金櫻根化學(xué)成分研究(Ⅰ)*

汪玉梅, 蘇賢君, 符 崖, 王志芳, 張翠仙

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

金櫻根化學(xué)成分研究(Ⅰ)*

汪玉梅, 蘇賢君, 符 崖, 王志芳, 張翠仙

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

前期研究表明廣東涼茶顆粒中三萜皂苷主要來(lái)源于崗梅和金櫻根。而目前對(duì)于金櫻根化學(xué)成分研究主要集中在金櫻子葉和果實(shí)，對(duì)其根化學(xué)成分研究鮮見(jiàn)報(bào)道?；诖?，該實(shí)驗(yàn)在前期基礎(chǔ)上采用正反相硅膠、凝膠等多種分離手段對(duì)金櫻根甲醇提取物的乙酸乙酯相化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離得到了6個(gè)化合物，采用現(xiàn)代波譜分析和文獻(xiàn)對(duì)照等方法鑒定其結(jié)構(gòu)分別為：2α, 3α, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、2α, 3β, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、2α, 3β, 19α, 23-四羥基烏蘇-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、齊墩果酸(4)、熊果酸(5)、(+)-兒茶素(6)?；衔?，2，3為首次從金櫻根中分離得到，且為廣東涼茶顆粒中三萜皂苷類(lèi)成分。

金櫻根；化學(xué)成分；三萜及其苷類(lèi)；結(jié)構(gòu)鑒定

金櫻根為薔薇科薔薇屬植物金櫻子RosalaevigataMichx.的根或根莖，其性平，味酸、澀，歸脾、肝、腎經(jīng)。具有收斂固澀、止血斂瘡、祛風(fēng)活血、止痛、殺蟲(chóng)等作用[1]。現(xiàn)今金櫻根是國(guó)家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)——廣東涼茶顆粒(王老吉)的主要原料之一，前期研究表明廣東涼茶顆粒中三萜皂苷主要來(lái)源于崗梅和金櫻根[2-4]，崗梅中三萜皂苷類(lèi)成分主要含有磺酸基，而金櫻根則以熊果烷及齊墩果烷型的五環(huán)三萜為主。對(duì)于金櫻根的文獻(xiàn)調(diào)研表明[5]，目前主要集中在金櫻子葉和果實(shí)的化學(xué)成分[6-8]，而對(duì)其根化學(xué)成分的研究主要是鞣質(zhì)類(lèi)成分[9]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)在前期基礎(chǔ)[10-12]上采用正反相硅膠、凝膠等多種分離技術(shù)對(duì)金櫻根甲醇提取物的乙酸乙酯相進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離得到了6個(gè)化合物，采用文獻(xiàn)對(duì)照以及現(xiàn)代波譜分析方法確定其結(jié)構(gòu)分別為：2α, 3α, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、2α, 3β, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、2α, 3β, 19α, 23-四羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、齊墩果酸(4)、熊果酸(5)、(+)-兒茶素(6)?；衔?，2，3為首次從金櫻根中分離得到，且為廣東涼茶顆粒中三萜皂苷類(lèi)成分。

圖1 從金櫻根乙酸乙酯相中分離得到的6個(gè)化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Six structures of compounds 1，2，3，4，5，6 from the roots of Rosa laevigata Michx

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

儀器：北京泰克光學(xué)儀器廠X-6型熔點(diǎn)儀(熔點(diǎn)未矯正)；旋光由德國(guó)POLARTRONIC H H W5 polarimeter (SCHMIDT+ HAENSCH，Germany) 測(cè)定；AVANCE AV 600 MHz、400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Finnigan公司LCQDECAXP)；旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器RE-5299(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；SHD-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；MODEL NH1006超聲儀(中國(guó)華南超聲設(shè)備廠)；電子分析天平(AUY120，廣州湘儀機(jī)電設(shè)備有限公司)；ODS為日本YMC公司產(chǎn)品(50 μm)；凝膠為Sephadex LH-20(日本YMC)；柱層析硅膠(200～300目)為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)。

HPLC-MSn用試劑：甲醇、水為色譜純(美國(guó)Sigma公司)實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由超純水設(shè)備制備(美國(guó)Milipore公司)；分離用溶劑：石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿等試劑均為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品(分析純)。

