電化學發(fā)光免疫測定25-羥基維生素D3在疾病預防控制中心的應用*

(北京市疾病預防控制中心，北京 100013)

李　紅，沙怡梅，趙　耀△，施嘉琛

(北京市疾病預防控制中心，北京 100013)

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·臨床研究·

電化學發(fā)光免疫測定25-羥基維生素D3在疾病預防控制中心的應用*

(北京市疾病預防控制中心，北京 100013)

李紅，沙怡梅，趙耀△，施嘉琛

(北京市疾病預防控制中心，北京 100013)

摘要:目的在疾病預防控制中心使用電化學發(fā)光免疫分析儀測定血清中25-羥基維生素D3。方法使用E-170電化學發(fā)光免疫分析儀測定25-羥基維生素D3并與使用酶免檢測的數(shù)據(jù)進行比較。結果E-170電化學發(fā)光免疫分析儀測定25-羥基維生素D3質控血清檢測結果均在1個標準差內；與酶免檢測數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，相關性差(r=0.568)。結論25-羥基維生素D3室內質控結果良好，可以使用E-170電化學發(fā)光免疫分析儀在疾病預防控制中心開展25-羥基維生素D3的檢測工作，兩種方法檢測結果差異較大，在進行干預比較性實驗時要注意使用的檢測方法。

關鍵詞:電化學發(fā)光免疫測定；25-羥基維生素D3；比對實驗

維生素D是一種脂溶性維生素，最重要的兩個形式是維生素D3(膽鈣化甾醇)和維生素D2(麥角鈣化甾醇)[1]。維生素D是脂溶性甾體激素前體，其本身并沒有生物活性，在體內肝臟和腎臟經過連續(xù)兩步的羥基化反應過程變成為具有生物活性的1,25-二羥基維生素D[2]。檢測血清中25-羥基維生素D有95%以上的為25-羥基維生素D3，當服用維生素D2補充劑時可達到25-羥基維生素D2檢測水平。在人體內循環(huán)中的25-羥基維生素D的半衰期為2～3周，維生素D的水平和人體健康息息相關，與兒童佝僂病、骨質疏松癥、帕金森病、心血管疾病、高血壓、慢性腎臟病、2型糖尿病、干燥綜合征、過敏性鼻炎、腫瘤等疾病的研究大量被報道[3-12]。觀察不同緯度陽光照射、營養(yǎng)狀況等因素對人體維生素D水平的影響，通過改善生活習慣、飲食結構從而使維生素D水平達到正常。在以往的檢測工作中酶免方法使用較多，使用E-170電化學發(fā)光免疫分析儀在疾病預防控制中心開展25-羥基維生素D3檢測。

1材料與方法

1.1儀器設備E-170電化學發(fā)光免疫分析儀,羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.2試劑、校準品和質控品E-170電化學發(fā)光免疫分析儀配套使用試劑、標準品和質控品由羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.2.2校準品和質控品25-羥基維生素D3校準品貨號03314855， 4×1 mL。質控品貨號11972227，水平1和2各有(2×2)mL。

1.2.3系統(tǒng)附件系統(tǒng)緩沖液ProCell M，(2×2)L，貨號04880340。檢測池清洗液CleanCell M，(2×2)L，貨號04880293。貨號03023141，PC/CC-Cups，12杯，使用前預熱ProCell M和CleanCell M。貨號03005712，ProbeWash M,12×70 mL洗液，用于更換試劑和檢測完畢后的沖洗。貨號12102137，48盒×84反應器或移液頭，廢物袋。

1.3檢測原理25-羥基維生素D3檢測試劑盒使用的是抗維生素D3多克隆抗體，采用競爭法，樣品總檢測時間為18 min。反應過程需要進行兩次孵育，首先灰色蓋R1生物素標記的維生素D與血清(35 μL)中的維生素D3發(fā)生競爭反應，黑色蓋R2生物素-維生素D/釕復合物標記的多克隆特異性維生素D3抗體復合物與該生物素標記的維生素D結合。反應體系中免疫復合物的剩余量和樣本中分析物的濃度有關。第2次孵育是在體系中添加透明蓋M鏈霉親和素包被的微粒后，生物素與鏈霉親和素的相互作用使形成的免疫復合體結合到固相。將反應混合物吸入測量池，通過磁性微粒吸附到電極表面。加入ProCell系統(tǒng)緩沖液將沒有結合物質除去。對電極加壓之后產生化學發(fā)光，光電倍增器開始測定發(fā)光的強度計算樣品結果。

