近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)快速測定杜仲中松脂素二葡萄糖苷和京尼平苷酸的含量

李方飛、彭應(yīng)枝、許雄博、資 文、劉 蕊、劉 韶*

1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)部、湖南 長沙 410008 2. 中南大學(xué)藥學(xué)院、湖南 長沙 410013

近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)快速測定杜仲中松脂素二葡萄糖苷和京尼平苷酸的含量

李方飛1,2、彭應(yīng)枝1,2、許雄博1,2、資 文1,2、劉 蕊1,2、劉 韶1,2*

1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)部、湖南 長沙 410008 2. 中南大學(xué)藥學(xué)院、湖南 長沙 410013

應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)建立杜仲中松脂素二葡萄糖苷(PDG)和京尼平苷酸(GPA)含量測定模型。以積分球漫反射方式采集近紅外光譜數(shù)據(jù)、應(yīng)用一階微分、多元散射校正(MSC)等優(yōu)選光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理方法和競爭自適應(yīng)加權(quán)采樣(CARS)篩選最優(yōu)波長變量、采用偏最小二乘法(PLS)和交叉驗證法建立PDG和GPA的定標(biāo)模型。PDG和GPA的定標(biāo)模型顯示出良好的預(yù)測效果、其校正集的相關(guān)系數(shù)分別為0.961 5和0.958 3、交互驗證均方差分別為0.001 5和0.006 4。表明此快速預(yù)測模型準(zhǔn)確可靠、適合快速測定杜仲中的PDG和GPA、為杜仲質(zhì)量控制在線化提供了新思路。

近紅外光譜； 偏最小二乘法； 杜仲； 松脂素二葡萄糖苷； 京尼平苷酸

引 言

杜仲(Eucommiaulmoides)屬于杜仲科杜仲屬、是我國特有的二級保護(hù)植物[1]。中藥杜仲傳統(tǒng)取其干燥樹皮入藥、具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血糖、調(diào)血脂、安胎的功效[2-4]。

《中國藥典》2015年版一部中松脂素二葡萄糖苷(PDG)為杜仲皮中的質(zhì)量控制指標(biāo)、含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)[4]、但該方法處理過程繁瑣、費時、僅適合實驗室分析、不能滿足實時與在線分析需求[5]。近年來、由于近紅外光譜(NIRS)快速、無損和環(huán)保等優(yōu)點、在農(nóng)業(yè)、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛[6-11]。

目前、將近紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于杜仲中PDG的含量測定雖然已有報道[5,12]、但存在樣本量較少、缺乏代表性； 未對偏最小二乘法(PLS)建立的PDG定標(biāo)模型進(jìn)行說明等缺陷。本實驗收集了45批更多產(chǎn)地的杜仲樣本、采用高效液相色譜法(HPLC)測定杜仲中2個主要活性化合物—PDG、京尼平苷酸(GPA)的含量并利用近紅外光譜技術(shù)探究含量與其光譜數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性、采用PLS法構(gòu)建NIRS定量分析模型、以達(dá)到快速測定杜仲中PDG和GPA含量的目的、為杜仲的質(zhì)量控制提供新的參考。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

ANTARIS Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo Fisher公司)及隨機(jī)附帶的Results光譜采集軟件； 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、Welch Materials C18色譜柱(4.6 mm×250 mm、5 μm、美國Welch公司)。

杜仲藥材來自中國13個省份、各批次藥材經(jīng)劉韶教授(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)部)鑒定為杜仲科植物杜仲(Eucommiaulmoides)的樹皮。

1.2 HPLC數(shù)據(jù)測定

HPLC數(shù)據(jù)測定。色譜柱：Welch Ultimate XB-Cl8； 檢測波長230 nm； 流速1.0 mL·min-1； 流動相：甲醇(A)-0.2%H3PO4溶液(B)； 柱溫：35 ℃； 進(jìn)樣量：6 μL。每個樣品測定3次、取平均值。

