EGB761對人子宮頸癌Siha細胞株的促凋亡作用

陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院(咸陽712000)　洪玉鋒　 孫　蓓

?

EGB761對人子宮頸癌Siha細胞株的促凋亡作用

陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院(咸陽712000)洪玉鋒 孫蓓

摘要目的：研究銀杏葉提取物EGB761對人子宮頸癌Siha細胞的促凋亡作用。方法：EGB761干預人子宮頸癌Siha細胞后，CCK-8觀察 50、100 和200 mg/L不同濃度EGB761作用下人子宮頸癌Siha細胞的增殖狀況，流式細胞儀分析用AnnexinV-FITC和PI雙染檢測不同濃度EGB761對人子宮頸癌Siha細胞凋亡的影響。結果： EGB761可抑制人子宮頸癌Siha細胞的增殖，呈濃度和時間依賴性反應；EGB761 100 mg/L、200 mg/L干預人子宮頸癌Siha細胞后，流式細胞儀檢測顯示細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。結論：EGB761可誘導人子宮頸癌Siha細胞凋亡。

主題詞子宮頸腫瘤銀杏葉細胞凋亡@EGB761@Siha細胞株

迄今為止，子宮頸癌仍是排第二位的婦科腫瘤，是導致婦女死亡的主要惡性疾病之一。Siha細胞屬于鱗癌細胞株的其中常見的一類，其染色體中有基因組整合的人乳頭狀瘤病毒(HPV)16，所以被經(jīng)常用來研究宮頸癌。銀杏葉是臨床常用的心血管疾病藥物，其主要功效是化濁降脂、活血化瘀、斂肺平喘、通絡止痛[1]。其純化由德國Schwabe制藥公司于20世紀完成，產(chǎn)品編號為EGB761，不僅如此，該公司還進一步對其標準的制定進行了研究，對銀杏葉的廣泛應用及應用標準起到了很大的作用。EGB761能提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，并對自由基的清除有一定作用，可能與其24%的黃酮苷和6%的萜內(nèi)酯有一定相關性。近年來有學者研究發(fā)現(xiàn)EGB761可以抑制腫瘤的生長速度，其作用及機制可能與促進腫瘤細胞的凋亡相關，并進一步借此對腫瘤進行實驗治療[2]。人子宮頸癌被認為是危害婦女身體的最嚴重的疾病之一，臨床對其治療效果并不十分理想，如何抑制其腫瘤細胞的生長成為現(xiàn)階段的研究熱點之一。本實驗擬通過觀察EGB761對Siha細胞有無凋亡作用，判定EGB761抑制腫瘤的作用，為臨床EGB761對宮頸癌的治療提供實驗室數(shù)據(jù)支持。

材料與方法

1材料南京博瑞公司購買銀杏葉提取物EGB761，用DMSO稀釋成所需濃度；碧云天生物技術研究所購買細胞凋亡與壞死檢測試劑盒；細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；武漢博士德生物工程有限公司購買標準胎牛血清、胰蛋白酶溶液、DMEM高糖液體培養(yǎng)基和細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒。

2方法①細胞培養(yǎng)：宮頸癌細胞珠 Siha分別用MEM、RPMI-1640 完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；在 37 ℃ 室溫，5% CO2恒溫箱孵育；取對數(shù)生長期細胞實驗。②CCK-8 檢測抑制細胞增值率：宮頸癌Siha細胞珠制成懸液(對數(shù)生長期)，96孔板接種，100 μl/孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h(37 ℃、5% CO2)；每孔加EGB761(0.5 mg/ml)12、20、30、40、50 μl， 5 孔重復；對照組為等量的DMSO；空白孔調(diào)零；12、24、48 h分別處理，加入10 μl/孔CCK-8，4 h；空白對照調(diào)零，各孔吸光度(OD)值檢測(酶標儀450 nm波長)，測 3 次，取平均值，公式如下：細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%計算抑制率。③流式細胞儀膜聯(lián)蛋白V、異硫氰酸熒光素和碘化丙啶雙染檢測凋亡率：采取對數(shù)生長期的宮頸癌Siha細胞珠制成懸液，接種于96孔板，每孔100 μl/孔；24 h培養(yǎng)箱培養(yǎng)(條件37 ℃、5% CO2)，EGB761(0.5 mg/ml)分別加12、20、30、40、50 μl， 5 孔重復，置冰??；細胞懸液中加入AnnexinV-FITC和PI各5 μl；4 ℃避光染色15 min；流式細胞儀進行檢測，計算細胞凋亡的百分比(緩沖液混懸細胞補充至500μl)。

結果

1CCK- 8 檢測細胞增殖活性見表1。與對照組相比，小劑量EGB761(50 mg/L)對Siha細胞的增殖影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而中、大劑量EGB761(100和 200 mg/L)作用 12 h、24 h、48 h，抑制了宮頸癌細胞珠 Siha細胞的增殖(P<0.01)，并與濃度與作用時間成正相關(P<0.05)。

表1　倍增劑量EGB761倍增時間Siha

注：與對照組比較，*P<0.05

2利用流式細胞儀Annexin-VFITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率見表2。與對照組比較，EGB761(50 mg/L)作用后無變化(P>0.05)，EGB761(100、200 mg/L)能夠增加Siha細胞的凋亡率。并與濃度的增高呈現(xiàn)劑量依賴關系(P<0.01)。