材料：金櫻根(產(chǎn)地：湖南；生產(chǎn)批號(hào)：110801；廣州致信中藥飲片有限公司)。

1.2 提取與分離

金櫻根(15 kg)，經(jīng)φ=80%甲醇/水浸漉提取，減壓回收甲醇，濃縮后得浸膏(2.306 kg)。浸膏用蒸餾水捏溶，依次用石油醚(PE)、乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，萃取液減壓濃縮得PE相(2 g)，EtOAc相(621.3 g)，n-BuOH相(682.0 g)和 H2O相(500 g)。

乙酸乙酯部位(621.3 g)進(jìn)行硅膠(200～300目)柱層析，先以石油醚-乙酸乙酯溶劑體系(V(PE)∶V(EtOAc)=9∶1,7∶3,5∶5,3∶7)洗脫，后以乙酸乙酯-甲醇溶劑體系(V(EtOAc)∶V(MeOH)=9∶1, 8∶2,7∶3,5∶5, 3∶7, 0∶1)洗脫，TLC跟蹤，得到16個(gè)流分(RL1至RL16)。流分RL-10經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=10∶1)和反相C18柱層析(V(MeOH)∶V(H2O)=4∶1)得到化合物1(20 mg)；流分RL-10經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=10∶1)，Sephadex LH-20(V(MeOH)∶V(H2O)=9∶1)和硅膠柱層析(V(CHCl3)∶V(EtOAc)∶V(Acetone)=5∶1∶2)得到化合物2(40 mg)；流分RL-13經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=11∶1) 和反相C18柱層析(V(MeOH)∶V(H2O)=1∶4)得到化合物3(24 mg)；流分RL-9經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=15∶1)，硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=10∶1)和Sephadex LH-20(V(MeOH)∶V(H2O)=9∶1)得到化合物4(5.5 mg)；流分RL-5經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(PE)∶V(EtOAc)=8∶2)和反相C18柱層析(V(MeOH)∶V(H2O)=3∶2)得到化合物5(30 mg)；流分RL-6經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(PE)∶V(EtOAc)=9∶1)和反相C18柱層析(V(MeOH)∶V(H2O)=3∶2)得到化合物6(15 mg)。

1.3 化合物物理常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)

化合物4：白色無(wú)定型粉末(MeOH),θmp307～309 ℃, ESI-MSm/z935[2M+Na]+, 479[M+Na]+; NMR(600 MHz, CD3OD)見(jiàn)表1和表2。

化合物5：白色無(wú)定型粉末(MeOH),θmp282～284 ℃, ESI-MSm/z935[2M+Na]+, 479[M+Na]+; NMR(600 MHz, CD3OD)見(jiàn)表1和表2。

表1 化合物1,2,3,4,5關(guān)鍵位置1H NMR數(shù)據(jù)

2 結(jié)果與討論

化合物1：白色針狀結(jié)晶(CHCl3-MeOH)，θmp230～232 ℃；φ=5%硫酸乙醇溶液顯藍(lán)色斑點(diǎn)，Libermann- Burchard和Molish反應(yīng)均為陽(yáng)性，暗示結(jié)構(gòu)為皂苷類(lèi)成分。ESI-MSm/z673 [M+Na]+，結(jié)合1H NMR、13C NMR和DEPT譜( 7個(gè)-CH3，9個(gè)-CH2，12個(gè)-CH和8個(gè)-C )確定化合物1分子式為C36H58O10，不飽和度為8。1H NMR共顯示7個(gè)-CH3信號(hào)峰，分別為δH0.90、1.03、1.20、1.24、1.36、1.60 (各 3H, s)和1.06 (3H, d,J=7.0 Hz)。另外δH5.38 (1H, br. s)及δC138.9(s)和128.0(d)說(shuō)明化合物1存在1個(gè)雙鍵。δC177.5 (s)提示含有羰基碳，除此外無(wú)任何不飽和度信息，提示該化合物可能為熊果烷型三萜。δH6.28 (1H, d,J=7.5 Hz)和δC95.7 (d)為一典型酯苷鍵中糖的端基信息，說(shuō)明1為含有1個(gè)糖的皂苷類(lèi)化合物。同時(shí)C-28化學(xué)位移值為δC177.5 (s)也暗示其為酯苷鍵。將1進(jìn)行酸水解，糖的GLC分析結(jié)果表明該化合物所含的糖為β-D-葡萄糖[19]。將1的NMR數(shù)據(jù)(表1和表2)與文獻(xiàn)[10,13]對(duì)照基本一致，確定1為2α, 3α, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。同時(shí)采用HPLC-MSn技術(shù)與廣東涼茶顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)此成分為廣東涼茶顆粒中含有，確定其來(lái)源為金櫻根[2-4,10]。

