內(nèi)蒙古河套灌區(qū)不同鹽堿程度的土壤細(xì)菌群落多樣性

李 新,焦 燕,代 鋼,楊銘德,溫慧洋 (內(nèi)蒙古師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022)

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內(nèi)蒙古河套灌區(qū)不同鹽堿程度的土壤細(xì)菌群落多樣性

李 新,焦 燕*,代 鋼,楊銘德,溫慧洋 (內(nèi)蒙古師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022)

摘要：采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古河套灌區(qū)三種不同鹽堿程度土壤(鹽土,強(qiáng)度鹽化土,輕度鹽化土)不同深度(0～20cm和20～30cm)土壤細(xì)菌16S rDNA V3～V6 可變區(qū)擴(kuò)增片段進(jìn)行分析,并對(duì)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定.結(jié)果表明:細(xì)菌群落多樣性隨土壤鹽堿化程度的加深而減少(輕度鹽化土>強(qiáng)度鹽化土>鹽土),隨土壤深度的增加而降低(細(xì)菌群落多樣性0～20cm土層大于20～30cm土層).細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)在輕度鹽化土中最大為3.36,在強(qiáng)度鹽化土和鹽土分別為3.05和2.49.不同鹽堿程度土壤以細(xì)菌相似系數(shù)聚類(lèi),分為0～20cm層與20～30cm層兩大族群,土壤細(xì)菌群落Shannon-Wiener指數(shù)在0～20cm層中(鹽土為3.04,強(qiáng)度鹽化土為3.29,輕度鹽化土為3.36)均大于在20～30cm層(鹽土為2.49,強(qiáng)度鹽化土為3.05,輕度鹽化土為3.14).相關(guān)性分析和典范對(duì)應(yīng)分析表明,土壤w(EC)、pH值、w(SOC)、w(TP)是土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的顯著影響因素,不同鹽堿程度土壤中細(xì)菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)與土壤w(EC)(r=-0.542,P<0.05)、pH(r=-0.526,P<0.05)呈顯著負(fù)相關(guān),與土壤w(SOC)(r=0.700,P<0.01)和w(TP)(r=0.805,P<0.01)呈極顯著正相關(guān).w(EC)和pH對(duì)鹽堿土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響力最大.回收DGGE圖譜中20個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行測(cè)序分析,結(jié)果顯示,變形菌綱(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類(lèi)群.

關(guān)鍵詞：河套灌區(qū)；鹽堿土壤；細(xì)菌；變性梯度凝膠電泳(DGGE)；主成分分析

* 責(zé)任作者, 教授, jiaoyan@imnu.edu.cn

土壤微生物是土壤有機(jī)組分和生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的部分,在促進(jìn)土壤質(zhì)量和植物健康方面發(fā)揮著重要的作用,被認(rèn)為是最敏感的土壤質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)[1].土壤微生物多樣性指土壤生態(tài)系統(tǒng)中所有的微生物種類(lèi)、它們擁有的基因以及這些微生物與環(huán)境之間相互作用的多樣化程度.一般認(rèn)為,土壤微生物多樣性存在于基因、物種、種群以及群落等4個(gè)層面,是土壤生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)基本生命特征,也是時(shí)間和空間的函數(shù)[2-3].國(guó)內(nèi)外對(duì)農(nóng)田、森林、草原的土壤微生物研究較多[4?5],但對(duì)鹽堿土壤的研究多局限于理化特性的測(cè)定分析,國(guó)內(nèi)針對(duì)鹽堿土壤的微生物研究也僅限于天津?yàn)I海區(qū)域,江蘇濱海鹽堿地,松嫩平原,新疆、甘肅[6]等地,康貽軍等[7]研究灘涂鹽堿土壤微生物生態(tài)特征,曹?chē)?guó)棟等[8]對(duì)扇緣帶鹽堿土上生長(zhǎng)的三種植被類(lèi)型下的土壤微生物類(lèi)群數(shù)量進(jìn)行了研究.張廣志等[9]在鹽堿土壤鑒定出假單胞菌屬和黃桿菌屬.牛世全等[10]對(duì)河西走廊鹽堿土細(xì)菌種群多樣性的16S rDNA研究表明,γ-變形菌為優(yōu)勢(shì)菌群.石偉等[11]對(duì)極端鹽堿土壤細(xì)菌的分離篩選及抗鹽特性研究也發(fā)現(xiàn)多數(shù)菌株屬于γ-變形菌門(mén).然而,針對(duì)內(nèi)蒙古河套灌區(qū)鹽堿土壤中的微生物研究數(shù)量、種群結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)菌系以及鹽害與土壤微生物活動(dòng)之間的生態(tài)關(guān)系等相關(guān)報(bào)道較少.

土壤鹽堿化已嚴(yán)重制約著內(nèi)蒙古河套灌區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn),同時(shí)對(duì)本地區(qū)的糧食安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[12-13].河套灌區(qū)鹽堿地面積約4.3×105hm2,巴彥淖爾市占2.4×105hm2,其土壤鹽漬化面積與比例如下:輕度鹽化面積1.3×105hm2,占52.83%;中度鹽化面積7.6×104hm2,占31.94%;重度鹽化面積3.6×104hm2,占15.23%[14].

