鐵氧化還原蛋白;hli基因編碼高光誘導(dǎo)蛋白HLIPs。一些基因編碼的功能性蛋白,對噬藻體侵染及增殖過程具有重要作用,噬藻體攜帶光合作用基因能夠?yàn)樗拗骷白陨硖峁┕廪D(zhuǎn)化的化學(xué)能,從而增加噬藻體在藍(lán)藻中的適應(yīng)性。LINDELL等[17]研究發(fā)現(xiàn),噬藻體在海洋中廣泛存在,噬藻體在感染海洋藍(lán)藻時(shí)其攜帶的psbA基因編碼的蛋白與宿主蛋白功能相同,對光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能有重要意義。BAILEY等[18]認(rèn)為噬藻體具有保護(hù)宿主避免光抑制的作用,從而使其在侵染宿主藍(lán)藻時(shí)確保增殖過程中能量的供應(yīng)。另外,光合作用基因可使噬藻體在增殖裂解周期內(nèi)基因組產(chǎn)量增加2.5%～4.5%,從而提高噬藻體的裂解量[19]。噬藻體由于攜帶有psbA、psbD光合作用基因,可以擴(kuò)大其宿主范圍,噬藻體基因組中是否攜帶psbA基因與其侵染宿主藍(lán)藻的時(shí)間長短有關(guān)。psbA基因是光合作用系統(tǒng)中重要基因,廣泛存在于肌尾病毒科、短尾病毒科的噬藻體中。

2噬藻體遺傳多樣性靶標(biāo)基因psbA

psbA是編碼光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心(PSⅡ)D1蛋白的基因,廣泛存在于藻類及綠色植物中。許多噬藻體中都包含編碼光合系統(tǒng)Ⅱ中D1 蛋白的psbA基因,88%的感染海洋聚球藻和原綠球藻的噬藻體都含有psbA基因。全球海洋表層水中60%的psbA基因來源于病毒[20]。psbA是噬藻體中非常保守的功能基因,利用psbA基因的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物,通過PCR擴(kuò)增噬藻體的基因序列并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,可用于研究噬藻體的遺傳多樣性[21]。

根據(jù)噬藻體psbA基因擴(kuò)增的引物較多。表1詳細(xì)列舉出歷年來有關(guān)psbA的引物,不同引物擴(kuò)增出的基因片段大小有一定差異。2003年,ZEIDNER等[22]首次根據(jù)噬藻體psbA基因的保守序列設(shè)計(jì)出引物58-VDIDGIREP-66/331-MHERNAHNFP-340。MILLARD等[23]根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求對噬藻體S-PM2越過一個(gè)內(nèi)含子并忽略一個(gè)外顯子,設(shè)計(jì)引物psbA-F/psbA-R可擴(kuò)增800 bp。后來,MILLARD等[24]將引物繼續(xù)改進(jìn)后可擴(kuò)增片段長達(dá)1 080～1 291 bp。SULLIVAN等[16]根據(jù)噬藻體P-SSM2、P-SSM4、P-SSP7、S-PM2、S-WHM1、 Syn5和Syn9的psbA基因保守序列設(shè)計(jì)引物Pro-psbA-1F/Pro-psbA-1R可擴(kuò)增680 bp,確定了psbA基因既存在于噬藻體中,也存在于藍(lán)藻中,為藍(lán)藻與噬藻體光合作用基因的轉(zhuǎn)移研究奠定基礎(chǔ)。WANG等[25]根據(jù)噬藻體psbA基因的保守序列擴(kuò)增出引物psbA-93F/psbA-341R。筆者根據(jù)噬藻體psbA基因設(shè)計(jì)了巢式PCR引物psbA(1)-F/psbA(1)-R和psbA(2)-F/psbA(2)-R,對高原富營養(yǎng)湖泊滇池噬藻體多樣性進(jìn)行研究。

表1研究噬藻體分子標(biāo)記psbA基因的PCR引物

Table 1PCR primers ofpsbAgene as a molecular marker for study of cyanophage diversity

