• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝研究*

    2016-06-05 15:19:44王永剛蘇薇薇
    關(guān)鍵詞:層析柱蝮蛇化學(xué)試劑

    鄧 沁,吳 忠,彭 維,王永剛,蘇薇薇

    (中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價(jià)工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州510275)

    尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝研究*

    鄧 沁,吳 忠,彭 維,王永剛,蘇薇薇

    (中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價(jià)工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州510275)

    尖吻蝮蛇凝血酶是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離純化得到的一種類凝血酶,屬于止血一類新藥。建立了尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝,采用切向流過濾技術(shù),用兩步離子交換層析分離得到高純度的尖吻蝮蛇凝血酶,再采用兩步凝膠排阻層析去除熱原和脫鹽。該工藝具有簡便高效的特點(diǎn),適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

    尖吻蝮蛇凝血酶;分離;純化;工藝

    尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus,簡寫為Halase)是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離純化的一種類凝血酶,它通過水解纖維蛋白的Aα鏈,使纖維蛋白原原降解為纖維蛋白單體,從而發(fā)揮凝血作用。研究表明尖吻蝮蛇凝血酶具有較強(qiáng)的止血作用,且無毒[1-4]。本團(tuán)隊(duì)建立了一種尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝,采用切向流過濾技術(shù),用兩步離子交換層析分離得到高純度的尖吻蝮蛇凝血酶,再采用兩步凝膠排阻層析去除熱原和脫鹽;具有簡便高效的特點(diǎn),適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材 料

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

    蛋白分離純化儀:GE Healthcare Life Sciences公司(GE Healthcare),型號:AKTA prime plus;層析柱:GE Healthcare,型號:XK 50/30、XK 50/60;膜過濾分離系統(tǒng):GE Healthcare,型號:QuixStandand Benchtop System;微濾柱:GE Healthcare,型號:CFP-4-E-4MA(420 cm2,0.45 μm);超濾柱:GE Healthcare,型號:UFP-10-E-4MA(420 cm2,10 NMWC);層析柜:上海青浦滬西儀器廠,CXG-1;便攜式pH計(jì):OHAUS公司,型號:STARER 3000;高效液相色譜儀: Dionex公司,型號:UltiMate 3000;色譜柱:廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司,型號:BioSep-SEC-S 2000(7.8 mm ×300 mm,5 μm);飛行時(shí)間質(zhì)譜:Bruker Daltonics公司,型號:Ultraflex TOF/TOF III;電泳儀:Bio Rad公司,型號:Mini-protenⅢ;凝膠掃描儀:BioRad公司,型號:GS-800;搖床:海門其林貝爾公司,型號:BETS-M1脫色微型圓周搖床;超凈工作臺:上海錦屏儀表有限公司,型號:SW-G6;電子天平:美國G&G公司,G&G ELECTRONIC SCALE (500 g,d =0.1 g);磁力攪拌器:德國IKA公司, 型號:RCT basic;超聲儀:昆山市超聲儀器有限公司,型號:KQ-500DE;水浴鍋:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠,型號:HH·B11·420。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

    尖吻蝮蛇蛇毒:江西五步蛇生物科技有限公司,批號:201306;陰離子交換層析填料:DEAE SepharoseTMFast Flow,批號:10143954;分子篩凝膠層析填料:SuperdexTM75 prep grade,批號:10152155;分子篩凝膠層析填料:SephadexTMG-25,批號:10034116;磷酸氫二鈉,廣州化學(xué)試劑廠,批號:20140407-1;磷酸二氫鈉,天津市福晨化學(xué)試劑廠,批號:20140107;氯化鈉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20140818;氫氧化鈉,廣州化學(xué)試劑廠,批號:20130805-1;水為超純水。磷酸氫二鉀,廣東光華化學(xué)試劑廠,批號:20131120;磷酸二氫鉀,廣東光華化學(xué)試劑廠,批號:20131110;甲醇(色譜純),Honeywell,批號:09ZG1H。Lowry法蛋白定量試劑盒,上海貝博生物科技有限公司,批號:201012。Pierce非預(yù)染蛋白Marker,Thermo Scientific,批號:00132053;w=12% SDS-PAGE預(yù)制膠,文淵閣生物科技(上海)有限公司;5×SDS-PAGE上樣緩沖液,GenStar,批號:E153-0;5×電泳液,碧云天生物技術(shù)研究所,批號:P0014B;w=0.1%考馬斯亮藍(lán)R250,Amresco,批號:0472;乙醇,廣州化學(xué)試劑廠,批號:20140105-1;冰醋酸(分析純),廣州化學(xué)試劑廠,批號:20121105-2。病毒滅活冰凍血漿,肇慶市中心血站;尿素,廣州化學(xué)試劑廠,批號:20020103-2。