土壤中最活躍生物因子是土壤細(xì)菌,它既是土壤微生物的重要組成部分,占土壤微生物總數(shù)的70%～90%,也是土壤物質(zhì)流和能量流的主要推動(dòng)者,可以直接反映土壤肥力,已被公認(rèn)為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警及敏感指標(biāo)[15-19],在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用.由于從環(huán)境樣品中分離和培養(yǎng)細(xì)菌困難,不經(jīng)分離培養(yǎng)步驟,直接從土壤中提取總DNA并分析其基因信息的分子生物學(xué)方法已被發(fā)展用來(lái)描述和鑒定微生物群落.近年來(lái)基于DNA方法的群落分析如PCR擴(kuò)增技術(shù)、克隆文庫(kù)法、熒光原位雜交法、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性法,變性和溫度梯度凝膠電泳法[20],高通量測(cè)序技術(shù)[21]等得到了迅速的發(fā)展其中變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)由于有結(jié)果精確、可靠性強(qiáng)、重現(xiàn)率高等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于不同生態(tài)環(huán)境中微生物群落組成、多樣性及種群動(dòng)態(tài)變化的研究[22].如謝學(xué)軍等[23]借助DGGE技術(shù)研究了重金屬污染物對(duì)土壤微生物多樣性的影響;Dong等[24]利用DGGE分析方法研究了濕地土壤微生物多樣性;Smalla等[25]采用DGGE技術(shù)對(duì)不同植被根際微生物進(jìn)行了微生物多樣性分析.

土壤耕作層一般疏松多孔,通透性良好,根系集中,而土壤犁底層孔隙度小,通氣性差,透水性不良.二者的差異勢(shì)必會(huì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生影響.該文采用DGGE技術(shù),對(duì)內(nèi)蒙古河套灌區(qū)不同鹽堿程度不同深度土壤(0～20cm耕作層和20～30cm犁底層)中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異進(jìn)行分析,探討土壤理化特性和鹽堿化土壤微生物的相互作用機(jī)制,對(duì)于鹽堿地的綜合利用與開(kāi)發(fā)具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

供試土壤采于內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗,地處黃河北岸,河套平原東端,該地屬溫帶大陸性氣候,冬寒而長(zhǎng),夏熱而短,干旱少雨,春季風(fēng)沙較大,極端最高氣溫為39.7℃ ,最低氣溫-30.7℃ ,年平均氣溫7.7℃ .年平均日照3212.5h,無(wú)霜期167d.降水集中于7～9月,年平均降水量213.5mm,最大降水量為8月,極端日降水量達(dá)109.6mm.

1.2 樣品采集

為避免地形等因素影響,研究樣區(qū)選擇平坦地形并按照鄰近原則布置.試驗(yàn)于2014年5月未種植作物前(前茬季節(jié)作物葵花)選取3種不同鹽堿程度的鹽堿土壤,樣地S1、S2和S3(10m×10m)采用“S”型布點(diǎn)法采集樣方在距離地表0～20cm和20～30cm用土鉆分層取樣,每個(gè)樣方設(shè)10個(gè)樣點(diǎn)(1m×1m).各采樣點(diǎn)重復(fù)取樣3次,并將3次所得土壤樣品充分混勻,將可見(jiàn)的植物殘?bào)w(如根、莖和葉)和土壤動(dòng)物去除,裝于無(wú)菌聚乙烯自封袋中.一份風(fēng)干磨碎過(guò)2mm篩用于測(cè)定土壤理化特性,另一份迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,然后將部分土樣分裝于若干無(wú)菌離心管中-80℃保存.試驗(yàn)土壤樣地基本情況見(jiàn)表1.

表1 不同土壤鹽分含量(%)Table 1 Salt content in different types of soil in Hetao irrigation area (%)

1.3 土壤鹽堿程度分析

內(nèi)蒙古河套灌區(qū)地處干旱、半干旱區(qū),該研究三種土壤的含鹽總量依次為S1(1.69%)>S2(0.83%)> S3(0.12%),S1,S2和S3都是SO42-和Cl-含量最多,見(jiàn)表1,結(jié)合土壤鹽化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(表2)可知,S1土壤為鹽土,S2土壤為強(qiáng)度鹽化土壤,S3為輕度鹽化土壤.

表2 土壤鹽化分級(jí)指標(biāo)[26]Table 2 Soil salinization classification index[26]

