辛伐他汀對大鼠成骨細(xì)胞骨形成蛋白2及其信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad1和Smad5表達(dá)的影響*

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院(西安710004)　高陶磊　李蘊(yùn)聰　崔　敏　李曉紅

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辛伐他汀對大鼠成骨細(xì)胞骨形成蛋白2及其信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad1和Smad5表達(dá)的影響*

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院(西安710004)高陶磊李蘊(yùn)聰崔敏李曉紅▲

摘要目的：研究辛伐他汀對成骨細(xì)胞骨形成蛋白2(BMP-2)及其信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Sma和Mad相關(guān)蛋白(Smad)1、5表達(dá)的影響，探討該藥物影響成骨的可能機(jī)制。方法：組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞，傳代純化后用鈣鈷法染色鑒定。對照組S0無藥物干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組選用含不同濃度[10-8(S1組)、10-7(S2組)、5×10-7(S3組)、10-6(S4組) mol/L]辛伐他汀培養(yǎng)液對傳代的成骨細(xì)胞進(jìn)行72 h干預(yù)，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)測得BMP-2、Smad1、Smad 5 mRNA相對表達(dá)量，使用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以得出不同濃度藥物對BMP-2及其信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的影響。結(jié)果：BMP-2、Smad1、Smad5 mRNA相對表達(dá)量均隨藥物濃度(0、10-8、10-7、5×10-7、10-6mol/L)增高而增加。三者在辛伐他汀濃度為10-6mol/L時(shí)表達(dá)量均最高。各組數(shù)據(jù)兩兩比較除Smad5表達(dá)量在對照組S0與S1組間，S3與S4組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，各實(shí)驗(yàn)組與對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：辛伐他汀能在一定劑量范圍上調(diào)BMP-2的表達(dá)，可能與誘導(dǎo)BMP-2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad1、Smad5 mRNA的表達(dá)相關(guān)。

主題詞成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類Smad蛋白@辛伐他汀

近年對降脂藥辛伐他汀的研究顯示，其在離體及骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型體內(nèi)均有刺激成骨作用[1]。牙種植體成功主要取決于種植體-骨界面的形成，而辛伐他汀可在種植修復(fù)過程中局部誘導(dǎo)成骨，加快骨整合[2]。這一作用伴隨成骨細(xì)胞內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)基因表達(dá)的增強(qiáng)，而他汀類藥物可通過多條途徑、多個(gè)連鎖環(huán)節(jié)促進(jìn)BMP-2的表達(dá)[3]，其復(fù)雜的藥物作用機(jī)制成為一個(gè)新的研究領(lǐng)域。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究辛伐他汀對BMP-2及其關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Sma和Mad相關(guān)蛋白(Sma-and Mad-related protein，Smad)1和5的影響，探討該藥物發(fā)揮成骨效應(yīng)時(shí)可能的作用位點(diǎn)及機(jī)制，為該藥物促進(jìn)成骨作用的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1材料出生24 h以內(nèi)健康SD雌性乳鼠6只，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。達(dá)爾伯克改良伊格爾最低必需培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco，USA)，胎牛血清 (杭州四季青生物制品有限公司)，胰蛋白酶(1∶400)(Gibco，USA)，雙抗(青霉素100 000 IU/L，鏈霉素100 000 IU/L)(Amresco，USA)。辛伐他汀原料藥(浙江江北藥業(yè))，二甲基亞砜(Amresco，USA)。細(xì)胞總RNA快速提取試劑盒RNAfast2000(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑(Fermentas生物試劑公司，立陶宛)。