    2 方 法

    2.1 分離純化

    取尖吻蝮蛇蛇毒粉末7.5 g,至于4 ℃層析柜中,用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)約75 mL攪拌溶解2 h,待蛇毒完全溶解后,用上述磷酸鹽緩沖液稀釋至200 mL;用孔徑為0.45 μm的微濾柱微濾,收集濾液并加入上述磷酸鹽緩沖液稀釋至300 mL;再用孔徑為10 NMWC的超濾柱超濾,收集濾液(I),備用。

    用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)先平衡DEAE SepharoseTMFast Flow層析柱,取濾液(I)上層析柱(10 mL/min);待濾液全部倒入后,即用上述磷酸鹽緩沖液沖洗層析柱(35 mL/min),直至紫外檢測器無峰信號檢出(280 nm);然后用含0.05 mol/L NaCl的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)沖洗層析柱(10 mL/min),監(jiān)測紫外吸收峰信號,收集紫外吸收峰處濾液;用HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測方法監(jiān)測其是否為目標(biāo)組分;對目標(biāo)組分用孔徑為10 NMWC的超濾柱進(jìn)行超濾濃縮,收集濾液(II),備用。

    用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)先平衡DEAE SepharoseTMFast Flow層析柱,取濾液(II)上層析柱(10 mL/min);待濾液全部倒入后,即用磷酸鹽緩沖液沖洗層析柱(35 mL/min),直至紫外檢測器無峰信號檢出(280 nm);然后分別用含0.03 mol/L NaCl和0.1 mol/L NaCl的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)沖洗層析柱(20 mL/min),監(jiān)測紫外吸收峰信號,收集紫外吸收峰處濾液;用HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測方法監(jiān)測其是否為目標(biāo)組分;對目標(biāo)組分用孔徑為10 NMWC的超濾柱進(jìn)行超濾濃縮,收集濾液(III),備用。

    用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)先平衡SuperdexTM75 prep grade層析柱,取濾液(III)上層析柱(20 mL/min);待濾液全部倒入后,用磷酸鹽緩沖液沖洗層析柱(20 mL/min),監(jiān)測紫外吸收峰信號(280 nm),收集紫外吸收峰處濾液(IV),備用;用HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測方法監(jiān)測其是否為目標(biāo)組分。

    用超純水先平衡SephadexTMG25層析柱,取濾液(IV)上層析柱(20 mL/min);待濾液全部倒入后,即用注射用水洗脫目標(biāo)物沖洗層析柱(20 mL/min),監(jiān)測紫外吸收峰信號(280 nm),收集紫外吸收峰處濾液(V);用HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測方法監(jiān)測其是否為目標(biāo)組分。

    2.2 HPLC純度檢測

    取分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶溶液,按照高效液相色譜法(《中國藥典》2015年版(四部)通則0512)測定[5]。色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性:BioSep-SEC-S 2000色譜柱;以pH 6.8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液為流動相,檢測波長為280 nm,流速為1 mL/min,理論塔板數(shù)不得少于2 000;按面積歸一化法計(jì)算尖吻蝮蛇凝血酶相對百分含量。

    2.3 SDS-PAGE電泳檢測

    取分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶溶液,參考Amersham Pharmacia公司的蛋白電泳技術(shù)手冊[6],采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對尖吻蝮蛇凝血酶進(jìn)行電泳分析。