表2 化合物1,2,3,4,5的13C NMR數(shù)據(jù)

化合物2：白色針狀結(jié)晶(MeOH)，θmp219～221 ℃；φ=5%硫酸乙醇溶液顯藍(lán)色斑點(diǎn)，Libermann-Burchard和Molish 反應(yīng)均為陽(yáng)性，暗示結(jié)構(gòu)為皂苷類(lèi)成分。比較化合物2與1的MS和NMR 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)二者基本一致。僅C-3的化學(xué)位移值明顯向低場(chǎng)移動(dòng)5.5外 [2：δC84.4 (d, C-3)；1：δC78.9 (d, C-3)]不同，說(shuō)明二者為C-3位差異的一對(duì)異構(gòu)體。將2的NMR數(shù)據(jù)(表1和2)與文獻(xiàn)[10, 14]對(duì)照基本一致，故確定2為2α, 3β, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。同時(shí)采用HPLC-MSn技術(shù)與廣東涼茶顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)此成分為廣東涼茶顆粒中含有，確定其來(lái)源為金櫻根[2-4,10]。

化合物3：白色粉末(CHCl3-MeOH)，θmp271～272 ℃，φ=5%硫酸乙醇溶液顯藍(lán)色斑點(diǎn)，Libermann-Burchard和Molish 反應(yīng)均為陽(yáng)性，暗示結(jié)構(gòu)亦為皂苷類(lèi)成分。ESI-MSm/z: 689 [M+Na]+；結(jié)合NMR(6個(gè)-CH3，10個(gè)-CH2，12個(gè)-CH和8個(gè)-C) 確定3分子式為C36H58O11，不飽和度為8。NMR中給出典型熊果烷甲基質(zhì)子信息(δH0.69, 0.76, 1.22, 1.28, 1.35 (各 3H, s)和1.06 (3H, d,J=3.2 Hz))和12,13位三取代雙鍵(δH5.48 (1H, br. s)及δC138.8 (s)和128.9 (d))。同時(shí)δH5.35 (1H, d,J=7.0 Hz)和δC96.0 (d)為一典型酯苷鍵中糖的端基信息，說(shuō)明3也為含有1個(gè)糖的三萜皂苷。將3的NMR數(shù)據(jù)與2對(duì)照，二者數(shù)據(jù)基本一致，只是少了一個(gè)甲基信息[δC29.6 (q, C-23)]而增加了一個(gè)羥甲基信息[δC67.1(t, C-23)]。將3的NMR數(shù)據(jù)(表1和2)與文獻(xiàn)[10,13]對(duì)照基本一致，故確定3為2α,3β,19α,23-四羥基烏蘇-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。同時(shí)采用HPLC-MSn技術(shù)與廣東涼茶顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)此成分為廣東涼茶顆粒中含有，確定其來(lái)源為金櫻根[3-4,6]。

化合物4：白色無(wú)定型粉末(MeOH)，θmp307～309 ℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)陽(yáng)性，提示該化合物可能為三萜或甾體類(lèi)化合物。ESI-MS 給出m/z935[2M+Na]+，479[M+Na]+，13C NMR譜可見(jiàn)30個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合相對(duì)分子質(zhì)量可推出化合物4的分子式為C30H48O3，不飽和度為7。1H NMR譜高場(chǎng)區(qū)可觀察到7個(gè)-CH3信號(hào)峰，分別為δH0.74，0.76，0.88，0.91，0.92，0.98，1.13 (均為3H, s)，都為單峰，故推測(cè)4為齊墩果烷型母核。NMR中給出4結(jié)構(gòu)中還含有一個(gè)三取代雙鍵(δH5.24(1H, t,J=3 Hz)；δC142.2(s), 121.8(d))、一個(gè)連氧次甲基(δH3.22(1H, m)；δC78.2(s))和一個(gè)羧基(δC181.7(s))。將4的NMR數(shù)據(jù)(表1和2)與齊墩果酸對(duì)照基本一致[15-16]，故確定4為齊墩果酸。