2方法①成骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)及純化鑒定：SD乳鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡5 min后，移入超凈工作臺(tái)中，無菌條件下分離顱骨，將收集到的骨組織仔細(xì)剪成1.0 mm×1.0 mm的骨片，用牙科探針將骨片小心送入培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)瓶底預(yù)鋪一薄層胎牛血清)，進(jìn)行原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)24～48h后待較多的細(xì)胞游出貼壁生長后更換培養(yǎng)液，此后2～3d更換培養(yǎng)液1次。原代細(xì)胞貼壁生長鋪滿瓶底時(shí)加入0.25%胰蛋白酶1 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)1 ml消化傳代，并于倒置顯微鏡下觀察消化傳代情況。由于成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差別，實(shí)驗(yàn)采用差速黏附進(jìn)行成骨細(xì)胞純化，將原代成骨細(xì)胞和混雜其中的少量成纖維細(xì)胞接種于25 ml無菌培養(yǎng)瓶中，靜置10 min左右，輕取上清液加至另1個(gè)培養(yǎng)瓶中，靜置10 min，將上清液移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，除去黏附較快的成纖維細(xì)胞，從而達(dá)到純化成骨細(xì)胞的目的。成骨細(xì)胞的鑒定選用實(shí)驗(yàn)獲得的第3代成骨細(xì)胞。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及生長情況，并檢測成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性及礦化結(jié)節(jié)染色情況。每張玻片按區(qū)域(通常是左上、左下、右上、右下)隨機(jī)選取4個(gè)視野細(xì)胞計(jì)算ALP陽性率。②成骨細(xì)胞BMP-2和Smad1、5mRNA表達(dá)量測定：在培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中分別加入濃度為0(S0組)、10-8(S1組)、10-7(S2組)、5×10-7(S3組)、10-6(S4組) mol/L的辛伐他汀，S0組加入相同劑量溶劑二甲基亞砜作為對照組。更換培養(yǎng)液時(shí)統(tǒng)一對細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)72 h后，RNAfast2000快速提取細(xì)胞總RNA，設(shè)計(jì)引物(北京奧科生物技術(shù)有限公司合成)(表1)，選取β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，以RT-PCR方法分別檢測BMP-2 mRNA以及Smad1、5 mRNA的表達(dá)量，取5μl PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以HBI Marker A標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量為參照，用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，即以BMP-2、Smad1、5反應(yīng)條帶的積分吸光度比值(IA值)表示其mRNA的相對表達(dá)水平，確定數(shù)值的方法為：目的基因相對表達(dá)水平=(目的基因灰度值-背景灰度值)/(內(nèi)參基因灰度值-背景灰度值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)，對各組BMP-2、Smad1、Smad5 mRNA進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)一步使用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(雙側(cè))為α=0.05。

表1　反轉(zhuǎn)錄RT-PCR引物設(shè)計(jì)序列

結(jié)果

1成骨細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定結(jié)果倒置顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)豐富，有黑色顆粒，單個(gè)核，細(xì)胞有聚集成團(tuán)的特性，呈三角形、多角形、呈較典型的成骨細(xì)胞形態(tài)。傳代后細(xì)胞形態(tài)基本不變，細(xì)胞間以突起相連，鋪滿瓶底時(shí)緊湊密排呈鋪路石狀(圖1)。鈣鈷法染色顯示細(xì)胞內(nèi)有棕黑色細(xì)微顆粒，ALP染色陽性。計(jì)算出ALP陽性率均在95%以上(圖2)，證實(shí)獲得細(xì)胞為成骨細(xì)胞。

圖1　生長活性良好的成骨細(xì)胞(倒置相差顯微鏡×200)

圖2　3代成骨細(xì)胞(ALP鈣鈷法染色陽性×400)

2RT-PCR結(jié)果見表2。各濃度組成骨細(xì)胞內(nèi)BMP-2及其信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad1、Smad5 mRNA在辛伐他汀作用下，表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的增加。其中BMP-2 mRNA表達(dá)隨藥物濃度升高而增加，任兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad1 mRNA與BMP-2的mRNA表達(dá)趨勢一致，隨辛伐他汀濃度的升高而表達(dá)量顯著增高，任兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Smad5 mRNA表達(dá)也有隨藥物濃度升高而增加的趨勢(P<0.01)，但對照組與S1組、S3與S4組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2　不同濃度辛伐他汀對BMP-2及其信號(hào)蛋白