    2.4 精確相對分子質(zhì)量測定

    取分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶溶液,采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)測定精確相對分子質(zhì)量[7]。

    2.5 酶比活性測定

    人血漿凝固時(shí)間法:量取人血漿0.2 mL至于試管中,在37 ℃水浴中保溫約2 min;加入分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶溶液0.2 mL后,立即搖勻計(jì)時(shí),人血漿溶液應(yīng)在(60±20) s內(nèi)振搖后出現(xiàn)凝結(jié);再加入1 mL 5 mol/L尿素溶液后振搖,凝塊溶解,溶液變清。采用Lowry法[8]測定分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶的蛋白質(zhì)含量,計(jì)算在37 ℃條件下,使標(biāo)準(zhǔn)人血漿在(60±20) s內(nèi)振搖后出現(xiàn)絮狀物的尖吻蝮蛇凝血酶量。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 分離純化

    本研究建立了一種尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝,分離純化過程見圖1。

    結(jié)果顯示,經(jīng)過微濾和超濾后,尖吻蝮蛇蛇毒中的大量雜質(zhì)即被除去;初步除雜后的蛇毒溶液隨后通過兩次DEAE SepharoseTMFast Flow陰離子交換層析,可分離得到純度較高的尖吻蝮蛇凝血酶;再通過SuperdexTM75 prep grade和SephadexTMG-25兩步凝膠排阻層析,制備出高純度的尖吻蝮蛇凝血酶。

    3.2 純度測定

    分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶的高效液相色譜呈單一對稱峰,記錄色譜圖見圖2,按面積歸一化法計(jì)算其純度達(dá)99.69%,如表1所示。

    圖1 尖吻蝮蛇凝血酶純化過程中收集的組分紫外峰信號Fig.1 UV Signals during Separation and Purification of Halase

    圖2 尖吻蝮蛇凝血酶的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of Halase

    3.3 SDS-PAGE電泳檢測

    純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,結(jié)果如圖3,呈現(xiàn)兩條清晰條帶。

    表1 尖吻蝮蛇凝血酶的HPLC譜圖相對峰面積

    圖3 尖吻蝮蛇凝血酶SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of Halase

    3.4 精確相對分子質(zhì)量測定

    MALDI-TOF-MS相對分子質(zhì)量測定結(jié)果如圖4所示,m/z=29 245.020質(zhì)譜峰為尖吻蝮蛇凝血酶的質(zhì)子化分子離子峰[M+H]+;m/z=58 506.131是尖吻蝮蛇凝血酶的二聚體離子峰[2M+H]+。尖吻蝮蛇凝血酶的精確相對分子質(zhì)量為29 245.020。

    圖4 尖吻蝮蛇凝血酶MALDI-TOF-MS圖譜Fig.4 MALDI-TOF-MS analysis of Halase

    3.5 比活性測定

    最終分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶的比活為185.19 U/mg。

    3.6 討論

    本文探討的一種尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝,以微濾與超濾代替?zhèn)鹘y(tǒng)的離心與透析實(shí)現(xiàn)蛇毒粗蛋白的快速除雜,隨后兩步陰離子交換層析的洗脫步驟簡單,可穩(wěn)定重復(fù),最后通過兩步凝膠過濾分子篩層析先除熱源后脫鹽,有效分離出具有較強(qiáng)凝血活性的尖吻蝮蛇凝血酶。分離純化過程以HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測作為制備工藝的監(jiān)測手段。該工藝操作簡單高效,適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

    [1] 吳忠. 尖吻蝮蛇凝血酶用作出血性疾病的藥物:中國, CN1218747[P]. 2003-08-14.

    [2] 吳忠.止血一類新藥Halase的藥效學(xué)研究[J]. 中藥材, 2005,28(2): 125-128.

    [3] 蘇薇薇.止血一類新藥Halase的長期毒性試驗(yàn)[J]. 中藥材, 2005,28(3): 211-212.

