葛根素對腎臟缺血再灌注大鼠腎臟氧化應激損傷的影響及其機制研究

朱敏杰

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

?

葛根素對腎臟缺血再灌注大鼠腎臟氧化應激損傷的影響及其機制研究

朱敏杰

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

[摘要]目的研究葛根素對腎臟缺血再灌注大鼠腎臟氧化應激損傷的影響，并探討其可能的作用機制。方法將120只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、葛根素25 mg/kg組、葛根素50 mg/kg組、葛根素100 mg/kg組、銀杏葉提取物(100 mg/kg)組；除假手術組外，其余各組均通過夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復血流再灌注的方法制備腎缺血再灌注模型；再灌注后各給藥組立即腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)2周，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水。末次給藥后，測定血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)及總抗氧化能力(T-AOC)水平；通過蘇木精-尹紅(HE)染色觀察腎臟組織病理形態(tài)學變化；通過原位末端標記法(TUNEL)觀察腎小球細胞凋亡狀況并計算凋亡指數(shù)；檢測腎臟組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量；通過RT-PCR法測定腎臟組織中bax和bcl-2 mRNA表達量，并計算bax/bcl-2比值。結(jié)果葛根素50，100 mg/kg組血清BUN、SCr、UA含量均明顯低于模型組(P均<0.05)；各給藥組大鼠腎臟組織病理形態(tài)學變化和腎小球細胞凋亡狀況呈不同程度改善，以葛根素100 mg/kg組效果最為顯著；葛根素50，100 mg/kg組大鼠腎小球細胞凋亡指數(shù)及腎臟組織中bax mRNA表達量、MDA含量及bax/bcl-2比值均明顯低于模型組(P均<0.05)，腎臟組織中SOD、CAT活性及bcl-2 mRNA表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，其中葛根素100 mg/kg組血清T-AOC水平和腎臟組織中GSH-Px活性均顯著高于模型組(P均<0.05)。結(jié)論葛根素對腎臟缺血再灌注大鼠腎臟氧化應激和細胞凋亡具有抑制作用；作用機制可能與其能夠改善腎臟組織抗氧化酶活性、促進抗凋亡基因bcl-2表達、抑制促凋亡基因bax表達并降低bax/bcl-2比值有關。

[關鍵詞]葛根素；腎臟；缺血再灌注；氧化應激；凋亡；銀杏葉提取物

腎臟是血流量豐富的組織器官，對缺血再灌注損傷非常敏感，缺血再灌注損傷是腎臟手術、嚴重出血、休克后常見的并發(fā)癥，是導致腎衰竭的危險因素之一[1]。目前關于腎缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚未明確，但近年來有研究發(fā)現(xiàn)氧化應激以及繼發(fā)的細胞凋亡在缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用[2-3]。葛根素為我國傳統(tǒng)中藥葛根的主要有效成分，具有抗氧化、抗炎、調(diào)脂、抗凋亡等多種生物學活性[4-6]。本實驗采用夾閉雙側(cè)腎蒂血管45 min后松夾恢復血流再灌注的方法制備腎缺血再灌注大鼠模型，研究葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟氧化應激和細胞凋亡的影響。現(xiàn)報道如下。

1實驗資料

1.1藥物與試劑葛根素注射液(江西銀濤藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2 mL/100 mg，批號: 20140518)；金納多注射液(德國威瑪舒培大藥廠，5 mL/支，含有銀杏提取物17.5 mg，批號:1514904)；血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、尿酸(UA)測定試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；bax和bcl-2 mRNA RT-PCR檢測試劑盒(大連Takara公司)；TUNEL染色試劑盒(北京博奧森公司)；烏拉坦購自北京化學試劑公司。

1.2實驗動物清潔級雄性SD大鼠120只，7周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，動物批號：20140803。

1.3主要儀器UV-1200 型紫外可見光分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；UV759紫外可見分光光度計(上海圣科儀器設備有限公司)；BS-200型生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；FA25型勻漿機(上海洽姆儀器科技有限公司)；倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)；PCR儀(美國 Bio-Rad公司)；臺式離心機(深圳市賽泰克生物科技有限公司)。