1.4 樣品分析

1.4.1 樣品理化性質(zhì)測(cè)定 pH值以1:2.5土水比用復(fù)合電極測(cè)定;電導(dǎo)率(EC)以1:5土水比用復(fù)合電極測(cè)定;土壤容重的測(cè)定用環(huán)刀法;土壤質(zhì)地用比重計(jì)速測(cè)法;土壤有機(jī)碳(SOC)用重鉻酸鉀容量法-外加熱法;土壤全磷(TP)用HClO4-H2SO4測(cè)定,土壤全氮(TN)用凱氏定氮法.土壤鹽分:碳酸根、重碳酸根離子測(cè)定用電位滴定法;氯離子測(cè)定用硝酸銀滴定法;硫酸根離子測(cè)定用EDTA容量法;鈣、鎂離子測(cè)定用EDTA容量法;鉀、鈉離子測(cè)定用火焰光度法.理化性質(zhì)具體測(cè)定方法按照《土壤農(nóng)化分析(第三版)》進(jìn)行[27].1.4.2 土壤總DNA的提取及細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增 分別取0.5g土樣樣品,采用土壤DNA提取試劑盒(E.Z.N.A?.Soil DNA kit, Omega, USA)提取土壤總DNA.以樣品基因組DNA為模板,采用細(xì)菌通用正向引物338F在5‘末端加40個(gè)堿基的GC夾: 5c-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G ACTCCTACG GGA GGC AGC AG-3‘;和反向引物是518R:5‘-ATT ACC GCG GCT GCT GG –3’,40個(gè)GC夾加到338F前面,以保證DGGE實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定和片斷的分離,這一對(duì)引物能夠擴(kuò)增絕大多數(shù)的細(xì)菌.

PCR擴(kuò)增體系(50μL):10×PCR buffer 5μL; dNTP(2.5mmol/L)3.2μL;rTaq(5U/μL)0.4μL;GC-3 38F(20μmol/L)1μL;518R(20μmol/L)1μL;模板DNA 50ng;補(bǔ)ddH2O至50μL.PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,55℃復(fù)性45s,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán);最終72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收.PCR儀為Biometra公司生產(chǎn)的T-gradient,凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng).

1.4.3 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析 取10μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析.采用變性梯度為35%～55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學(xué)變性劑為100%尿素7mol/L和40%(V/V)的丙烯酰胺)在1×TAE緩沖液中150V 60℃下電泳5h.變性梯度凝膠電泳(DGGE)完畢后、采用銀染法染色、步驟如下:首先固定液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)固定15min;Milli-Q純水清洗、20s和2min各一次;其次銀染液(硝酸銀1g、37%甲醛0.75mL、定容500mL)染色15min;Milli-Q純水清洗、20s和2min各一次;再次顯色液(氫氧化鈉7.5g、37%甲醛2.5mL、定容500mL)顯色5-7min;最后用終止液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)終止反應(yīng).

1.4.4 DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶的回收與測(cè)序用滅菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶,采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶.以2 μL回收產(chǎn)物為模板,338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增體系(50 μL) 為:10×PCR buffer 5μL;dNTP(2.5mmol/L)3.2μL; rTaq(5U/μL)0.4μL;338F(20mmol/L)1μL;518R(20 mmol/L)1μL;模板DNA 1μL;補(bǔ)ddH2O至50μL.PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s,55℃復(fù)性30s,72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán);最后,72℃延伸10min.將重新擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化后,連接到Pmd18-T載體上,并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽(yáng)性克隆,進(jìn)行序列測(cè)定.

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析.細(xì)菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個(gè)體數(shù)以及均勻度的綜合指標(biāo).根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個(gè)條帶的強(qiáng)度(灰度),對(duì)各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener,H)、均勻度(Evenness, E)和豐富度(Richness,S)等指標(biāo)進(jìn)行分析.DGGE圖譜采用Quantity one軟件對(duì)每個(gè)樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析,多樣性指數(shù)(H)、豐富度指數(shù)(S)和均勻度指數(shù)(E)等指標(biāo)被用來(lái)比較不同樣品的多樣性情況.其算法如下所示:

式中:pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率;N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐富度;Ni為第i條帶的豐富度;S是某樣品中所有條帶數(shù)目總和.測(cè)序結(jié)果采用DNAstar和Cluster軟件進(jìn)行序列分析,下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的參考序列.然后采用MEGA軟件,Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),自展數(shù)(bootstrap)為1000.利用Canoco for Windows 4.5軟件進(jìn)行細(xì)菌群落和理化因子的典范對(duì)應(yīng)(canonical correspondence analysis CCA)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌群落多樣性分析

2.1.1 土壤細(xì)菌群落DGGE圖譜 經(jīng)凝膠電泳檢測(cè),選取較高質(zhì)量土壤樣品細(xì)菌基因組DNA.各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行細(xì)菌的DGGE電泳見(jiàn)圖1,利用Quantity One軟件對(duì)DGGE膠圖進(jìn)行條帶識(shí)別和圖譜分析,結(jié)果顯示,土壤樣品微生物的16S rDNA片段通過(guò)DGGE被分離出不同位置的若干條帶.根據(jù)膠圖上條帶遷移的位置和數(shù)目可以看出細(xì)菌的種類(lèi)豐富程度.樣品間的主要條帶不同,表明細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種存在差別.不同泳道同一位置條帶的明暗程度(光密度值)則反映該細(xì)菌類(lèi)群在不同環(huán)境樣品中的相對(duì)豐度[28].不同土壤樣品在細(xì)菌種類(lèi)組成上差別明顯.

