連翹、薄荷混合揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備工藝研究＊

張艷軍，王永香，孟 瑾，朱明巖，吳 云，蕭 偉＊＊

（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）

連翹、薄荷混合揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備工藝研究＊

張艷軍1,2，王永香1,2，孟 瑾1,2，朱明巖1，吳 云1,2，蕭 偉1,2＊＊

（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）

目的：本研究旨在探究β-環(huán)糊精包合連翹、薄荷混合揮發(fā)油的最佳工藝。方法：以揮發(fā)油包合率、包合物得率為綜合評價指標(biāo)，采用飽和水溶液法制備連翹、薄荷混合揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物，通過L9（34）正交實驗考察了揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的配比、包合溫度及包合時間對制備工藝的影響，找出最佳的制備工藝條件并進(jìn)行了放大驗證。并用TLC、顯微鏡鑒別的方法對包合物進(jìn)行了表征和分析。結(jié)果：優(yōu)選出最佳制備工藝條件為：揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的配比為1:8，包合溫度為55℃，包合時間為3 h。結(jié)論：本實驗為連翹、薄荷混合揮發(fā)油包合工藝獲得最佳工藝參數(shù)及產(chǎn)業(yè)化放大提供了試驗依據(jù)。

連翹 薄荷 揮發(fā)油 包合工藝

連翹、薄荷是臨床上常用的中藥材，許多已上市治療感冒的中藥成方制劑（顆粒、片劑等）均含有此兩味藥材。連翹屬木犀科植物Forsythia supensa（Thunb.）Vahl的干燥果實，連翹藥材中揮發(fā)油是其發(fā)揮藥理 活性的重要組成成分[1]，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、抗菌抗病毒等功效，用于癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒溫病初起等疾病治 療[2]。薄荷Mentha hapiocalyxBriq為唇形科薄荷腦Mentha L.多年生宿根草本植物，全草可入藥，其有效成分為薄荷揮發(fā)油，薄荷油是由薄荷莖、葉經(jīng)水蒸氣蒸餾以及部分脫腦加工所制得，味辛，性溫，無毒，具有較強(qiáng)的提神、抑菌、祛風(fēng)等藥理作用[3,4]。揮發(fā)油類成分 不穩(wěn)定，在制劑成型工藝過程中直接加入易揮發(fā)，影響藥物的療效。β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）作為一種包合劑廣泛應(yīng)用于揮發(fā)油包合物的制備，便于制成合適的劑型，可以減少生產(chǎn)、貯存過程中的揮發(fā)或氧化變質(zhì)，能夠有效的提高制劑的穩(wěn)定性和療效性[5-8]。目前有關(guān)連翹揮發(fā)油與薄荷揮發(fā)油的β-CD單獨(dú)包合工藝研究已有報道[9-12]，但有關(guān)連翹、薄荷混合揮發(fā)油包合 工藝的研究未見報道。

銀翹敗毒片是本公司在研品種項目之一，該處方含有連翹、薄荷、金銀花、板藍(lán)根、升麻等9味藥材，是一種用于治療風(fēng)熱型感冒的臨床經(jīng)驗方，本文作者在進(jìn)行銀翹敗毒片制劑工藝的研究中，采用水蒸氣蒸餾法提取連翹、薄荷混合揮發(fā)油，使用飽和水溶液方法制備了連翹薄荷混合揮發(fā)油β-CD包合物，通過正交實驗法優(yōu)化了包合工藝，確定了制備包合物的最佳工藝參數(shù)，并且對包合物進(jìn)行了薄層色譜 鑒別和顯微影像的鑒定，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了理論實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（保定高新區(qū)陽光科教儀器廠），KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（上海黃海藥檢儀器有限公司），EMS-9F加熱磁力攪拌器（天津市歐諾儀器表有限公司）；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），顯微鏡（中國南京江南光學(xué)儀器廠），ZTQ3E多能提取罐（常熟市醫(yī)藥化工設(shè)備總廠）。

1.2 藥物與試劑

連翹（浙江寧波藥材股份有限公司），經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司執(zhí)業(yè)藥師吳舟鑒定為木犀科植物F. suspense（Thunb.）Vahl 的果實；薄荷（湖北金貴中藥飲片有限公司），經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司執(zhí)業(yè)藥師吳舟鑒定為唇形科薄荷屬薄荷；連翹、薄荷混合揮發(fā)油（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號120601）；β-CD，分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的制備