1.4實驗方法將試劑組放入E-170分析儀試劑倉(20 ℃)，通過試劑條碼儀器自動讀取測試具體參數(shù)。定標：25-羥基維生素D3試劑組帶有一個含有各批號試劑定標具體信息的條碼標簽，使預定義的主曲線適用于分析儀。質控：檢測質控血清水平1和2進行室內質量控制，質控血清檢測結果符合要求后檢測標本。計算：根據(jù)在分析儀上2點定標產生的定標曲線和試劑條碼提供的主曲線判定，分析儀自動計算出各樣本中被測物濃度(ng/mL或nmol/L)。實驗檢測數(shù)據(jù)使用ng/mL濃度單位。換算因子：nmol/L×0.40=ng/mL；ng/mL×2.50=nmol/L。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1E-170電化學發(fā)光免疫分析儀上質控品檢測結果見表1。

表1　質控品檢測結果(ng/mL)

2.2相關性分析兩種檢測方法結果比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00，t=6.885),相關性差(r=0.568)，檢測結果見表2。

表2　兩種方法結果比較(n=256,ng/mL)

3討論

兩個水平的質控品檢測結果均在1個標準差內，結果良好符合要求。使用前分析儀器會自動對磁性微粒進行再混勻，不同濃度范圍的質控品單獨測定，至少要在開始測試后每24 h一次、每個試劑盒一次和在每次定標后一次。制訂實驗室的質控間隔和限值,所檢測值應在規(guī)定的限值內。另外，試劑說明書指出該方法的溯源性，本方法已經過LC-MS-MS法標準化，可以使用E-170電化學發(fā)光免疫分析儀開展25-羥基維生素D3的檢測工作。與酶免檢測數(shù)據(jù)比對結果差別有統(tǒng)計學意義，這與張弘等[13]報道的一致。美國臨床實驗室標準協(xié)會(CLSI)EP9-A2文件的要求是r≥0．975(或r2≥0.95)[14]，兩種檢測方法相關性差(r=0.568)。目前國內檢測維生素D的方法并不統(tǒng)一，結果有很大差異[15-19]。在疾病預防控制中心或者婦幼保健院等根據(jù)營養(yǎng)狀況監(jiān)測并進行補充改善的工作[20]，在進行干預前后、進行比較性實驗時要注意使用的檢測方法。

E-170電化學發(fā)光免疫分析儀配套使用試劑M(透明蓋)、R1(灰色蓋)、R2(黑色蓋)組成25-羥基維生素D3試劑組，豎直存放于2～8 ℃冰箱保存，以確保使用前自動混合過程中微粒完全有效。輕拿輕放避免試劑起泡。為了避免因試劑瓶蓋過緊在操作時錯誤報警，在放入試劑倉之前可手工分別把3瓶試劑蓋輕輕打開再輕輕合上。儀器設備試劑盤內溫度為20 ℃左右，為了保證試劑穩(wěn)定性檢測之前放入，不能長期放在試劑倉內。為了避免運行過程中異常停機，開機之前準備好系統(tǒng)試劑及倒掉廢棄物，并且按照醫(yī)療廢棄物嚴格處理。

在試劑說明書中還有一些內容需要注意，檢測25-羥基維生素D3標本使用帶分離凝膠的血清：在18～25 ℃穩(wěn)定8 h，2～8 ℃能穩(wěn)定4 d，-20 ℃可穩(wěn)定6個月。K3-EDTA抗凝血漿：18～25 ℃可以穩(wěn)定8 h，2～8 ℃穩(wěn)定4 d，-20 ℃穩(wěn)定6個月。肝素-鋰抗凝血漿：18～25 ℃能穩(wěn)定8 h，2～8 ℃穩(wěn)定1 d，肝素-鋰抗凝的血漿禁止冷凍。試劑檢測范圍：4～100 ng/mL或者10～250 nmol/L。低于檢測下限時報告值為小于4 ng/mL(<10 nmol/L)。超出測量范圍上限時報告值為大于100 ng/mL(>250 nmol/L)，超出測量范圍的樣本可進行人工稀釋后在測定。在開展檢測工作之前認真仔細閱讀試劑說明書對保證檢測結果的準確是很必要的。

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(收稿日期：2016-01-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.039

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1247-03

*基金項目：衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項(201202012)?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：zhaoyao@bjcdc.org。