鹽土、強(qiáng)度鹽化土和輕度鹽化土的表層(0～20cm)土壤中,對(duì)應(yīng)的泳道有許多相同的條帶,表明這些相同的條帶所代表的細(xì)菌種群為不同程度鹽堿地群落的表層土壤所共有,但是這些共有條帶的亮度不盡相同,表示它們?cè)诟髯喳}堿地群落表層土壤中的豐富度存在差異.此外,強(qiáng)度鹽化土和輕度鹽化土細(xì)菌群落的表層土壤有一些條帶,在鹽土中卻未見(jiàn),說(shuō)明強(qiáng)度鹽化土和輕度鹽化土表層土壤細(xì)菌群落與鹽土細(xì)菌群落有顯著差異,可能是鹽脅迫抑制了這些細(xì)菌的生長(zhǎng).相反,鹽土表層土壤中又有個(gè)別幾種細(xì)菌種群是其特有的,這可能與鹽土土壤中嗜鹽或耐鹽微生物有關(guān).在20～30cm層土壤中,不同鹽堿程度土壤類(lèi)型間的泳道條帶變異較大,輕度鹽化土細(xì)菌種群較鹽土和強(qiáng)度鹽化土少.同一鹽堿程度土壤在不同土壤深度的泳道條帶比較,可以看出各自的優(yōu)勢(shì)條帶明顯,說(shuō)明優(yōu)勢(shì)種群發(fā)生了變化.

圖1 不同鹽堿程度不同土壤深度細(xì)菌群落DGGE圖譜Fig.1 DGGE fingerprint of bacteria from different soil layers in different saline-alkaline soil

圖2 不同鹽堿程度不同深度土壤細(xì)菌群落聚類(lèi)分析Fig.2 The cluster analysis of bacterial community from different soil layers in different saline-alkaline soil數(shù)值代表各泳道與1泳道相比的相似性

2.1.2 不同鹽堿程度不同深度土壤細(xì)菌群落相似性分析 依據(jù)樣品間的相似系數(shù)構(gòu)建的聚類(lèi)圖(UPGMA),如圖2所示.15個(gè)土壤樣品中,細(xì)菌群落組成總體分為兩大族群,3種類(lèi)型鹽堿土0～20cm層土壤細(xì)菌聚為一族群,20～30cm層土壤細(xì)菌聚為另一族群.說(shuō)明0～20cm層與20～30cm層土壤細(xì)菌種群的構(gòu)成變化較大.其中,0～20cm層土壤細(xì)菌又可分成兩大族群,鹽土0～20cm層的3個(gè)重復(fù)土壤細(xì)菌聚為一族群,強(qiáng)度鹽化土和輕度鹽化土土壤細(xì)菌聚為另一族群.這說(shuō)明鹽土的土壤細(xì)菌種群不同于強(qiáng)度鹽化土和輕度鹽化土的細(xì)菌種群.強(qiáng)度鹽化土中5#和6#的相似度為0.66,輕度鹽化土中8#和9#的相似度達(dá)0.61.一般認(rèn)為相似值高于0.60的兩個(gè)群體具有較好的相似性[27].強(qiáng)度鹽化土和輕度鹽化土0～20cm層細(xì)菌,他們的相似系數(shù)僅為0.43,說(shuō)明強(qiáng)度鹽化土與輕度鹽化土細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)存在很大差異.

2.1.3 土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)分析 不同鹽堿程度不同深度土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)如表3所示.不論在0～20cm層還是20～30cm層土壤中,輕度鹽化土和強(qiáng)度鹽化土的細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)和Richness均為最大,并且與鹽土有顯著性差異.說(shuō)明輕度鹽化土和強(qiáng)度鹽化土不論在0～20cm層還是20～30cm層土壤中細(xì)菌群落都最為豐富,但其中各菌種分布的Evenness差異不顯著;隨著土壤深度的增加,Evenness不變,Shannon-Wiener指數(shù)和Richness指數(shù)均呈顯著降低.這表明從土壤0～20cm層至30cm的深度范圍內(nèi),隨著土層深度的增加,土壤細(xì)菌的Shannon-Wiener指數(shù)越小,Richness越低.

表3 不同鹽堿程度不同深度土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)分析Table 3 Analysis of bacterial genetic diversity in different soil layers in different saline-alkaline soil

2.1.4 土壤細(xì)菌群落系統(tǒng)組成分析 DGGE凝膠條帶回收后,以338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得約200bp的DNA片段.PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序.測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì),得到條帶所代表的細(xì)菌類(lèi)型.每個(gè)回收條帶選取3個(gè)克隆進(jìn)行了序列測(cè)定,如表4.根據(jù)這些DGGE帶譜所代表的微生物即可判定不同鹽堿程度土壤不同土層細(xì)菌群落的組成狀況.

條帶Band4在輕度鹽化土0～20cm條帶多,屬于固氮弓菌屬(Azoarcus)為輕度鹽化土0～20cm層特有的優(yōu)勢(shì)菌.條帶Band11和Band36在鹽土0～20cm條帶多,屬于黃桿菌屬(Flavobacterium)為鹽土0～20cm層特有的優(yōu)勢(shì)菌.條帶Band23屬于纖維弧菌屬(Cellvibrio),條帶Band27屬于食堿菌屬(Alcanivorax),在3種不同程度鹽堿土0～20cm層都有出現(xiàn).條帶Band3屬于Rhodoligotrophos appendicifer為鹽化土20～30cm特有的優(yōu)勢(shì)菌.一般情況下認(rèn)為,兩種細(xì)菌16S rDNA 序列同源性小于98%時(shí)屬于不同種,而同源性小于93%～95%時(shí),則屬于不同的屬[28].所以條帶Band8、18、28、37、38和43屬于新菌的可能性比較大.