1.3 近紅外光譜數(shù)據(jù)采集

1.3.1 掃描條件

掃描范圍：10 000～4 000 cm-1、分辨率：8 cm-1、掃描次數(shù)：32次。參比光譜為儀器內(nèi)置背景、譜圖采集方式為積分球漫反射。

1.3.2 光譜采集

采用文獻(xiàn)[5]方法將杜仲樣本粉碎、干燥、冷卻后備用、稱取2 g左右杜仲粉末置于光譜儀樣品盤中、輕輕壓實、每個樣品平行裝樣并測定3次、取光譜平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲活性成分測定結(jié)果

采用HPLC法作為標(biāo)準(zhǔn)方法測定杜仲樣本集中PDG和GPA的含量、結(jié)果如表1所示。

表1 杜仲中活性成分測量結(jié)果

2.2 杜仲樣品的近紅外光譜

如圖1所示、杜仲的原始光譜特性相似、在波數(shù)范圍10 000～4 000 cm-1內(nèi)(圖中橫坐標(biāo)的1到1 557)、近紅外譜圖所含信息量豐富、故在此區(qū)間進(jìn)行杜仲定量分析。譜圖中明顯存在異常光譜、采用基于蒙特卡洛交互驗證法[13]判斷樣本集中的異常樣品并將其篩除、結(jié)果如圖2。

圖1 杜仲樣本近紅外原始光譜圖

圖2 篩除異常樣品結(jié)果圖

2.3 光譜預(yù)處理方法的選擇

近紅外光譜信息中一些不相關(guān)的信息和噪聲將很大程度上影響最終預(yù)測模型的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性、需對近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理。本研究首先選取三種基本方法對光譜進(jìn)行預(yù)處理、包括一階微分、多元散射校正(MSC)和中心化、如圖3所示、經(jīng)這三種預(yù)處理方法處理后的光譜圖噪音仍較大、因此需對光譜進(jìn)行進(jìn)一步處理。如表2所示、經(jīng)SG平滑+正交信號校正(OSC)對光譜進(jìn)一步處理后、PDG和GPA預(yù)測模型的交互驗證均方差(RSMECV)有明顯提高、RSMECV分別達(dá)到0.001 5和0.006 4。綜合以上、最終確定PDG和GPA含量預(yù)測模型的最佳預(yù)處理方法為一階微分+MSC+中心化+OSC+SG平滑。

圖3 PDG、GPA經(jīng)一階微分+MSC+均值中心化預(yù)處理后的光譜圖

表2 不同光譜處理方法獲得杜仲中活性成分定量模型參數(shù)

2.4 最佳建模主因子數(shù)

最佳建模主因子數(shù)的選擇可直接關(guān)系到最終預(yù)測模型的準(zhǔn)確度。“過擬合”與“欠擬合”現(xiàn)象是由于主因子數(shù)選擇不當(dāng)導(dǎo)致的、并均可使預(yù)測誤差顯著增大[14]。本實驗采用內(nèi)部交叉驗證方法[15]確定最佳建模主因子數(shù)。圖4為PDG和GPA的RMSECV隨主因子數(shù)的變化圖、RMSECV最小時的主因子數(shù)即為最佳建模主因子數(shù)。如圖中箭頭所示、最終確定PDG和GPA預(yù)測模型的建模主因子數(shù)分別為8和6。

2.5 波長變量的選擇

優(yōu)選波長變量、篩除冗余干擾波長可明顯提高模型預(yù)測能力與穩(wěn)定性。本實驗采用競爭自適應(yīng)加權(quán)采樣(CARS)[16]篩選模型中有效波長變量、剔除冗余波長變量、根據(jù)RMSECV最小原則確定最優(yōu)波長組合。圖5為PDG和GPA的RMSECV隨各變量回歸系數(shù)的變化圖、如圖5所示、PDG和GPA模型分別保留18和21個波長變量。