1.4分組與造模方法將120只大鼠隨機分為假手術組、模型組、葛根素25 mg/kg組、葛根素50 mg/kg組、葛根素100 mg/kg組、銀杏葉提取物(100 mg/kg)組，每組20只；除假手術組外，其余各組大鼠均參照Chatterjee等[7]報道的方法制備腎缺血再灌注大鼠模型：腹腔注射烏拉坦實施麻醉，于脊柱雙側(cè)行腎區(qū)切口，剝離暴露雙側(cè)腎臟，使用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂血管，45 min后松夾恢復血流再灌注，然后逐層縫合；假手術組大鼠行手術通路，除不夾閉腎蒂血管外，其余操作同模型組。再灌注后，各給藥組立即腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)2周，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.5觀察項目

1.5.1血清BUN、SCr、UA和T-AOC水平測定末次灌胃后24 h，腹腔注射烏拉坦實施麻醉，開腹經(jīng)腹主動脈取血并離心取血清，按照試劑盒操作步驟，通過生化分析儀測定各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平，并通過紫外可見分光光度計測定各組大鼠血清T-AOC水平。

1.5.2腎臟組織形態(tài)學觀察取血完成后，摘取腎臟組織，其中左腎經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片(厚度5 μm)和展片處理后，行常規(guī)HE染色，通過倒置光學顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)學變化。

1.5.3腎小球細胞凋亡的觀察及凋亡指數(shù)的計算取1.5.2步驟制備的石蠟組織切片，按TUNEL試劑盒方法步驟進行染色處理，通過倒置光學顯微鏡觀察各組大鼠腎小球細胞凋亡狀況。每張染色組織切片隨機選取6個視野，計數(shù)每個視野中腎小球細胞總數(shù)以及陽性著色細胞數(shù)(細胞核黃染)，取平均值，然后計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5.4腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的測定參照1.5.2步驟摘取右腎組織，每組隨機取10只大鼠右腎組織剪碎、加入適量冷裂解液研磨勻漿，經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上層液，根據(jù)試劑盒操作方法，通過紫外可見分光度計分別測定各組大鼠腎臟組織勻漿中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.5.5腎臟組織中bax、bcl-2 mRNA表達的測定及bax/bcl-2比值的計算①取1.5.4步驟每組剩余10只大鼠的右腎組織，加入適量TRIZOL試劑后進行研磨勻漿；室溫靜置5 min后加入適量氯仿，搖勻后靜置5 min，于12 000 g、4 ℃離心15 min；取上清液，加入等體積的異丙醇后靜置10 min，12 000 g、4 ℃離心10 min，棄上清液；加入適當75%乙醇清洗沉淀，12 000 g、4 ℃離心5 min；棄上清保留沉淀。②引物的設計與合成：從基因文庫中查到大白鼠bcl-2、bax基因cDNA序列，應用Oligo軟件程序設計上、下游引物。bcl-2引物：上游5’-GGGATGCCTTTGTGGAACTA-3’，下游5’-TGATTTGACCATTTGCCTGA-3’，擴增的目的片段長度325 bp；Bax引物：上游5’-ATC CAGGATCGAGCAGGGAG GATGG-3’，下游5’-AGATGGTCACTGTCTGCCATGTGGG-3’，目的片段長度436 bp；β-actin引物：上游5’-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3’，下游5’-CCATCT CTTGCTCGAA GTCT-3’，目的片段長度 260 bp。③采用熒光定量RT-PCR方法檢測大鼠腎臟組織bax、bcl-2 mRNA表達量：取4 μL CDNA模板，SYBR Green I試劑25 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)，0.5 μL Taq酶(5 IU/μL)。加雙蒸水至50 μL，再加石蠟油20 μL，瞬時離心2 s，放入ABI 5700型實時熒光定量PCR擴增儀中進行PCR反應。擴增完畢讀取Ct值，進行溶解曲線分析，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物特異性。mRNA定量：采用相對定量法，以β-actin為參照，利用Ct值計算bax、bcl-2 mRNA的相對量，計算公式：X mRNA=2Ct(X)-Ct (β-actin)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平比較模型組大鼠血清BUN、SCr、UA水平明顯高于假手術組(P均<0.05)；葛根素50，100 mg/kg 組和銀杏葉提取物組血清BUN、SCr、UA水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平比較