取連翹90 kg，薄荷54 kg，潤濕、切斷，投入多能提取罐中，加入10倍量純化水，夾層蒸汽加熱，藥液溫度控制在100±5℃，壓力控制在0.2 MPa以內(nèi)，回流提取3小時，得連翹薄荷油2 475 mL，連翹薄荷油得率為1.72%。連翹、薄荷油置于4℃中貯存，備用。

2.2 揮發(fā)油包合工藝的研究

2.2.1 連翹、薄荷混合揮發(fā)油β-CD包合物的制備

取揮發(fā)油8倍量的β-CD，加入一定量水中，升溫至60℃制成飽和水溶液，在100 r·min-1攪拌下緩緩滴加揮發(fā)油，加完揮發(fā)油后60℃保溫攪拌3 h；4℃冷藏12 h，過濾，用石油醚（60-90℃）對包合物進(jìn)行洗滌[13]，除去表面未包合的 揮發(fā)油，室 溫干燥，研碎。即得白色粉末狀包合物，備用。

2.2.2 包合效果評價指標(biāo)

稱取一定量的包合物細(xì)粉，置500 mL燒瓶中，加入蒸餾水300 mL，連接揮發(fā)油提取器，按2010年版《中國藥典》（一部）附錄揮發(fā)油測定法項下甲法[14]，測得包合物實際含油量。同時精密量取混合揮發(fā)油1 mL，同法操作，計算空白回收率。

揮發(fā)油空白回收率（%）＝收集揮發(fā)油量（g）/加入揮發(fā)油量（mL）×100%

包合物得率（%）=包合物質(zhì)量/（β-CD投入量+揮發(fā)油投入量）×100%

揮發(fā)油包合率（%）=包合物實際收油量/（揮發(fā)油的投入量×空白回收率）×100%

綜合評分=揮發(fā)油包合率×70%+包合物得率×30%

2.2.3 單因素考察

2.2.3.1 包合物制備的單因素考察指標(biāo)

在包合物的單因素考察實驗中，主要以連翹、薄荷混合揮發(fā)油與β-CD的配比、包合的溫度及包合時間為指標(biāo)，考察各主要因素對包合物的影響，并以此指標(biāo)進(jìn)行正交試驗篩選出最佳工藝條件。

2.2.3.2 連翹、薄荷混合揮發(fā)油與β-CD的配比因素

按揮發(fā)油:β-CD為1:4，1:6，1:8，1:10 和1:15的比例投料，按“2.2.1”項下包合物制備方法，在60℃恒溫水浴中，攪拌3 h，制備包合物，產(chǎn)物干燥。量取適量的產(chǎn)物，按“2.2.2”項下的方法測定包合物中揮發(fā)油的包合率，結(jié)果如下表1所示。

表1 連翹、薄荷混合揮發(fā)油與β-CD配比因素的影響

結(jié)果說明，包合物按揮發(fā)油:β-CD在1:6 到1:10范圍內(nèi)制備時，所得的揮發(fā)油包合率相對較高且穩(wěn)定，比例過高不利于包合率的提高。結(jié)果分析，可能是當(dāng)加入混合揮發(fā)油量太少時，油揮發(fā)對其包合有影響，使產(chǎn)率降低。

2.2.3.3 包合溫度因素

按揮發(fā)油:β-CD為1:8比例投料，按“2.2.1”項下包合物制備方法，在一系列不同溫度下，攪拌3 h，制備包合物，干燥。分別取產(chǎn)物適量，按“2.2.2”項下的方法測定包合物中揮發(fā)油的包合率，結(jié)果如下表2所示。

表2 包合物溫度因素的影響

結(jié)果表明，在55、60、65℃下制備的包合物產(chǎn)率相對較高，溫度過高不利包合率的提升。結(jié)果分析，溫度過高可能加劇混合物揮發(fā)油的揮發(fā)，不利于包合物的制備；溫度過低不利于環(huán)糊精飽和水溶液的形成，從而影響包合工藝。

2.2.3.4 包合時間因素

按揮發(fā)油:β-環(huán)糊精為1:8的比例，按“2.2.1”項下包合物制備方法，在60℃時按下表各攪拌時間下制備包合物，按“2.2.2”項下的方法測定包合物中揮發(fā)油的包合率，結(jié)果如下表3所示。