將獲得的20條序列通過(guò)BLAST比對(duì)分析后,由表5可知,大致可分為5個(gè)大的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群,即變形菌門(mén)(Proteobacterium)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanophyta)、綠彎門(mén)(Chloroflexi)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)系統(tǒng).其中,變形菌門(mén)的12個(gè)條帶中有7個(gè)(Band1、12、15、19、23、24和27)在3種不同鹽堿度土壤0～20cm和20～30cm都出現(xiàn),屬于γ-變形菌綱(γ-proteobacteria),它是變形菌門(mén)最大的亞群,也是鹽堿土壤中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群;3個(gè)(Band3、6、34)屬于α-變形菌綱(α-Proteobacteria),1個(gè)(Band4)屬于β-變形菌綱(β-proteobacteria),1個(gè)(Band39)屬于δ-變形菌綱(δ–Deltaproteobacteria).γ-變形菌綱包括假單胞菌屬、纖維弧菌屬和食堿菌屬, α-變形菌綱包括Rhodoligotrophos appendicifer屬、新鞘脂菌屬和鞘脂單胞屬,β-變形菌綱包括固氮弓菌屬,δ-變形菌綱包括脫硫弧菌屬.藍(lán)藻門(mén)包括Crocosphaera watsonii屬,綠彎門(mén)包括Roseiflexus castenholzii,擬桿菌門(mén)包括黃桿菌屬和海藻菌屬,放線菌門(mén)包括Planobispora siamensis屬、庫(kù)茨勒菌屬和血桿菌屬.變形菌門(mén)(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類(lèi)群.DGGE測(cè)定鹽堿土壤中的菌株大部分都是屬于耐鹽堿的細(xì)菌菌株.

表4 測(cè)序克隆序列與其GenBank最相似序列的比對(duì)結(jié)果Table 4 Comparison between determined clone sequence and its most similar sequence in GenBank

2.2 土壤理化特性對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響

2.2.1 不同鹽堿程度不同深度土壤理化特性 由表5可知, 3種不同鹽堿度不同深度的土壤, w(EC)、pH值、w(TN)、w(TP)、w(SOC)、土壤水分和土壤容重的含量均存在差異.同一土壤深度,3種不同鹽堿程度土壤的pH和w(EC)表現(xiàn)為鹽土最大,并且與輕度鹽化土和強(qiáng)度鹽化土有顯著差異.土壤容重、w(SOC)、w(TP)和w(TN)表現(xiàn)為:鹽土<強(qiáng)度鹽化土;同一鹽堿程度土壤,不同土壤深度,土壤水分、w(EC)、土壤w(SOC)、w(TP)和w(TN)表現(xiàn)為:0～20cm層含量高于20～30cm層含量,與土壤容重變化趨勢(shì)相反.pH值在0～20cm層和20～30cm層土壤中則無(wú)明顯規(guī)律.

表5 不同鹽堿程度不同深度土壤理化參數(shù)Table 5 The physical and chemical properties of different soil layers in different saline-alkaline soil

2.2.2 相關(guān)性分析 表6為0～20cm層與20～ 30cm層土壤細(xì)菌群落基因型多樣性Shannon-Wiener 指數(shù),Evenness和Richness指數(shù)與表5七種理化參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果.由表6可見(jiàn),3種不同鹽堿程度土壤細(xì)菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)與Richness都與土壤w(EC)、pH值呈顯著負(fù)相關(guān),與土壤w(SOC)、w(TN)和 w(TP)呈極顯著正相關(guān).Evenness指數(shù)與土壤土壤水分和w(TN)呈顯著正相關(guān).w(EC)、pH值越小,土壤w(SOC)、w(TN)和w(TP)越大,土壤細(xì)菌群落的Shannon-Wiener和Richness指數(shù)越大.

表6 不同鹽堿程度不同深度土壤細(xì)菌群落指數(shù)與理化參數(shù)的相關(guān)性分析Table 6 Pearson correlation analysis between different soil layers in different saline-alkaline soil bacterial community indices and physicochemical parameters

圖3 不同鹽堿程度不同深度土壤細(xì)菌群落-環(huán)境CCA排序Fig.3 CCA biplot of samples and environmental variables1～3:鹽土0～20cm深度土壤3個(gè)平行樣,4～6:強(qiáng)度鹽化土0～20cm深度土壤3個(gè)平行樣,7～9:輕度鹽化土0～20cm深度土壤3個(gè)平行樣;10、11:鹽土20～30cm深度土壤2個(gè)平行樣,12、13:強(qiáng)度鹽化土20～30cm深度土壤2個(gè)平行樣,14、15:輕度鹽化土20～30cm深度土壤2個(gè)平行樣