注：①與假手術組比較,P<0.05；②與模型組比較,P<0.05。

2.2各組大鼠腎臟組織病理表現(xiàn)假手術組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)和腎臟細胞形態(tài)均未見異常；而模型組大鼠腎小球體積增大、系膜增生，細胞呈空泡變性，間質(zhì)區(qū)可見淋巴細胞浸潤等；各給藥組大鼠腎臟組織病變均較模型組明顯改善，其中以葛根素100 mg/kg組效果最為顯著。見圖1～6。

圖1　假手術組大鼠腎臟組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×200)

圖2　模型組大鼠腎臟組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×200)

圖3　葛根素25 mg/kg組大鼠腎臟組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×200)

圖4　葛根素50 mg/kg組大鼠腎臟組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×200)

圖5　葛根素100 mg/kg組大鼠腎臟組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×200)

圖6　銀杏葉提取物組大鼠腎臟組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×200)

2.3各組大鼠腎小球細胞凋亡情況比較假手術組大鼠腎臟組織存在極少量的凋亡細胞；而模型組大鼠腎小球細胞凋亡數(shù)量明顯增多，各給藥組大鼠腎小球細胞凋亡數(shù)量均明顯減少，其中以葛根素100 mg/kg組最為顯著，見圖7～12。假手術組大鼠腎臟組織細胞凋亡指數(shù)為(2.5±1.1)%，模型組為(53.7±8.0)%，葛根素25,50,100 mg/kg組分別為(48.5±8.6)%，(34.2±7.3)%和(16.9±4.8)%，銀杏葉提取物組為(30.1±5.7)%。模型組大鼠細胞凋亡指數(shù)明顯高于假手術組(P<0.05)，葛根素50,100 mg/kg組和銀杏葉提取物組大鼠細胞凋亡指數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.05)。

圖7　假手術組大鼠腎臟組織細胞凋亡表現(xiàn)(HE，×400)

圖8　模型組大鼠腎臟組織細胞凋亡表現(xiàn)(HE，×400)

圖9　葛根素25 mg/kg組大鼠腎臟組織細胞凋亡表現(xiàn)(HE，×400)

圖10　葛根素50 mg/kg組大鼠腎臟組織細胞凋亡表現(xiàn)(HE，×400)

2.4各組大鼠血清T-AOC水平比較假手術組大鼠血清T-AOC水平為(7.3±1.8)IU/L，模型組為(3.6±1.2)IU/L，葛根素25,50和100 mg/kg組分別為(5.6±1.5)IU/L、(6.0±1.5)IU/L和(6.8±1.6)IU/L，銀杏葉提取物組為(6.3±1.6)IU/L。模型組血清T-AOC水平明顯低于假手術組(P<0.05)，葛根素100 mg/kg組血清T-AOC水平明顯高于模型組(P<0.05)。

2.5各組大鼠腎臟組織勻漿中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA水平比較模型組大鼠腎臟組織勻漿中SOD、GSH-Px、CAT活性均明顯低于假手術組(P均<0.05)，MDA含量明顯高于假手術組(P<0.05)；葛根素50，100 mg/kg 組腎臟組織勻漿中SOD、CAT活性明顯高于模型組， MDA含量明顯低于模型組，其中葛根素100 mg/kg 組GSH-Px活性明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表2。

圖12　銀杏葉提取物組大鼠腎臟組織細胞凋亡表現(xiàn)(HE，×400)