    [4] 吳忠.止血一類新藥Halase的一般藥理學(xué)研究[J]. 中藥材, 2005,28(4): 326-327.

    [5] 中華人民共和國藥典委員會. 中華人民共和國藥典四部[M] . 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015:59-61.

    [6] Amersham Pharmacia Biotech. Protein electrophoresis technical manual[M]. New York: Amersham Pharmacia Biotech, 1999:13-19.

    [7] 張珍英,鄧慧敏,鄧芹英.香豆素類新基質(zhì)在基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測定多糖和糖蛋白中的應(yīng)用[J]. 分析化學(xué), 2008,36(10): 1419-1422.

    [8] 張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù) [M]. 2版.北京:高等教育出版社, 1997: 32-34.

    New process for separation and purification of Haemocoagulase Acutus

    DENGQin,WUZhong,PENGWei,WANGYonggang,SUWeiwei

    (Guangdong Engineering & Technology Research Center for Quality and Efficacy Re-Evaluation of Post-Market TCM ∥ School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275,China)

    Haemocoagulase Acutus (Halase), a new hemostatic in development, is a high-performance thrombin-like enzyme (TLE) derived from snake venom ofAgkistrodonacutus. Here we reported a new process established for separation and purification of Halase from snake venom. Combined with tangential flow filtration, ion exchange chromatography was conducted twice to effectively separate Halase, and two gel exclusion columns were used to remove pyrogen and salt. This new method is simple and efficient, and generates a high purity of Halase, making it a promising process in industrial scale application.

    Haemocoagulase Acutus; separation; purification;process

    10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.06.025

    2016-03-30

    國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2011ZX09101-002-02);廣東省重大科技專項(xiàng)(2011A080501004)