2.2.3 土壤細(xì)菌和理化性質(zhì)的CCA分析 將DGGE圖譜中各條帶的灰度值作為物種數(shù)據(jù),利用CANOCO進(jìn)行去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(DCA),所得結(jié)果中第1排序軸的梯度長(zhǎng)度值為2.012,當(dāng)該值介于1.5～3.0時(shí),選擇線性模型做冗余分析(RDA)或者選擇單峰模型做典范對(duì)應(yīng)(CCA)分析均合適.根據(jù)Legendre[31]分析理論,由于典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)每一步計(jì)算結(jié)果都可以和環(huán)境因子進(jìn)行回歸,CCA排序能夠很好地反應(yīng)物種在特征因子梯度上的分布,因此選擇CCA更合適.將物種數(shù)據(jù)與0～20cm,20～30cm土壤理化參數(shù)w(EC)、pH值、w(TP)、w(TN)、w(SOC)、土壤水分w(W)和土壤容重做CCA,第1排序軸和第2排序軸解釋了土壤細(xì)菌群落的21.3%和15.5%,總排序軸即所選的土壤環(huán)境理化因子對(duì)物種的總解釋量為81.7%,損失的信息只有18.3%.這說(shuō)明土壤w(EC)、pH值、w(TP)、w(SOC)、土壤水分和土壤容重在研究鹽堿土土壤中的重要性.然而在鹽堿土壤中環(huán)境中可能還有其他理化因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.

圖3為不同鹽堿程度不同深度土壤細(xì)菌群落土壤-環(huán)境CCA排序圖.第1排序軸與w(EC)、pH值呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.7695、-0.7038,說(shuō)明橫坐標(biāo)從左到右w(EC)、pH值逐漸降低;第1排序軸與土壤容重呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.7637,說(shuō)明從左到右土壤容重逐漸增大.第2排序軸與w(SOC)、w(TN)和w(TP)呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.8871、0.8304和0.9659,說(shuō)明縱坐標(biāo)從下至上w(SOC)、w(TN)和w(TP)逐漸增大.w(EC)、pH值和土壤容重是影響鹽堿土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子.由圖3可見(jiàn),在0～20cm和20～30cm土層3種不同鹽堿程度土壤的分異明顯,而且各土壤平行樣一致性較好,均聚集在一起.w(EC)和pH值環(huán)境變量的長(zhǎng)度都長(zhǎng)于其他理化因子,也說(shuō)明其在鹽堿土壤中對(duì)細(xì)菌群落的影響力最大.樣方垂直投影于射線上,沿著變量箭頭方向環(huán)境變量值增大.輕度鹽化土和強(qiáng)度鹽化土0～20cm的細(xì)菌群落適宜在高w(SOC)、w(TN)和w(TP)中生存,鹽土0～20cm的細(xì)菌群落適宜在高w(EC)、pH值生存.在20～30cm土壤中,輕度鹽化土中的細(xì)菌群落在土壤容重較大時(shí)適宜生存.

CCA分析結(jié)果表明,Monte Carlo測(cè)試的所有成分軸P <0.01,w(EC)、pH和土壤容重對(duì)鹽堿土壤的細(xì)菌群落存在顯著影響,并且w(EC)、pH值和土壤容重對(duì)鹽堿土壤細(xì)菌群落的影響力最大.

3 討論

在自然生態(tài)環(huán)境下的許多微生物不適宜在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),因此用傳統(tǒng)的方法如平板計(jì)數(shù)法得到的微生物多樣性結(jié)果是非常片面的[32];碳素利用法(Biolog系統(tǒng))僅能鑒定快速生長(zhǎng)的部分微生物,只反應(yīng)了潛在的而不是原位的代謝多樣性[33];而以PCR-DGGE技術(shù)為代表的分子生態(tài)學(xué)方法,因?yàn)闊o(wú)需培養(yǎng)且檢驗(yàn)時(shí)間較短,相對(duì)較為先進(jìn)和可靠.PCR-DGGE能很好的揭示不同程度鹽堿土壤中相關(guān)細(xì)菌較高的種群多樣性、遺傳多樣性和生態(tài)多樣性.

3.1 不同鹽堿程度土壤對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

利用PCR-DGGE的研究方法得出,河套地區(qū)鹽堿土壤,在0～20cm層和20～30cm層土壤中,鹽土和強(qiáng)度鹽化土、輕度鹽化土細(xì)菌群落種類(lèi)之間差異顯著.隨著鹽堿化程度的加深,土壤細(xì)菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)和豐富度指數(shù)都顯著性降低.這與孫佳杰等[34]研究一致,土壤鹽化程度越高,土壤微生物數(shù)量越少,土壤微生物中細(xì)菌的數(shù)量從大到小依次為輕度鹽化土、中度鹽化土、重度鹽化土、鹽土.本研究表明,土壤中細(xì)菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)與Richness隨土層深度的增加而顯著降低.潘雪蓮等[35]研究表明, 在0～30cm土壤深度范圍內(nèi),黃土高原微生物多樣性指數(shù)隨土層深度的增加而減少;張社奇等[36]在研究黃土高原刺槐林地土壤微生物垂直分布時(shí)發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌群落對(duì)深度的變化極為顯著.