引物序列(5'-3')片段長度/bp參考文獻(xiàn)58-VDIDGIREP-66/331-MHERNAHNFP-340(5'-GTNGAYATHGAYGGNATHMGNGARCC-3')(5'-GGRAARTTRTGNGCRTTNCKYTCRTGC-AT-3')680[22]psbA-F/psbA-R(5'-GTNGAYATHGAYGGNATHMGNGARCC-3')(5'-GGRAARTTRTGNGC-3')800[23]Pro-psbA-1F/Pro-psbA-1R(5'-AACATCATYTCWGGTGCWGT-3')(5'-TCGTGCATTACTTCCATACC-3')680[16]psbA-93F/psbA-341R(5'-TAYCCNATYTGGGAAGC-3')(5'-TCRAGDGGGAARTTRTG-3')745[25]psbA(1)-F/psbA(1)-R(5'-GARTGGYTNTAYAAYGGNG-3')(5'-CCRTTNAGGTTRAANGCCA-3')680psbA(2)-F/psbA(2)-R(5'-CAYTTCTAYCCNATYTGG-3')(5'-TCYNGACTGGTTGAAGTTGA-3')598

由于psbA基因既存在于進(jìn)行光合作用的藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi),也存在于能夠感染藍(lán)藻的噬藻體中。從環(huán)境水樣中利用PCR特異性擴(kuò)增所得的psbA基因序列,其是否為噬藻體來源有必要進(jìn)行探討區(qū)分,即難點(diǎn)在于區(qū)分環(huán)境樣品中獲得的psbA基因是病毒來源還是宿主來源。CHE′NARD 等[26]提出,采集的水樣先分別經(jīng) 0.45和0.22 μm孔徑濾膜過濾以除去藻類宿主等細(xì)胞型生物,濾液通過超濾濃縮,對濃縮液進(jìn)行psbA基因PCR擴(kuò)增前,先用脫氧核糖核酸酶(DNase)處理以除去濃縮水樣中可能含有的游離藍(lán)藻DNA,并用藍(lán)藻16-23S rDNAITS基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性后,再提取濃縮水樣中DNA,以確保所提DNA為病毒DNA;基于噬藻體和宿主的psbA序列的鳥嘌呤和胞嘧啶所占比例(GC含量)分析(如海洋聚球藻噬藻體GC含量為46%～51%,低于其宿主的56%～62%；淡水噬藻體GC含量低于其宿主的46%);基于編碼D1 蛋白的氨基酸三聯(lián)體模型 R/KETTXXXSQ/H分析：SHARON等[20]通過統(tǒng)計(jì)并分析全球海洋樣品(global ocean sampling,GOS)宏基因組數(shù)據(jù)庫的psbA基因序列,發(fā)現(xiàn)psbA基因編碼的D1蛋白中普遍存在氨基酸三聯(lián)體模型R/KETTXXXSQ/H,氨基酸三聯(lián)體XXX的變化可以反映出不同噬藻體所處的分類地位,其中ENE、EQE、EEE、EEV、EDE、EDV、EQV 以及EVE 都只出現(xiàn)在噬藻體D1蛋白中,而在宿主藍(lán)藻中極少發(fā)現(xiàn)。利用以上方法能有效分析環(huán)境樣品中psbA基因序列的來源。