由表測定結(jié)果可知，1-3 h內(nèi)包合率相對穩(wěn)定，延長包合時間包合率反而降低。因此，增加攪拌時間不利于包合物的制備。結(jié)果分析，攪拌時間太長，包合率降低，可能是由于薄荷油受熱時間過長而揮發(fā)損失。

表3 包合時間因素的影響

表4 包合工藝的考察因素和水平表

表5 L9（34）正交表及試驗結(jié)果

表6 方差分析表

2.2.4 正交試驗及結(jié)果

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇連翹、薄荷混合揮發(fā)油與β-CD的配比，包合溫度，及包合的時間3項考察因素，各取3個水平進(jìn)行L9（34）正交實驗，因素水平見表4，并以包合物得率和揮發(fā)油包合率為綜合考察指標(biāo)，篩選出最佳的工藝條件，結(jié)果見表5、表6。

由實驗結(jié)果進(jìn)行直觀分析可知，各因素對試驗結(jié)果影響由大到小依次為：A＞C＞B，最佳工藝條件為A2B2C3。因素A、C各水平間具有較顯著性的差異，對揮發(fā)油包合有相對顯著性影響，B因素對揮發(fā)油包合工藝的影響不顯著?？紤]到實際生產(chǎn)中成本因素，包合溫度確定為55℃。因此，連翹、薄荷混合揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物最佳的包合工藝為A2B1C3，即揮發(fā)油:β-CD的配比為1:8，包合溫度為55℃，包合時間為3 h。

2.2.6 驗證試驗

為驗證方案A2B1C3的合理性，按照方案A2B2C3的工藝條件重復(fù)3次實驗，所得包合物的綜合評分為82.58%、85.43%、84.91%，表明所確定的最佳工藝A2B1C3合理。

2.3 包合物的鑒別

2.3.1 包合物TLC實驗

為了制備得到較為純凈的包合物，本實驗用石油醚（60-90℃）對包合物表面未包合的揮發(fā)油進(jìn)行洗滌，通過TLC對包合物包合前后以及淋洗前后進(jìn)行鑒別。具體方法如下：

未用石油醚洗滌的包合物作為樣品1；β-CD的水溶液作為樣品2；連翹薄荷油的乙醇溶液作為樣品3；取過量淋洗后的包合物，加水超聲溶解20 min，取上清液作為樣品4；包合物（洗滌）中提取揮發(fā)油的乙醇溶液作為樣品5。分別取上述5種樣品液2 μL，按從左到右的順序滴加于同一硅膠G板上，以石油醚（60-90℃）與乙酸乙酯（17:3）為展開劑，上行展開12 cm，取出、晾干，噴以5%香草醛-硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點清晰可見。結(jié)果如圖1所示，樣品2和樣品4無斑點，說明連翹薄荷油β-CD包合物制備完成；樣品3和樣品5在相同位置上有相同顏色的斑點，說明包合過程未改變連翹薄荷油的化學(xué)成分；樣品1有斑點，說明尚有揮發(fā)油未被包合，即包合物在洗滌之前表面有揮發(fā)油存在；樣品4無斑點，說明連翹薄荷油β-CD包合物表面的揮發(fā)油已淋洗干凈且包合成功。

2.3.2 顯微鏡鑒別

將β-CD、揮發(fā)油與β-CD的混合物、揮發(fā)油-β-CD包合物用水溶解后用膠頭滴管吸取少量溶液滴到載玻片上，蓋上蓋玻片，用顯微鏡觀察其成像結(jié)果（圖2）。

圖1 連翹、薄荷混合揮發(fā)油包合物TLC層析圖

圖2 揮發(fā)油β-CD包合物的顯微成像（10×10）

由圖2顯微鏡成像觀察得，β-CD的形狀為半透明板狀結(jié)晶；而混合物揮發(fā)油吸附于β-CD的表面，粘成一團(tuán)；揮發(fā)油與β-CD形成的包合物則為細(xì)碎晶粒，呈不透明、相對分散的微細(xì)晶粒，沒有明顯的板塊狀結(jié)晶或油狀物。在形成的包合物中，原來的β-CD半透明柱狀體晶體被揮發(fā)油充填，說明包合成功[15]。