化合物5：白色無(wú)定型粉末(MeOH)，θmp282～284 ℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)陽(yáng)性，提示該化合物可能為三萜或甾體類(lèi)化合物。ESI-MS 給出m/z935[2M+Na]+，479[M+Na]+，13C NMR譜可見(jiàn)30個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合相對(duì)分子質(zhì)量得出5的分子式為C30H48O3，不飽和度為7。1H NMR譜高場(chǎng)區(qū)可觀察到7個(gè)-CH3信號(hào)峰，分別為δH0.79，0.83，0.94，0.97，1.01，1.11 (均為3H, s)和0.88(3H, d,J=7 Hz)，提示化合物5亦為三萜類(lèi)化合物，由于存在一個(gè)雙重峰的甲基信號(hào)，推測(cè)是熊果烷型母核。NMR信息提示結(jié)構(gòu)中還存在一個(gè)三取代雙鍵(δH5.28(1H, t,J=5 Hz)；δC138.9(s), 126.1(d))，一個(gè)連氧次甲基(δH3.23(1H, m)；δC79.5(d))和一個(gè)羧基(δC181.4(s))。將其N(xiāo)MR數(shù)據(jù)(表1和2)與熊果酸對(duì)照基本一致[17]，故鑒定5為熊果酸。

化合物6：黃色無(wú)定型粉末(MeOH)，θmp94～95 ℃，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)和濃硫酸-香草醛均為陽(yáng)性說(shuō)明結(jié)構(gòu)中既含有酚羥基又含有飽和醇羥基。結(jié)合ESI-MSm/z289[M-H]-和NMR譜(15個(gè)碳：1個(gè)-CH2，7個(gè)-CH和7個(gè)-C)信息，確定6的分子式為C15H14O6，不飽和度為9。1H NMR譜中δH6.84 (1H, d,J=2.0 Hz)，6.72 (1H, dd,J=8.0, 1.6 Hz)和6.76 (1H, d,J=8.0 Hz)顯示其為芳香結(jié)構(gòu)中ABX偶合系統(tǒng)質(zhì)子信息。δH5.93 (1H, d,J=2.0 Hz)和5.86 (1H, d,J=2.0 Hz)為苯環(huán)上間位偶合質(zhì)子信號(hào)。δH4.57 (1H, d,J=7.2 Hz)和3.98 (1H, m)為2個(gè)飽和連氧碳上的質(zhì)子信號(hào)。另外高場(chǎng)區(qū)有一對(duì)偕偶質(zhì)子信號(hào)：δH2.85 (1H, dd,J=16.0, 5.2 Hz)和2.51 (1H, dd,J=16.0, 8.0 Hz)，說(shuō)明6為二氫黃酮類(lèi)化合物。將6的NMR數(shù)據(jù)與(+)-兒茶素對(duì)比[18]，二者基本一致，故鑒定化合物6為(+)-兒茶素。

致謝：感謝中山大學(xué)分析測(cè)試中心關(guān)山越、李瑋、姚俊華、陳曉紅老師等在結(jié)構(gòu)鑒定中給予的支持。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典(上冊(cè))[M]. 上海：人民衛(wèi)生出版社, 1977:1407.

[2] 楊運(yùn)云, 鄧潔薇, 余彥海, 等. 王老吉廣東涼茶顆粒的超高相液相色譜指紋圖譜研究[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2012, 31(5):613-617.

[3] DENG J W, FAN C L, JIANG Z G, et al. Quality assessment and origin tracing ofGuangdongLiangchagranules using direct mass spectrometry finger printing [J]. Analytical Methods, 2012, 4: 3638-3645.

[4] 王志芳. 廣東涼茶顆粒物質(zhì)基礎(chǔ)及指紋圖譜研究[D]. 廣東：廣州中醫(yī)藥大學(xué), 2013.

[5] 劉佩沂, 田素英, 黃文英. 金櫻根研究進(jìn)展[J]. 海峽藥學(xué), 2010, 22(1): 98-100.