3自然環(huán)境中噬藻體psbA基因的遺傳多樣性

3.1海洋水域中噬藻體psbA基因的遺傳多樣性

目前對于海洋中噬藻體psbA基因的研究主要集中在蒙特雷海灣、紅海、地中海和熱水臺、夏威夷海域、墨西哥灣、切薩皮克海灣、挪威海域、北冰洋、太平洋、美國福斯特城海域及我國黃海、東海、渤海等。2003年,ZEIDNER等[22]首次根據(jù)噬藻體S-PM2的psbA基因保守序列設(shè)計(jì)引物58-VDIDGIREP-66/331-MHERNAHNFP-340,探究美國蒙特雷海灣噬藻體,利用所獲序列與紅海、地中海和熱水臺等水域的噬藻體psbA基因序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,確定了噬藻體psbA基因的可擴(kuò)增性和多樣性。隨后,SULLIVAN等[16]對夏威夷海域噬藻體P-SSM2、P-SSM4、P-SSP7、S-PM2、S-WHM1、Syn5和Syn9等的研究發(fā)現(xiàn)引物psbA-F/psbA-R擴(kuò)增效果欠缺,使用改進(jìn)后的引物Pro-psbA-1F/Pro-psbA-1R擴(kuò)增psbA基因系列并進(jìn)行系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)噬藻體具有非常豐富的遺傳多樣性。SANDAA等[27]采用引物psbA-F/psbA-R首次對冷水水域(挪威近岸海域)中噬藻體多樣性進(jìn)行研究,使用脈沖場凝膠電泳對噬藻體光合作用基因進(jìn)行克隆測序,不僅可分析基因組大小,還可了解病毒的種屬問題。通過與紅海、地中海、美國蒙特雷灣的噬藻體和聚球藻屬進(jìn)行發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)psbA基因分布在不同的進(jìn)化簇中,38%的psbA序列集中在同一進(jìn)化簇,驗(yàn)證了噬藻體的豐富多樣性。BENCH等[28]對切薩皮克海灣水域建立宏基因組文庫,采用BLAST分類學(xué)方法對水域中psbA同源性序列進(jìn)行比對,水域噬藻體中psbA基因與噬藻體序列的高比值顯示psbA在噬藻體基因組中普遍存在,說明短尾噬藻體和肌尾噬藻體比較豐富;比值較低的psbD基因也表明切薩皮海灣水域中以短尾噬藻體為主。CHE′NARD 等[26]使用引物Pro-psbA-1F/Pro-psbA-1R以psbA為靶基因研究海洋及淡水生態(tài)系統(tǒng)中噬藻體的遺傳多樣性,對北冰洋、太平洋、安大略湖和德國康斯坦斯湖水域的噬藻體psbA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并與其他海域(夏威夷、紅海、地中海、挪威海岸)噬藻體、噬藻體psbA基因、原綠球藻、聚球藻屬psbA基因序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)安大略湖和德國康斯坦斯湖的淡水噬藻體聚為FW1和FW2這2簇,海洋噬藻體聚為7簇(Mar1～Mar7)；源自地中海的噬藻體在每一簇噬藻體中均有分布,感染聚球藻的肌尾與短尾病毒科噬藻體的psbA基因分別聚在Mar1-SM和Mar2-SP這2簇,感染原綠球藻的肌尾與短尾病毒科噬藻體的psbA基因分別聚在Mar6-PM和Mar4-PP這2簇,說明噬藻體具有豐富的遺傳多樣性。

光合作用基因不僅可用于噬藻體遺傳多樣性研究,還可用于探索分析噬藻體的進(jìn)化過程及其與宿主藍(lán)藻的關(guān)系。CHE′NARD等[26]在研究噬藻體與藍(lán)藻的相互關(guān)系中發(fā)現(xiàn),藍(lán)藻和噬藻體的psbA基因系列屬于同一進(jìn)化簇的不同進(jìn)化亞簇,表明噬藻體中的光合基因源自其與宿主藍(lán)藻的基因水平交換,但噬藻體光合基因的獲得不是近期發(fā)生的,其進(jìn)化歷史與藍(lán)藻光合基因的進(jìn)化歷史不同。淡水和海洋生態(tài)系統(tǒng)中藍(lán)藻、噬藻體各自聚成不同的進(jìn)化簇,保持著有限的基因交流,淡水及海洋噬藻體的psbA基因系列分開聚簇,說明海洋和淡水噬藻體及宿主不同的噬藻體間光合作用基因之間的進(jìn)化歷史也存在差異,其進(jìn)化過程相互獨(dú)立。MILLARD等[23]使用引物psbA-F/psbA-R對美國福斯特城海域的噬藻體S-PM2進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)噬藻體中psbA基因的序列與藻類等的psbA基因序列有很高的相似性。

國內(nèi)對海洋噬藻體的研究起步較晚。2013年,盧龍飛[29]使用引物Pro-psbA-1F/Pro-psbA-1R對中國北黃海、渤海等海域的噬藻體多樣性進(jìn)行探究,通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),所獲118條噬藻體psbA基因片段共聚為4簇:北黃海的psbA序列分別存在于4個(gè)簇中,而來自青島近海海域的psbA序列只存在于2個(gè)簇中(Cluster Ⅰ和Ⅳ),來自青島近海域和黃海水域的大部分psbA基因的片段遺傳距離較近,可以共同成簇,而黃海的psbA基因遺傳多樣性更為豐富。2014年,ZHENG等[30]對中國東海海域的原綠球藻和侵染原綠球藻的肌尾病毒科噬藻體進(jìn)行多樣性分析,通過對原綠球藻和侵染原綠球藻病毒的GC含量和第3個(gè)密碼子的GC含量(GC3)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn),侵染原綠球藻的噬藻體psbA基因的GC含量高于宿主原綠球藻,且原綠球藻病毒的psbA基因在GC序列重組情況下更不穩(wěn)定,因此東海海域的噬藻體比原綠球藻有更高的遺傳多樣性。