2.6 定量校正模型的建立與體外驗證

依照上述最優(yōu)條件建立杜仲中PDG和GPA的定量分析模型、通過驗證發(fā)現(xiàn)PDG和GPA的定量分析模型預(yù)測值與HPLC測量值均具有很好的相關(guān)性、表明兩個校正模型均具有較好的預(yù)測準(zhǔn)確度。結(jié)果見圖6。隨機(jī)抽取6份未知樣本組成驗證集、分別采用HPLC法和已建立的定量分析模型預(yù)測PDG和GPA的含量、將測量值與預(yù)測值進(jìn)行比較、結(jié)果見表3?？傮w而言、PLS模型預(yù)測值與HPLC法測量值無顯著性差異。

圖4 PDG和GPA近紅外定量模型的交互驗證結(jié)果

圖5 PDG和GPA定量模型波長變量的回歸系數(shù)圖

圖6 PDG和GPA真實值和預(yù)測值的相關(guān)性

表3 HPLC法測定值與近紅外預(yù)測值比較

3 結(jié) 論

將近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計量學(xué)方法相結(jié)合、采用PLS建立了杜仲藥材中PDG和GPA近紅外含量測定模型、實現(xiàn)了對PDG和GPA兩種成分的快速分析、為杜仲質(zhì)量控制及在線監(jiān)測提供了參考思路。本研究中杜仲的另2個主要活性化合物—綠原酸(CHA)和京尼平苷(GP)未獲得對應(yīng)的NIRS定量分析模型、具體原因是本研究杜仲樣本來源廣泛、質(zhì)量良莠不齊、活性成分含量差異大、僅有15%杜仲樣本的CHA含量達(dá)到0.1%、不滿足近紅外應(yīng)用條件； GP NIRS定量分析模型的RMSECV較大、GP模型預(yù)測效果較差。在后期研究中將進(jìn)一步收集最具代表性的杜仲樣本、建立杜仲CHA和GP的定量分析模型、并更新已有的PDG和GPA的定量分析模型、達(dá)到杜仲四種活性成分同時檢測的目的。

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*Corresponding author

Rapid Determination of Pinoresinol Diglucoside and Geniposidic Acid inEucommiaulmoideswith Near Infrared Spectroscopy Combined with Chemometrics Methods

LI Fang-fei1,2,PENG Ying-zhi1,2,XU Xiong-bo1,2,ZI Wen1,2,LIU Rui1,2,LIU Shao1,2*

1. Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410008,China 2. School of Pharmaceutical Sciences,Central South University,Changsha 410013,China

To develop a quantitative models for simultaneous determination of pinoresinol diglucoside (PDG) and geniposidic acid (GPA) inEucommiaulmoideswith near-infrared (NIR) spectroscopy combined with chemometrics. The NIR spectra were collected in diffuse reflection mode and pretreated with various spectra preprocessing methods including first-order differentiator,multiplicative scatter correction and so on. The optimal wavelength variables were screened out by competition adaptive weighted sampling method. The quantitative models for the simultaneous determination of PDG and GPA inEucommiaulmoideswere established with partial least squares (PLS) algorithm and cross validation methods. The quantitative prediction models for simultaneous determination of PDG and GPA inEucommiaulmoidesshowed good predictive ability. The correlation coefficients (R2) of the two calibration models were 0.961 5,0.958 3 while the roots mean square of cross-validation (RMSECV) were 0.001 5,0.006 4,respectively. The quantitative prediction models proved that near infrared spectra method used for the quantitative analysis of PDG and GPA inEucommiaulmoidesowned high prediction accuracy and can meet the precision need of rapid determinations of PDG and GPA inEucommiaulmoidesin reality so t it provides a new method to realize the real time on line of quality control ofEucommiaulmoides.

Near infrared spectroscopy; Partial least squares;Eucommiaulmoides; Pinoresinol diglucoside; Geniposidic acid

Apr. 26,2015; accepted Aug. 8,2015)

2015-04-26、

2015-08-08

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAI01B08)資助

李方飛 、1990年生、中南大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生 e-mail：281523604@qq.com *通訊聯(lián)系人 e-mail：liushao999@hotmail.com

R927.2

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-3945-06