表2　各組大鼠腎臟組織勻漿中SOD、GSH-Px、

注：①與假手術組比較,P<0.05；②與模型組比較,P<0.05。

2.6各組大鼠腎臟組織中bax、bcl-2 mRNA表達及bax/bcl-2比值比較模型組大鼠腎臟組織中bax、bcl-2 mRNA表達量及bax/bcl-2比值均明顯高于假手術組(P均<0.05)；葛根素50，100 mg/kg 組和銀杏葉提取物組大鼠腎臟組織中bax mRNA表達量明顯低于模型組(P均<0.05)， bcl-2 mRNA表達量和 bax/bcl-2比值明顯高于模型組(P均<0.05)。見表3。

3討論

腎缺血再灌注損傷是臨床上常見的并發(fā)癥，已引起廣大醫(yī)藥工作者的廣泛關注。胡紅林等[8]研究發(fā)現(xiàn)，腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展與氧自由基的大量生成、過剩而誘發(fā)的腎臟組織氧化應激損傷以及繼發(fā)的細胞凋亡密切相關。唐群等[9]研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物干預氧化應激損傷能夠有效減輕腎缺血再灌注損傷；傅耀文等[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物抑制腎組織細胞的凋亡也能夠有效緩解腎缺血再灌注損傷。

表3　各組大鼠腎臟組織中bax、bcl-2 mRNA表達及

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)生成的氧自由基能夠在SOD和GSH-Px、CAT的逐步催化作用下被還原[11-13]，最終生成對人體無害的水和氧。血清中T-AOC水平能夠反映機體整體抗氧化能力，而MDA也能夠間接反映機體氧化應激損傷程度。bcl-2和bax都屬于bcl-2基因家族，bcl-2為凋亡抑制基因,bax為促凋亡基因，二者共同調(diào)控細胞凋亡[14]；且bax/bcl-2比值越高，往往凋亡狀況越嚴重[15]。

本實驗結(jié)果顯示，葛根素能夠有效降低血清BUN、SCr、UA含量，改善腎功能，改善腎臟組織病變，抑制腎小球細胞凋亡，改善腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性，減輕氧化應激損傷，上調(diào)抗凋亡基因bcl-2表達,下調(diào)促凋亡基因bax表達，降低bax/bcl-2比值。提示葛根素具有抑制腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織氧化應激和細胞凋亡的作用，作用機制可能與葛根素能夠有效改善腎臟組織抗氧化酶活性、提高抗凋亡基因bcl-2表達、抑制促凋亡基因bax表達并降低bax/bcl-2比值有關。

[參考文獻]

[1]謝守霞,張萬帆,李江林. 銀杏葉提取物對大鼠腎缺血再灌注損傷保護作用的初步研究[J]. 廣東藥學,2003,13(5):35-37

[2]胡紅林,王共先. 腎缺血再灌注損傷中細胞凋亡和氧化應激[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2010,20(15):2280-2286

[3]傅耀文,張文嵐,周洪瀾,等. 急性腎缺血再灌注損傷氧化侵襲與細胞凋亡[J]. 中國老年學雜志,2005,25(5):543-545

[4]王會敏,田煒,喇孝瑾,等. 葛根素、齊墩果酸及其配伍對T2DM大鼠氧化應激和炎癥反應的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志,2013,19(15):174-177

[5]呂俊華,張世平,玉從容. 葛根素對胰島素抵抗模型大鼠調(diào)脂降壓作用及其機制研究[J]. 中國病理生理雜志,2006,22(5):997-1000

[6]張玲,龐莉,高俊虹,等. 葛根素對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡及相關蛋白表達的影響[J]. 中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2011,17(3):323-325

[7]Chatterjee PK,Brown PJ,Cuzzocrea S,et al. Calpain inhibitor reduces renal ischemia/reperfusion injury in the rat[J]. Kidney International,2001,59(6):2073-2083

[8]胡紅林,王共先. 腎缺血再灌注損傷中細胞凋亡和氧化應激[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2010,20(15):2280-2286