3.2淡水水域中噬藻體psbA基因的遺傳多樣性

與海洋環(huán)境相比,淡水水體中噬藻體psbA基因多樣性研究相對滯后,主要集中在加拿大的安吉略湖、安納西湖、布爾熱湖、日本稻田、我國的滇池和東北的稻田中等。2010年SHORT等[31]利用噬藻體psbA基因引物psbA-F/psbA-R對加拿大安吉略湖進(jìn)行初步探究,通過PCR擴(kuò)增并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)冬季與初春噬藻體豐度較低,侵染藻類主要發(fā)生在春夏秋這3個(gè)季節(jié)。ZHONG等[32]對安納西湖和布爾熱湖中侵染聚球藻屬的噬藻體psbA基因的結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行研究,PCR擴(kuò)增采用引物Pro-psbA-1F/Pro-psbA-1R,系統(tǒng)發(fā)育分析表明高原湖泊明顯不同于其他的淡水和海洋水體,是一個(gè)具有獨(dú)特地理因素的多樣化病毒群體。

2009年,WANG等[33]采用引物psbA-F/psbA-R對日本稻田水體中噬藻體psbA基因遺傳多樣性進(jìn)行分析,使用PCR和D-DGGE技術(shù)得到37條不同的psbA基因片段,其基因序列分布在系統(tǒng)進(jìn)化樹的2個(gè)進(jìn)化簇中,且噬藻體在不同環(huán)境中的進(jìn)化地位不同。2014年,荊瑞勇[34]利用引物psbA-F/psbA-R 對東北(建三江、閻家崗和大安)稻田水體中噬藻體psbA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將得到的17條psbA基因序列與日本稻田水體psbA基因共同建樹分為5個(gè)進(jìn)化簇,我國擴(kuò)增出的psbA基因序列主要分布在Cluster Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ中,研究表明,我國東北稻田與日本稻田水體中噬藻體的psbA基因有很大差異。筆者在對高原富營養(yǎng)化淡水湖泊滇池中噬藻體psbA基因多樣性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),與海洋環(huán)境比較,滇池噬藻體群落與來自日本稻田水體和其他淡水湖泊的噬藻體psbA基因群集更為相似,淡水與海洋噬藻體psbA基因分布不同,淡水psbA序列間同源性要高于海洋系列,不同環(huán)境水域中噬藻體含有其獨(dú)特的類型,其psbA基因多樣性存在一定差異,顯示不同自然環(huán)境中噬藻體psbA基因組成存在一定差異,psbA基因的分布與其存在的環(huán)境有一定的關(guān)系。

綜合歷年來對噬藻體psbA基因的研究,從Genebank下載不同自然環(huán)境中噬藻體psbA基因序列,使用MEGA 5.0軟件比對確定光合作用基因psbA具有一定的特異性(圖1),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析psbA基因的分布情況(圖2)。噬藻體中光合作用基因psbA在海洋環(huán)境中的分布研究較多,而淡水水體中psbA基因分布有別于海洋水體。湖泊與稻田水體中噬藻體同源性很高,同時(shí)與宿主為原綠球藻、聚球藻的肌尾噬藻體或短尾噬藻體的同源性較低。海洋噬藻體具有更為豐富的遺傳多樣性:感染原綠球藻的短尾科噬藻體P-SSP3、P-SSP6與來自于北冰洋、墨西哥灣的海洋噬藻體聚為1簇; 北冰洋、太平洋中海洋噬藻體與宿主為聚球藻、原綠球藻的肌尾科噬藻體聚為1簇;而來自于太平洋東北部的海洋噬藻體則以宿主為聚球藻的肌尾噬藻體為主。

A—腺嘌呤脫氧核糖核苷酸;T—胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸;C—胞嘧啶脫氧核糖核苷酸;G—鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸。