    鄧沁(1988年生),女;研究方向:現(xiàn)代生物醫(yī)藥工程;通訊作者:蘇薇薇;E-mail:lsssww@126.com

    R973+.1

    A

    0529-6579(2016)06-0161-04

    猜你喜歡
    層析柱蝮蛇化學(xué)試劑
    關(guān)于光合色素的提取、分離及其吸光度的探究
    層析介質(zhì)Capto Core400 和Sephacryl S-1000純化乙型肝炎病毒核心蛋白病毒樣顆粒效果的比較
    食品安全檢測實(shí)驗(yàn)室化學(xué)試劑與耗材的管理
    40年堅(jiān)守只為2萬條蝮蛇有個家
    高校實(shí)驗(yàn)室化學(xué)試劑準(zhǔn)備與管理模式研究*
    廣州化工(2020年8期)2020-05-12 09:58:54
    快樂的發(fā)現(xiàn)
    糖化血紅蛋白分析儀層析柱反向安裝的應(yīng)用價(jià)值
    在學(xué)校誤服化學(xué)試劑,究竟誰的錯?
    萬蛇之島
    刺蛙的營救
    99热这里只有是精品50| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品一区二区三区人妻视频| 最近中文字幕2019免费版| h日本视频在线播放| 最近中文字幕2019免费版| 国内精品美女久久久久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| or卡值多少钱| 国产成人aa在线观看| 99热这里只有是精品50| 边亲边吃奶的免费视频| 日韩三级伦理在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 国产91av在线免费观看| 内射极品少妇av片p| 婷婷色麻豆天堂久久| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 天堂网av新在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 我的老师免费观看完整版| 久久久久久久久大av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 一级黄片播放器| 日韩一区二区视频免费看| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧洲日产国产| 少妇熟女欧美另类| 亚洲,欧美,日韩| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲内射少妇av| 免费观看的影片在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 中文字幕久久专区| 国产免费一级a男人的天堂| 97超视频在线观看视频| 午夜精品在线福利| 成人美女网站在线观看视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲综合色惰| 一级毛片久久久久久久久女| 一边亲一边摸免费视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜日本视频在线| 欧美bdsm另类| 亚洲自偷自拍三级| 一级二级三级毛片免费看| 91久久精品国产一区二区成人| 日本欧美国产在线视频| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩欧美国产在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产成人精品福利久久| 永久网站在线| av播播在线观看一区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 一级毛片电影观看| 成人午夜高清在线视频| 亚洲成人久久爱视频| 成人二区视频| 中文字幕制服av| 精品国内亚洲2022精品成人| 特级一级黄色大片| 欧美最新免费一区二区三区| 免费观看av网站的网址| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| av免费观看日本| 国产精品国产三级国产av玫瑰| av一本久久久久| 午夜亚洲福利在线播放| 精品久久久久久久末码| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 男人和女人高潮做爰伦理| 乱系列少妇在线播放| 成人性生交大片免费视频hd| 久久国内精品自在自线图片| 国产亚洲一区二区精品| 女人被狂操c到高潮| 亚洲精品第二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 老女人水多毛片| 久久久久久久大尺度免费视频| 中文字幕制服av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 免费黄色在线免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 午夜老司机福利剧场| av女优亚洲男人天堂| 久久草成人影院| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲丝袜综合中文字幕| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲成色77777| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 水蜜桃什么品种好| 久久草成人影院| 成人欧美大片| 久久亚洲国产成人精品v| h日本视频在线播放| 三级国产精品欧美在线观看| 国产一区二区三区av在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一夜夜www| 精品一区二区三区视频在线| 精品久久久久久成人av| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩视频在线欧美| 亚洲成色77777| 国产黄频视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 久久精品综合一区二区三区| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲欧美一区二区三区国产| 又爽又黄a免费视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲性久久影院| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲精品,欧美精品| 午夜激情久久久久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 高清日韩中文字幕在线| 欧美性感艳星| 亚洲图色成人| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲精品乱久久久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲国产精品成人综合色| 少妇熟女欧美另类| 日本av手机在线免费观看| 久久久色成人| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 嫩草影院精品99| 国产精品伦人一区二区| 大话2 男鬼变身卡| 免费观看无遮挡的男女| 青春草视频在线免费观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美97在线视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 嫩草影院新地址| 亚洲天堂国产精品一区在线| 男的添女的下面高潮视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产在线一区二区三区精| 人妻夜夜爽99麻豆av| 搡老乐熟女国产| 中文字幕制服av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 搞女人的毛片| 久久久成人免费电影| 日韩亚洲欧美综合| 国产一区二区三区综合在线观看 | 最新中文字幕久久久久| 国产成人aa在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品久久久久久精品电影| 麻豆成人午夜福利视频| 成年版毛片免费区| 久久久精品欧美日韩精品| 成人亚洲精品av一区二区| 国产午夜福利久久久久久| av在线天堂中文字幕| 亚洲人成网站在线播| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美高清性xxxxhd video| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久久免费精品人妻一区二区| 777米奇影视久久| 国产成人精品福利久久| 一级毛片电影观看| 99热这里只有精品一区| 久久久午夜欧美精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国产精品精品国产色婷婷| 成年av动漫网址| 精品一区二区三区人妻视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品人妻视频免费看| 国内精品宾馆在线| h日本视频在线播放| 夫妻午夜视频| 观看免费一级毛片| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久网色| av天堂中文字幕网| 亚洲最大成人av| 精品人妻一区二区三区麻豆| av国产免费在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩国内少妇激情av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久热久热在线精品观看| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲自偷自拍三级| 直男gayav资源| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲国产最新在线播放| 国内精品一区二区在线观看| 国产亚洲最大av| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日日啪夜夜撸| 高清欧美精品videossex| 国产伦在线观看视频一区| 美女黄网站色视频| 99热这里只有精品一区| 国产真实伦视频高清在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国产高清不卡午夜福利| 国产高清有码在线观看视频| 18+在线观看网站| 国产 亚洲一区二区三区 | 免费黄色在线免费观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品久久视频播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲欧洲日产国产| 精品久久久噜噜| 黄片wwwwww| 国产精品一区www在线观看| 三级经典国产精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 婷婷色av中文字幕| 午夜福利在线在线| 简卡轻食公司| 天堂中文最新版在线下载 | 免费观看的影片在线观看| 亚洲在久久综合| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩视频在线欧美| 久久久久久久久久黄片| 高清在线视频一区二区三区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久精品久久久久久久性| 国内精品美女久久久久久| av在线播放精品| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品伦人一区二区| 日本与韩国留学比较| 日本欧美国产在线视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 午夜福利视频精品| 国产午夜精品一二区理论片| 一级a做视频免费观看| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲自拍偷在线| 国产人妻一区二区三区在| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜免费观看性视频| www.色视频.com| 国产v大片淫在线免费观看| 男的添女的下面高潮视频| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜久久久久精精品| 大话2 男鬼变身卡| or卡值多少钱| 亚洲精品456在线播放app| 国产伦理片在线播放av一区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产高清有码在线观看视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久久久精品性色| www.av在线官网国产| 男女国产视频网站| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av国产免费在线观看| 国产精品一区www在线观看| 亚洲成色77777| 一夜夜www| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品久久国产蜜桃| 一级爰片在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产爱豆传媒在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 久久久国产一区二区| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日韩亚洲欧美综合| 九九在线视频观看精品| 国模一区二区三区四区视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 美女内射精品一级片tv| 伊人久久精品亚洲午夜| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 看黄色毛片网站| 97超视频在线观看视频| 在线观看人妻少妇| 色综合亚洲欧美另类图片| 婷婷色av中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲精品第二区| 1000部很黄的大片| 久久久久精品性色| 永久免费av网站大全| videossex国产| 大香蕉久久网| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久久久久久久久成人| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 91久久精品国产一区二区三区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久久久久伊人网av| 女人被狂操c到高潮| 日韩av不卡免费在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 大陆偷拍与自拍| 深爱激情五月婷婷| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一级二级三级毛片免费看| 99久久精品一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 免费av毛片视频| 一级av片app| 日日啪夜夜撸| 韩国av在线不卡| av在线蜜桃| 春色校园在线视频观看| 日本免费在线观看一区| 亚洲国产最新在线播放| 精品国产露脸久久av麻豆 | 亚洲欧美日韩东京热| or卡值多少钱| 欧美人与善性xxx| 听说在线观看完整版免费高清| 国产欧美日韩精品一区二区| 91久久精品国产一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 国产精品一及| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲综合精品二区| 亚洲精品一二三| 久久久久精品久久久久真实原创| 午夜激情久久久久久久| 嘟嘟电影网在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆 | 亚洲欧美清纯卡通| 中文字幕av在线有码专区| 深夜a级毛片| 久久韩国三级中文字幕| 精品一区二区三卡| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲最大成人手机在线| 在线播放无遮挡| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 人妻少妇偷人精品九色| 男女那种视频在线观看| 亚洲自拍偷在线| 精品久久久久久久末码| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产乱人视频| 免费观看性生交大片5| 亚洲在线自拍视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久午夜福利片| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲精品成人av观看孕妇| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 一级黄片播放器| 国产老妇女一区| 