[9]唐群,吳華,雷久士. 山藥多糖預處理對大鼠腎缺血再灌注損傷的抗氧化保護作用[J]. 中國醫(yī)藥導報,2013,10(9):21-24

[10] 傅耀文,張文嵐,周洪瀾,等. 急性腎缺血再灌注損傷氧化侵襲與細胞凋亡[J]. 中國老年學雜志,2005,25(5):543-545

[11] Wided K,Hassiba R,Mesbah L. Polyphenolic fraction of Algerian propolis reverses doxorubicin induced oxidative stress in liver cells and mitochondria[J]. Pak J Pharm Sci,2014,27(6):1891-1897

[12] Syed SN,Rizvi W,Kumar AA,et al. In vitro antioxidant and in vivo hepatoprotective activity of leave extract of Raphanus sativus in rats using CCL4model[J]. Afr J Tradit Complement Altern Med,2014,11(3):102-106

[13] Cheng L,Jin Z,Zhao R,et al. Resveratrol attenuates inflammation and oxidative stress induced by myocardial ischemia-reperfusion injury:role of Nrf2/ARE pathway[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8(7):10420-10428

[14] 張彥清,劉保江,田首元. 丙泊酚對大鼠離體缺血/再灌注心肌細胞凋亡和Bcl-2/Bax蛋白表達的影響[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2011,9(1):55-57

[15] Jayanthi S,Deng X,Bordelon M,et al. Methamphetamine causes differential regulation of pro-death and anti-death Bcl-2 genes in the mouse neocortex[J]. FASEB J,2001,15(10):1745-1752

Study on the effects and the mechanism of puerarin on oxidative stress injury induced by renal ischemia-reperfusion in rats

ZHU Minjie

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the effect of puerarin on oxidative stress induced by renal ischemic-reperfusion in rats, and investigate its mechanism. Methods One hundred and twenty SD rats were randomly divided into six groups: sham operation group, model group, puerarin 25, 50, 100 mg/kg group and ginkgo biloba extract (EGb) 100 mg/kg group; except sham operation group, the rats in other groups were all made renal ischemic-reperfusion rat models by gripping bilateral renal pedicle vascular for 45 min, the drugs were given immediately after reperfusion, once a day for 2 weeks. Two weeks later, the content of BUN, SCr, UA and the level of T-AOC in serum were detected; the renal tissue histopathological changes was observed by HE staining; the apoptosis of renal cells was observed by TUNEL staining, and the apoptosis index (AI) was calculated; the activity of SOD, GSH-Px, CAT and the content of MDA in the renal tissue were measured; the expression level of Bax, bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR, and the bax/bcl-2 was calculated. Results Compared with the model group, the content of BUN, SCr, UA in serum of puerarin 50, 100 mg/kg group were significantly decreased (all P<0.05); the histopathological changes and the apoptosis of the renal tissue in puerarin 25, 50 100 mg/kg group and EGB 100 mg/kg group were significantly improved, the effect of puerarin 100 mg/kg group was the most significant; in the puerarin 50, 100 mg/kg group, the AI and bax mRNA expression, MDA content and bax/bcl-2 ratio in renal tissue were significantly lower than those in the model group (all P<0.05), and the expression levels of SOD, CAT and Bcl-2 mRNA in renal tissues were significantly higher than those in the model group (all P<0.05), the serum T-AOC level and GSH-Px activity in renal tissue of puerarin 100 mg/kg group were significantly higher than those in the model group (all P<0.05). Conclusion Puerarin has inhibitive effects on renal oxidative stress and apoptosis, the mechanism may be related to improving the activity of antioxidant enzymes in renal tissue, promoting the expression of anti-apoptotic gene Bcl-2, inhibiting the expression of pro-apoptotic gene Bax and reducing the ratio of bax/bcl-2.

Key words:puerarin; kidneys; ischemic-reperfusion; oxidative stress; apoptosis; ginkgo biloba extract

[收稿日期]2015-07-08

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)06-0585-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.06.005

[作者簡介]朱敏杰，女，主治醫(yī)師，從事腎疾病研究工作。