4展望

噬藻體是水體中最為豐富的一類浮游病毒,能夠?qū)Ｒ桓腥舅{(lán)藻,對調(diào)節(jié)藍(lán)藻種群豐度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)演替以及介導(dǎo)基因水平轉(zhuǎn)移起著重要作用。噬藻體攜帶光合作用基因,介導(dǎo)光合作用基因在噬藻體和宿主間轉(zhuǎn)移,由此影響藍(lán)藻光合作用效率,提高藍(lán)藻適應(yīng)各種環(huán)境的能力,可能導(dǎo)致水域生態(tài)系統(tǒng)中宿主藍(lán)藻的生態(tài)競爭優(yōu)勢。光合作用能力的改變也導(dǎo)致宿主種群生態(tài)地位的變化,從而引起整個(gè)浮游植物種群的變化。宿主藍(lán)藻的大量繁殖同時(shí)為噬藻體提供了豐富的宿主來源以利于其自身在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)增殖,實(shí)現(xiàn)基于病毒-宿主相互間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。這也預(yù)示著藍(lán)藻水華的爆發(fā)除了受水體所含營養(yǎng)鹽水平的影響,同時(shí)可能還受因基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的分子水平上的影響。因此,選擇適合的分子標(biāo)記,開展系統(tǒng)發(fā)育分析以及遺傳多樣性研究無疑具有重要意義。對于噬藻體遺傳多樣性研究的已有進(jìn)展,主要是對G20、psbA基因的研究。在研究中發(fā)現(xiàn)G20基因存在于自然環(huán)境中的肌尾病毒科噬藻體中,而psbA基因也不是一個(gè)完美的分子標(biāo)記物,因?yàn)樵陂L尾病毒科噬藻體中沒有發(fā)現(xiàn)它的存在,并且對于侵染藍(lán)藻的噬藻體(潛伏期小于8 h)也檢測不到psbA基因。但是噬藻體psbA基因是噬藻體的分子標(biāo)記物中引物擴(kuò)增范圍最廣的,具有揭示噬藻體的進(jìn)化史、更好地用于研究噬藻體結(jié)構(gòu)和在海洋和淡水中的遺傳多樣性的作用。

灰色代表淡水中噬藻體,白色代表海洋中噬藻體,黑色代表稻田中淡水噬藻體。

目前對于噬藻體的研究不能完全覆蓋肌尾病毒科、短尾病毒科和長尾病毒科,因此迫切需要尋找覆蓋面更為全面的靶標(biāo)基因,或者結(jié)合噬藻體的更多分子標(biāo)記基因,如psbD、petE和petF等進(jìn)行綜合分析。同時(shí),相對于國外來說,我國噬藻體多樣性研究起步較晚,僅限于個(gè)別海洋、湖泊和稻田水體中等,而對于其他地區(qū)噬藻體基因多樣性的研究還有待深入。

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(責(zé)任編輯： 陳昕)

Progress of Research on Genetic Diversity of Cyanophage Based on psbA Gene.

LI Yue, LIU Ting-ting, LIU Li, XIA Xue-shan

(Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500, China)

Abstract:Cyanophages, as a kind of peculiar viruses that infect specifically cyanobacteria, exists extensively in various aquatic environments. In water bodies where water eutrophication is severe, cyanobacterial bloom outbreaks frequently. So scientists pay much attention to the study on cyanophages as a potential biological factor in controlling cyanobacteria. Currently studies on cyanophages are focused mainly on how to isolate and purify cyanophages and what its physiological and biochemical properties are. Little has been done on its genetic diversity because no universal genetic markers are available for the study. Using the photosynthesis psbA gene that encodes key photosystem II proteins (D1) of cyanophages as target, recent advances in researches on cyanophage genetic diversity in maritime and fresh water environments were reviewed and distribution and variation of cyanophages in various natural environments analyzed. Meanwhile, some tips for problems in and prospects of the researches in this field are also discussed.

Key words:cyanophage;psbA gene;genetic diversity

收稿日期：2015-08-31

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金(30960005,31360065)

中圖分類號：X52;Q93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-4831(2016)03-0417-07

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.03.013

作者簡介：李樾(1991—),女,黑龍江鐵力人,碩士生,主要從事環(huán)境微生物學(xué)方面的研究。E-mail: 184682604234@163.com

① 通信作者E-mail: Liuli2272@163.com