18禁在线播放成人免费| 日日啪夜夜爽| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美成人一区二区免费高清观看| 尾随美女入室| 国产成人免费观看mmmm| 青春草国产在线视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一级毛片久久久久久久久女| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲国产av新网站| 亚洲图色成人| 精品午夜福利在线看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 美女黄网站色视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品三级大全| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩av免费高清视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 色综合站精品国产| 日韩成人伦理影院| 亚洲欧美日韩卡通动漫| h日本视频在线播放| 一区二区三区免费毛片| 国产精品一区二区性色av| 精品一区二区三区视频在线| 男人舔奶头视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲精品一区蜜桃| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美潮喷喷水| 成人特级av手机在线观看| 国产亚洲精品av在线| or卡值多少钱| 伦精品一区二区三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲最大成人中文| 日日摸夜夜添夜夜爱| 波野结衣二区三区在线| av国产久精品久网站免费入址| 欧美区成人在线视频| 春色校园在线视频观看| 国产高潮美女av| 日韩 亚洲 欧美在线| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 免费av毛片视频| 国产免费又黄又爽又色| 色综合站精品国产| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 精品酒店卫生间| 国产精品久久视频播放| 欧美精品一区二区大全| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 18禁动态无遮挡网站| 欧美bdsm另类| 丝瓜视频免费看黄片| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产激情偷乱视频一区二区| 青春草亚洲视频在线观看| 岛国毛片在线播放| 一本久久精品| 不卡视频在线观看欧美| 我要看日韩黄色一级片| 日韩视频在线欧美| 国产精品av视频在线免费观看| 三级毛片av免费| 亚洲成色77777| 日本爱情动作片www.在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 尾随美女入室| av在线天堂中文字幕| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久韩国三级中文字幕| av在线蜜桃| 免费黄色在线免费观看| 日本午夜av视频| av黄色大香蕉| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产午夜精品一二区理论片| 91久久精品国产一区二区成人| 国产男女超爽视频在线观看| av女优亚洲男人天堂| 久久99蜜桃精品久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 午夜激情久久久久久久| 中国美白少妇内射xxxbb| 丝袜美腿在线中文| 成年女人看的毛片在线观看| 国产美女午夜福利| 哪个播放器可以免费观看大片| 中文在线观看免费www的网站| 久久久国产一区二区| 在线播放无遮挡| av卡一久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产中年淑女户外野战色| 男人舔女人下体高潮全视频| 日本一本二区三区精品| 激情五月婷婷亚洲| 欧美不卡视频在线免费观看| 日本一二三区视频观看| 日韩一本色道免费dvd| 如何舔出高潮| 日日撸夜夜添| 久久久欧美国产精品| 日本免费a在线| 波野结衣二区三区在线| 国产黄色视频一区二区在线观看| 我的老师免费观看完整版| 久久99热6这里只有精品| 99久久精品热视频| 久久这里有精品视频免费| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲欧美精品自产自拍| a级毛色黄片| 草草在线视频免费看| 男女那种视频在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲成人久久爱视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 少妇高潮的动态图| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品一区二区三区人妻视频| 嘟嘟电影网在线观看| 一级毛片 在线播放| 亚洲人成网站在线观看播放| 69av精品久久久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 日本wwww免费看| 国产色婷婷99| 久久6这里有精品| 精品一区二区三区人妻视频| 久久99热6这里只有精品| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品人妻久久久久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产成人福利小说| 少妇熟女aⅴ在线视频| 性色avwww在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 精品久久久久久成人av| 97在线视频观看| 国产精品.久久久| 国产亚洲精品久久久com| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲国产精品sss在线观看| 免费少妇av软件| 观看美女的网站| 国产午夜福利久久久久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 免费黄网站久久成人精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | eeuss影院久久| 国产色婷婷99| 色播亚洲综合网| 我的老师免费观看完整版| 欧美 日韩 精品 国产| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩国内少妇激情av| av女优亚洲男人天堂| 精品久久久久久久久亚洲| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 中国美白少妇内射xxxbb| 性色avwww在线观看| 精品人妻视频免费看| 成人美女网站在线观看视频| 久久精品久久精品一区二区三区| ponron亚洲| 久久精品国产亚洲av天美| 嫩草影院精品99| 插逼视频在线观看| 久热久热在线精品观看| 午夜激情久久久久久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 我的老师免费观看完整版| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲欧洲日产国产| h日本视频在线播放| 青春草国产在线视频| 日韩大片免费观看网站| 久久久久国产网址| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产午夜精品论理片| 国产在视频线精品| eeuss影院久久| 秋霞伦理黄片| av国产久精品久网站免费入址| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 免费黄频网站在线观看国产| 久久6这里有精品| 日韩一本色道免费dvd| 午夜久久久久精精品| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲电影在线观看av| 国产91av在线免费观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 永久网站在线| 国产精品蜜桃在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久精品久久久久久久性| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 黄色日韩在线| 久久99热6这里只有精品| 久久久久久久久大av|