[6] ZHANG Na, SHEN Yang, LI Lingzhi, et al. Anti-inflammatory triterpenes from the leaves ofRosalaevigata[J]. J Nat Prod, 2011, 74: 732-738.

[7] GAO Pingyi, LI Lingzhi, PENG Ying, et al. Triterpenes from fruits fromRosalaevigata[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2010, 38: 457-459.

[8] LI Xi, CAO Wei, SHEN Ying, et al. Antioxidant compounds fromRosalaevigatafruits[J]. Food Chemistry, 2012, 130: 575-580.

[9] YOSHIDA Takashi, TANAKA Katsumi, CHEN Xinmin, et al. Tannins of rosaceous medicinal plants. Ⅴ. hydrolyzable tannins with dehydrodigalloyl group fromRosalaevigataMichx. [J]. Chem Pharm Bull, 1989, 34(4): 920-924.

[10] 王志芳, 符崖, 向俊, 等. 廣東涼茶顆粒苷類(lèi)化學(xué)成分研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013, 52(2)：79-83.

[11] 孫彩云, 王志芳, 蘇賢君, 等. 廣東涼茶顆粒中芳香酚酸類(lèi)化學(xué)成分研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2014, 53(4)：88-93.

[12] 蘇賢君, 王志芳, 雷玲芳, 等. 廣東涼茶顆粒中苷類(lèi)成分的化學(xué)研究Ⅱ[J]. 中藥材, 2015, 38(1)：160-162.

[13] TAKASHI S, TAKASHI T, OSAMU T, et al. β-Glucosyl esters of 19α-hydroxyursolic acid derivatives in leaves ofRubusspecies [J]. Phytochemistry, 1984, 23 (12)：2829-2834.

[14] ZHOU X H, KASAI R, OHTANI K, et al. Oleanane and ursane glucosides fromRubusspecies[J]. Phytochemistry, 1992, 31 (10)：3642-3644.

[15] 葉蘋(píng), 茅青, 郭永紅, 等. 中藥金櫻子三萜類(lèi)化合物的分離鑒定[J]. 貴陽(yáng)中醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào), 1993, 15(4)：62-64.

[16] 董濤. 中藥金櫻葉的化學(xué)成分研究[D]. 上海：第二軍醫(yī)大學(xué), 2009.

[17] 高迎, 李強(qiáng), 龔衛(wèi)紅, 等. 金櫻子化學(xué)成分的研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 31(2)：110-111.

[18] 朱向東, 徐波, 王飛. 沙針的化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2009, 21：956-959.

[19] ZHANG Cuixian, ZHANG Dongmei, CHEN Minfeng, et al. Antiproliferative triterpenoid saponins from the stem ofPsychotriasp.[J]. Planta Medica, 2013, 79:978-986.

The chemical constituents from the roots ofRosalaevigataMichx. (Ⅰ)

WANGYumei,SUXianjun,FUYa,WANGZhifang,ZHANGCuixian

(School of Chinese Material Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

Previous experiments showed that triterpenoid saponins ofGuangdongLiangchawere mainly from the roots ofilexasprellaandRosalaevigataMichx.. However, chemical constituents mainly focus on leaves and fruits ofRosalaevigataMichx., and the secondary metabolites from the roots ofRosalaevigataMichx. were very few published. So, on the basis of previous study, six compounds were isolated from the roots ofRosalaevigataMichx. by various chromatographic techniques and their structures were identified by spectroscopic analysis and literature confrontation method, such as 2α, 3α, 19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid β-D- glucopyranosyl ester(1), 2α, 3β, 19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester (2), 2α, 3β, 19α, 23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester(3), oleanolic acid(4), ursolic acid(5), (+)-catechin(6). Compounds 1，2，3 as triterpenoid saponins in Guangdong Liangcha have been firstly obtained from the roots ofRosalaevigataMichx..

RosalaevigataMichx.; chemical constituents; triterpenoid saponins; structural identification

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.02.014

2015-10-05

廣東省科技計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2010A03010003); 廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題資助項(xiàng)目(001)；2015年高水平大學(xué)建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2050205)

汪玉梅(1978年生),女； 研究方向:方劑配伍規(guī)律；通訊作者: 張翠仙;E-mail:zhangcuixian@aliyun.com

O629.7;R284.2

A

0529-6579(2016)02-0076-06