3.1.1 土壤鹽度和堿度對(duì)土壤對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響 土壤中鹽堿程度的加深主要表現(xiàn)為土壤鹽分的增加和pH值升高.相關(guān)性分析表明,3種不同鹽堿程度的土壤中細(xì)菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)與Richness與土壤w(EC)、pH值呈顯著負(fù)相關(guān).土壤鹽堿程度加深意味著土壤w(EC)和pH值越高,土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度越低.土壤水溶性離子總量(簡(jiǎn)稱土壤全鹽量)是衡量土壤鹽害程度大小的重要指標(biāo),土壤水溶性離子又是強(qiáng)電解質(zhì),其導(dǎo)電能力可用電導(dǎo)率w(EC)表示,并且二者具有正相關(guān)性,所以土壤w(EC)越高,鹽分越高,鹽害程度越嚴(yán)重[37].土壤微生物對(duì)w(EC)變化十分敏感,當(dāng)土壤鹽分升高時(shí),鹽分脅迫直接改變了微生物的生存環(huán)境,造成土壤微生物滲透脅迫,抑制和降低土壤活性微生物種群數(shù)量[38].李新等在利用PLFA方法研究鹽堿土壤微生物時(shí)發(fā)現(xiàn),土壤鹽害程度越高,堿性越強(qiáng)土壤主要微生物多樣性越單一,反之則越豐富[39].康貽軍等[7],Yu等[40]指出,細(xì)菌數(shù)量與土壤全鹽含量呈顯著負(fù)相關(guān),土壤鹽害程度越高,微生物數(shù)量越少,土壤細(xì)菌和真菌的數(shù)量分布從大到小為輕度鹽化土、中度鹽化土、重度鹽化土和鹽土.許多研究證明,在多種生態(tài)系統(tǒng)中pH通常與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有很好的相關(guān)性[41?42].

3.1.2 土壤有機(jī)碳、全磷等理化性質(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響 3種不同鹽堿程度的土壤中細(xì)菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)與Richness都與土壤w(SOC)和w(TP)呈極顯著正相關(guān),與土壤容重呈顯著負(fù)相關(guān).即土壤鹽堿程度越低,土壤w(SOC)和w(TP)越高,土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度也越高.這與許多學(xué)者研究一致,隨著鹽堿程度的增加,土壤養(yǎng)分含量逐漸下降,N、P等含量明顯降低[43-46].水分條件是影響土壤中微生物生存和活性的一個(gè)重要因素,適當(dāng)?shù)耐寥浪謼l件可以增加土壤微生物量和微生物活性[47].Griffiths等[48]研究指出,水分能明顯調(diào)節(jié)草地微生物多樣性,并會(huì)增加微生物本身對(duì)水的抗受性.而該研究表明,土壤水分w(W)與細(xì)菌Evenness指數(shù)呈顯著正相關(guān),和Shannon-Wiener指數(shù)并不存在相關(guān)關(guān)系,可能與微生物在河套灌區(qū)這種極端干旱和鹽堿脅迫的條件下,已經(jīng)適應(yīng)了缺水的環(huán)境,土壤中的其他營(yíng)養(yǎng)成分成為限制微生物活動(dòng)的主要因子.

3.2 主要土壤細(xì)菌類(lèi)群的分析

DGGE條帶經(jīng)序列測(cè)定后發(fā)現(xiàn),不同鹽堿程度土壤不同深度的優(yōu)勢(shì)菌群不同.變形菌門(mén)細(xì)菌(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱)、擬桿菌門(mén)(黃桿菌屬)和綠彎門(mén)(玫瑰彎菌屬)在不同鹽堿度土壤中均有分布.張廣志[9]在鹽堿土壤中分離鑒定耐鹽細(xì)菌時(shí)發(fā)現(xiàn)了黃桿菌屬和假單胞菌屬,并且在鹽濃度高達(dá)25%時(shí),也能生存.有研究發(fā)現(xiàn),假單胞菌屬細(xì)菌是一種耐鹽堿菌群,大多數(shù)種不需要有機(jī)生長(zhǎng)因子,同時(shí)還可降解環(huán)境中廣泛存在的多種有機(jī)分子,在自然界和污染環(huán)境的礦化修復(fù)作用過(guò)程中有著重要地位.硫弧菌屬最適生長(zhǎng)溫度在25～30℃,是硫酸鹽還原細(xì)菌,主要以硫酸鹽或其他的氧化態(tài)硫化物作為呼吸鏈的末端電子受體,以氫氣為電子受體,還原產(chǎn)物硫化氫.玫瑰彎菌屬(Rosebacter Shiba)是一種在堿性熱溫泉中發(fā)現(xiàn)的細(xì)絲狀不產(chǎn)氧光合細(xì)菌[50].食堿菌屬只有在相對(duì)高堿性和高鹽量的鹽土和強(qiáng)度鹽化土0～20cm層分布.劉艷等[51]研究深海熱液區(qū)微生物對(duì)深海環(huán)境響應(yīng)機(jī)制時(shí)也發(fā)現(xiàn)了食堿菌屬,并證明了食堿菌屬具有適應(yīng)高溫和大量硫的代謝特征.鞘脂單胞菌屬大部分是鞘氨醇單胞菌,存在于輕度鹽化土0～30cm,鹽土和強(qiáng)度鹽化土的20～30cm層.它們能廣泛的生存在各種水體、大氣、土壤甚至地球上的極端環(huán)境中.它們還能降解比較復(fù)雜的大分子有機(jī)物,也能產(chǎn)生有價(jià)值的高分子,還能利用簡(jiǎn)單的小分子在極端貧瘠的環(huán)境中存活[52].