表2　不同濃度EGB761誘導Siha細胞凋亡

注：與對照組比較，*P<0.05

討論

EGB761是從銀杏葉中經(jīng)多個步驟分離、純化而提取出的一種標準化的銀杏葉提取物制劑，實驗證明EGB761能夠抑制腫瘤血管的形成，其機制可能與增強機體抗氧化能力有關[3]。而且，腫瘤的發(fā)生理論認為，其生長不僅與體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生有關，而且還和氧自由基的清除障礙密切相關[4]。相關研究還證明，EGB761不僅能夠?qū)α馨图毎€粒體脫氫酶的活性有增強作用，還能增加中性粒細胞過氧化酶的釋放，通過這樣的機制，提高機體細胞的免疫功能，進而對腫瘤的生長起抑制作用，并且與作用的時間以及濃度正相關[5]。根據(jù)現(xiàn)代腫瘤的發(fā)生理論，細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了不可替代的作用，凋亡是生命的基本特征之一，細胞凋亡受阻與腫瘤的發(fā)生有很大關系[6]。對于細胞的增殖的抑制及促進凋亡可以對腫瘤的生長起抑制作用。而多項實驗研究結果均顯示EGB761能夠完成上述作用。原因可能有以下幾個方面：①銀杏總黃酮有清除氧自由基的活性，有實驗發(fā)現(xiàn)銀杏葉能夠抑制人肝癌HepG2細胞的增殖，其原因正是通過誘導細胞調(diào)亡來完成的[7]；②黃酮類化合物能夠阻礙腫瘤組織中的脂肪物質(zhì)的合成，利用該機制使瘤細胞凋亡數(shù)目增多，從而降低腫瘤生長速度[8]，該理論也通過實驗得到證實，有研究證明EGB761可以抑制人乳腺癌及前列腺癌細胞系中的FAS；③P53基因與腫瘤的發(fā)生密切相關，有實驗證明EGB761可以提高該基因的表達，通過升高癌細胞的凋亡率降低腫瘤的生長速度[9-10]。

本實驗結果表明，EGB761能夠有效誘導宮頸癌相關Siha細胞株的凋亡，從而達到抑制宮頸癌發(fā)生發(fā)展的速度并與劑量以及時間呈正相關。為臨床宮頸癌的治療新思路提供了循證學證據(jù)。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：296-297.

[2]Bi J，Guo AL，Lai YR，etal. Overexpression of clusterin correlates with tumor progression，metastasis in gastric cancer：a study on tissue microarrays[J].Neoplasma，2010，57：191-197.

[3]肖茜，王超，易秀莉，等.銀杏葉提取物對氧化應激損傷黑素細胞的影響[J].陜西中醫(yī)，2013，34(5)：624-626.

[4]Redondo M，Rodrigo I，Alcaide J，etal.Clusterin expression is associated with decreased disease-free survival of patients with colorectal carcinomas[J].Histopathology，2010，56：932-936.

[5]Girard FP，Byrne J，Downes M，etal.Detecting solube clusterin in vitro and in vivo models of prostate cancer[J].Neoplasma，2010，57：488-493.

[6]Watari H，Kinoshita R，Han Y，etal.Prognostic significance of clusterin expression in advanced stage cervical cancer treated with curative intended radiotherapy[J]. Gynecological Cancer，2011，29：581-587.

[7]Park SG， Jung S，Ryu HH，etal. Role of 14-3-3-beta in the migration and invasion in human malignant glioma cell line U87MG[J].Neurol Res，2012，34(9)：893-900.

[8]Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，etal.Quercetin inhibits invasion， migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line (PC-3)[J]. Cell Biochem Funct，2011，29(2)：87-95.

[9]Pradhan SJ，Mishra R，Sharma P，etal.Quercetin and sulforaphane in combination suppress the progression of melanoma through the down-regulation of matrix metalloproteinase-9[J].Exp Ther Med， 2010，1(6)：915-920.

[10]Lamoureux F，Thomas C，Yin MJ，etal.Clusterin inhibition using OGX-011 synergistically enhances Hsp90 inhibitor activity by suppressing the heat shock response in castrate resistant prostate cancer[J].Cancer Research，2011，71(17)：5838-5849.

(收稿：2015-05-11)

Effection of EGb 761 to apoptosis of cervical carcinoma siha cell in vitro

The Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712000)

Hong YufengSun Bei

ABSTRACTObjective：To explore the contribution of EGB761 to the proliferation and apoptosis of Cervical Carcinoma Siha cell in vitro. Methods：CCK-8 assay was used to measure 50、100 and 200 mg/L which its effects on the proliferation of Cervical Carcinoma Siha cell cultured with different concentrations of allicin for 12 h，24 h，48 h，AnnexinV-FITC and PI assay by flow cytometer (FCM) were applied to detect the apoptosis induced by EGB761.The changes of cell cycle were detected by FCM. Results：EGB761 suppressed the proliferation of Cervical Carcinoma Siha cell in a concentration-and time-dependent manner EGB761 induced cellular apoptosis of the Cervical Carcinoma Siha cell in a concentration-dependent manner.With EGB761 100，200 mg/L intervention Cervical Carcinoma Siha cell， flow cytometer (FCM) test showed that the cell apoptosis rate increased significant (P<0.01). Conclusion：EGB761 significantly suppresses the growth of Cervical Carcinoma Siha cell， induces the apoptosis of Cervical Carcinoma Siha cell. Therefore resveratrol may be considered as a possible treatment medicine for Cervical Carcinoma .

KEY WORDSUterine cervical neoplasmsFolium ginkgoApoptosis@EGB761@Siha cell

【中圖分類號】R737.33

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.008