2.4 穩(wěn)定性試驗

將連翹、薄荷混合油β-CD包合物用于銀翹敗毒片制劑工藝中，與傳統(tǒng)的噴灑工藝制備（制備方法：將揮發(fā)油噴灑到干粉上，加入淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂和微晶纖維素，混勻，干法制粒，壓片，包衣，分裝）的樣品進(jìn)行穩(wěn)定性對比，所制樣品放在常溫常壓密閉容器內(nèi)，避光保存，間隔0、1、2、3月后測定揮發(fā)油的含量，結(jié)果見表7。

3 討論

運(yùn)用β-CD對連翹、薄荷混合揮發(fā)油進(jìn)行包合，可以有效的提高揮發(fā)油的穩(wěn)定性，而且使液體油變?yōu)楣腆w粉末，便于制劑的成型，對工業(yè)生產(chǎn)具有較大的意義。本文采用飽和水溶液制備得到連翹、薄荷混合揮發(fā)油β-CD包合物，以混合揮發(fā)油的包合得率和揮發(fā)油的包合率為綜合考察指標(biāo)，對制備工藝中的幾個主要因素進(jìn)行了探討，結(jié)果表明揮發(fā)油:β-CD的配比影響因素最大；正交試驗結(jié)果表明β-CD包合連翹、薄荷揮發(fā)油的最佳工藝條件為，揮發(fā)油:β-CD的配比為1:8、包合溫度為55℃、攪拌的時間為3 h。本試驗結(jié)果為連翹、薄荷揮發(fā)油包合工藝在制劑成型工藝的應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。

該方法簡單、易行，操作方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。將所制備的包合物用于銀翹敗毒片制劑工藝中，與傳統(tǒng)的噴灑工藝制備的樣品進(jìn)行穩(wěn)定性實驗對比，結(jié)果表明，β-CD包合樣品的揮發(fā)油穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)制備方法，能夠有效的提高制劑的質(zhì)量，保證了藥物的臨床療效。

表7 穩(wěn)定性試驗對比/%

1 孔杰,姚健,達(dá)文燕,等.連翹揮發(fā)油化學(xué)成分的研究.西北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2001, 37(4): 77-80.

2 肖會敏,王四旺,王劍波,等.連翹揮發(fā)油的成分分析及其藥理作用的研究進(jìn)展.時珍國醫(yī)國藥, 2008, 19(8): 2047-2049.

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4 岳紅坤,常明,張東紅,等.薄荷油β-環(huán)糊精包合物的制備工藝優(yōu)化和產(chǎn)品表征.井岡山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2011, 32(5): 40-45.

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14 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 附錄63,124.

15 宋鳳蘭,金海杰,潘育方,等.白紙扇感冒顆粒中揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備.中國實驗方劑學(xué)雜志, 2012, 18(23): 9-11.

Preparation of Forsythia and Mentha Volatile Oil-β-cyclodextrin Inclusion Compound

Zhang Yanjun1,2, Wang Yongxiang1,2, Meng Jin1,2, Zhu Mingyan1, Wu Yun1,2, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)

This study aimed to explore the optimum conditions for the preparation of forsythia and mentha volatile oil-β-cyclodextrin inclusion compound. With inclusion rate of volatile oil and yield of inclusion complex as indexes, saturated aqueous solution method was selected to perpetrate the forsythia and mentha volatile oil-βcyclodextrin inclusion compound. By means of L9(34) orthogonal experiment, three factors including the proportion of oil and β-cyclodextrin, temperature and inclusion time were studied to determine the optimum conditions. This prepared inclusion complex was testified by analyses of microscopic imaging and thin layer chromatography (TLC). It was found that the optimum conditions for inclusion were as follows: the proportion of oil and β-cyclodextrin was 1:8, while temperature was 55℃, and inclusion time was 3 h. In conclusion, this study provided the feasible and theoretical experiment basis for the optimal inclusion technology of forsythia and mentha volatile oil-βcyclodextrin inclusion compound and industrialization amplification.

Forsythia, menthe, volatile oil, inclusion process

10.11842/wst.2016.03.033

R283

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2014-11-20

修回日期：2014-12-19

＊ 科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，研究員級高級工程師，博士，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。