綜上可知,不同鹽堿土壤中的主要細(xì)菌都是耐鹽堿的細(xì)菌菌株.變形菌綱(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類(lèi)群.在所有測(cè)序條帶中,變形菌門(mén)占分析樣品總量的55%,其余為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和藍(lán)藻門(mén).牛世全等[8]對(duì)河西走廊鹽堿土細(xì)菌種群多樣性的16S rDNA研究發(fā)現(xiàn),原生鹽堿土中存在9大細(xì)菌類(lèi)群,γ-變形菌為優(yōu)勢(shì)菌群.石偉[11]對(duì)極端鹽堿土壤細(xì)菌的分離篩選及抗鹽特性研究顯示多數(shù)菌株屬于γ-變形菌綱(γproteobacteria).該研究表明內(nèi)蒙古河套灌區(qū)鹽堿土壤細(xì)菌具有豐富物種、遺傳和發(fā)育系統(tǒng)多樣性.16S rDNA序列分析技術(shù)能夠在屬以上水平很好的反應(yīng)細(xì)菌的分類(lèi).利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)分析細(xì)菌結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)土壤微生物區(qū)系及其相互協(xié)同拮抗的代謝機(jī)制、以及與鹽堿環(huán)境之間的關(guān)系將成為今后研究的重點(diǎn).

4 結(jié)論

4.1 內(nèi)蒙古河套灌區(qū)鹽土、強(qiáng)度鹽化土和輕度鹽化土分別在0～20cm層和20～30cm層土壤細(xì)菌群落差異顯著,土壤鹽堿化程度越低,土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度越高,表現(xiàn)為輕度鹽化土>強(qiáng)度鹽化土>鹽土;0～20cm層與20～30cm層的土壤細(xì)菌群落也存在顯著性差異,隨著土層的加深,土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度減小.

4.2 CCA分析表明, w(EC)、pH和土壤容重對(duì)鹽堿土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響力最大.相關(guān)分析表明,土壤pH值、w(EC)越低,土壤w(SOC)、w(TN) 和w(TP)越高,土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度也越高.

4.3 變形菌門(mén)(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類(lèi)群.鹽堿土壤中的菌株大部分都是屬于耐鹽堿的細(xì)菌菌株.

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Soil bacterial community diversity under different degrees of saline-alkaline in the Hetao Area of Inner Mongolia.

LI Xin, JIAO Yan*, DAI Gang, YANG Ming-de, WEN Hui-yang (Chemistry and Environment Science College, Inner Mongolia Normal University, Huhhot 010022, China).China Environmental Science, 2016,36(1)：249～260

Abstract：Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) based on analyzing V3～V6 variable regions of bacterial 16S rDNA, were used to examine the microbial community structure and diversity in different saline-alkaline soils (saline soil, strongly salinized soil and slight salinized soil) and soil depths (0～20cm, 20～30cm) in the Hetao Area of Inner Mongolia.Their physical and chemical properties were measured, respectively.Experimental results showed that bacterial community structure and diversity decreased with the different saline-alkaline soil (slight salinized soil> strongly salinized soil> saline soil)and declined with soil depths (0～20cm>20～30cm).Shannon-Wiener index of bacterial community in slight salinized soil was the highest value (3.36), while it was only 3.05 and 2.49 in strongly salinized soil and saline soil.The cluster analysis of DGGE bands showed that the bacterial community structure and diversity formed two distinct clusters 0～20cm and 20～30cm.Shannon-Wiener index of bacterial community in 0～20cm layer (saline soil 3.04, strongly salinized soil 3.29, slight salinized soil 3.36) were higher than 20～30cm layer (saline soil2.49, strongly salinized soil 3.05, slight salinized soil 3.14).Analyses of Pearson correlation and CCA revealed that variations of bacterial community structure were mainly affected by contents of w(EC), pH, w(SOC), w(TP).The soil bacteria diversification index has a negative correlation with the w(EC)(r=-0.542,P<0.05)、pH(r=-0.526,P<0.05), and bacterial community diversity exhibited very significant positive correlation with w(SOC)(r=0.700,P<0.01) and w(TP)(r=0.805,P<0.01).w(EC) and pH were the the greatest influence in saline-alkaline soils.Twenty bands were excised from the DGGE gel and re-amplified for 16S rDNA sequencing.Based on the sequencing results, eleven bands can be identified as related to Proteobacteria.These results provide evidence that Proteobacteria are the domain bacterial communities in different saline-alkaline soilsbook=250,ebook=253of Hetao Area of Inner Mongolia.Saline-alkali soils were mostly bacterial strains belonging to tolerant salty.

Key words：Hetao Area；saline-alkaline soils；bacterial；DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis); principal component analysis

中圖分類(lèi)號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6923(2016)01-0249-11

收稿日期：2015-05-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41165010,41375144,41565009);2013內(nèi)蒙古高等學(xué)?！扒嗄昕萍加⒉拧敝С钟?jì)劃資助(NJYT-13-B06);內(nèi)蒙古師范大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CXJJS13044)

作者簡(jiǎn)介：李 新(1987-),女,內(nèi)蒙古烏蘭浩特人,在讀碩士研究生,主要從事土壤微生物多樣性研究.