討論

BMP-2是能增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和骨組織形成的細(xì)胞因子[4]。BMP-2屬轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員，具有活性較高和能單獨(dú)誘導(dǎo)骨形成的特性，能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增加成骨細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)，最終促進(jìn)骨形成[5]。細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)化生長因子β與BMP蛋白，TGF-β/BMP與適宜的受體結(jié)合后可激活其在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，在下游信號(hào)的傳導(dǎo)過程中Smads蛋白是最重要的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)[6]。大多數(shù)研究已證實(shí)，辛伐他汀可特異刺激體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞BMP-2基因高表達(dá)，增加骨組織的形成，但引起B(yǎng)MP-2表達(dá)增加信號(hào)的傳導(dǎo)機(jī)制目前尚存爭議。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測了藥物對BMP-2信號(hào)傳導(dǎo)途徑中最關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad1和Smad5的影響，結(jié)果顯示辛伐他汀可能通過增加Smad1和Smad5信號(hào)蛋白基因表達(dá)，從而放大BMP-2的信號(hào)傳遞[7]，引起其靶基因核心結(jié)合因子α1和一系列產(chǎn)物的表達(dá)量增加，最終促進(jìn)成骨效應(yīng)。并且隨著辛伐他汀濃度的增加，BMP-2及其信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad1和Smad5 mRNA的表達(dá)量均呈上升趨勢，進(jìn)一步說明Smad1和Smad5的表達(dá)量增加可能與BMP-2及其產(chǎn)物表達(dá)量增大相關(guān)。已有研究顯示，辛伐他汀作用于Smad蛋白相關(guān)降解調(diào)節(jié)分子(Smurf1)，對其產(chǎn)生抑制作用，從而抑制Smurf1對Smad1和Smad5的降解，使Smad1和Smad5的表達(dá)量得以增加。對于辛伐他汀能否特異性抑制Smad6(受體抑制型Smad蛋白)對Smad1，5信號(hào)傳遞的阻斷作用，Horiki等[8]認(rèn)為可能在信號(hào)傳遞早期Smad6與骨形成蛋白受體I(BMPR-I)結(jié)合，抑制BMP-2活性的能力較強(qiáng)，導(dǎo)致Smad1、5蛋白表達(dá)減少，隨著辛伐他汀濃度的增大，Smad1、5蛋白的降解減少或Smad6的抑制作用減弱，Smad1、5蛋白表達(dá)逐漸增多。此外，由Smad信號(hào)蛋白介導(dǎo)的BMP傳導(dǎo)途徑還與一些經(jīng)典信號(hào)途徑間存在交叉，持久的信號(hào)調(diào)節(jié)，如促分裂素原活化蛋白激酶，MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑[9]和Wnt信號(hào)通路。BMP-2的表達(dá)量變化是否與這些信號(hào)通路存在聯(lián)系尚待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示不同濃度辛伐他汀具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞BMP-2表達(dá)量增加，促進(jìn)骨形成的作用，并且這一作用伴隨著BMP-2信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad1和Smad5表達(dá)量的增加。三者表達(dá)量的增加對辛伐他汀均有一定的劑量依賴性，作用于細(xì)胞的辛伐他汀最低有效劑量不應(yīng)小于10-8mol/L，同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變化趨勢提示過高濃度的辛伐他汀可能對成骨效應(yīng)的增長趨勢有一定的抑制作用。不僅證明了辛伐他汀誘導(dǎo)成骨效應(yīng)的原因在于促使成骨細(xì)胞內(nèi)BMP-2表達(dá)量的增加，更說明了辛伐他汀的作用機(jī)制可能與影響信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad1和Smad5的表達(dá)相關(guān)，間接促進(jìn)了BMP-2的信號(hào)傳導(dǎo)和成骨效應(yīng)相關(guān)的靶基因及其產(chǎn)物的表達(dá)。

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(收稿：2015-05-22)

Effects of simvastatin on bone morphogenetic protein-2 and the signal transduction protein(Smad1/5) expression in the osteoblast of rats

Stomatological Hospital， Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Gao TaoleiLi YuncongCui Minet al

ABSTRACTObjective：To investigate the possible mechanism of simvastatin， a cardiovascular system agent，which has been found a promotive effects in bone formation by inducing the differentiation and proliferation of osteoblast， involving bone morphogenetic protein-2(BMP-2)， and its signal transducer: sekclsky mothers against dpp 1 and 5 (Smad1， and Smad5). Methods：A continuous tissue cultivation method was used to separate and cultivate primary osteoblasts from cranium of SD neonate rats.The relative mRNA expression of BMP-2，Smad1 and Smad5 of osteoblasts were determined by reverse transcription PCR(RT-PCR) after being exposed to simvastatin [0(S0)，10-8(S1)，10-7(S2)，5×10-7(S3)，10-6(S4) mol/L] for 72 hours.Results：The relative expression of BMP-2， Smad1 and Smad5 was significantly increased in a dose-dependent manner after being treated with simvastatin (10-8-10-6mol/L). The 10-6mol/L simvastatin showed the best promotive effects on the expression of BMP-2，Smad1 and Smad 5. Conclusion：The increased expression of mRNA of BMP-2，Smad1 and Smad5 may be involved in the possible mechanism of bone formation induced by simvastatin.

KEY WORDSOsteoblasts Bone morphogenetic proteins Smad proteins @Simvastatin

【中圖分類號(hào)】R965.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.005

*陜西省科技研究發(fā)展計(jì)劃(2009K17-03)

▲通訊作者