超聲法提取對(duì)金針菇多糖抗氧化活性的影響

王文亮 弓志青 張圣杰 陳相艷 石賢權(quán)

摘要：本試驗(yàn)通過比較超聲法提取與熱水法提取的金針菇多糖的體外抗氧化活性，研究超聲波提取對(duì)金針菇多糖抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：在0.125-2.000mg/mL范圍內(nèi)，隨金針菇多糖濃度的增加，其抗氧化能力增加；金針菇多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力較強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基的清除能力次之，對(duì)羥自由基的清除能力和相對(duì)還原力均較低。熱水法與超聲法提取的金針菇多糖抗氧化能力基本一致，即超聲提取對(duì)金針菇多糖抗氧化活性幾乎沒有影響。

關(guān)鍵詞：超聲波提?。唤疳樄?；多糖；抗氧化

中圖分類號(hào)：S567.3+9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）01-0054-04

金針菇（Flammulina velutipes）屬真菌分類中的擔(dān)子菌亞門傘菌目口蘑科小火焰菌屬的真菌，又名冬菇、樸蕈等。金針菇多糖（FVP）是金針菇中重要的活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能。傳統(tǒng)的水提醇沉法，提取時(shí)間長，提取率低，而超聲波對(duì)植物細(xì)胞壁的破碎作用可提高提取得率，縮短提取時(shí)間。采用超聲聯(lián)合超微粉碎提取金針菇多糖時(shí)，其提取效率由熱水提取的9%提高為20.5%。目前關(guān)于超聲波提取對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和活性等方面的研究較少，王博等研究超聲波強(qiáng)化提取對(duì)茯苓水溶性多糖結(jié)構(gòu)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)超聲波提取會(huì)影響多糖的分子鏈結(jié)構(gòu)，但不會(huì)影響多糖的單糖組成和單糖結(jié)構(gòu)。廖建民等在研究超聲波提取海帶多糖時(shí)，發(fā)現(xiàn)超聲波提取的多糖抑腫瘤效果與水提法無顯著差異。本研究以Vc抗氧化能力做對(duì)照，通過比較熱水提取與超聲波提取對(duì)金針菇多糖的體外抗氧化活性，包括相對(duì)還原力以及對(duì)DPPH.、超氧陰離子、羥基自由基的清除作用的影響，研究超聲波提取對(duì)金針菇多糖抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

金針菇粉（100目），實(shí)驗(yàn)室自制，含水量5%。DPPH，購于Sigma公司，其余均為分析純。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：UV-6100紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；XO-SMlOO超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；LXJ-IIB高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金針菇多糖熱水、超聲波提取工藝 將金針菇粉按照優(yōu)化后的提取工藝，即1∶25的料液比，加入熱水9℃提取4h，或380W超聲25min后，4500r/min離心20min，取上清液濃縮3倍，80%乙醇醇沉，離心，將沉淀物凍干得到兩種不同提取方法的金針菇粗多糖，水提與超聲波提取的提取率分別為9%、20%，采用苯酚一硫酸法測多糖含量。

將熱水與超聲法提取的金針菇多糖分別配成0.125、0.500、1.000、1.500、2.000mg/mL的多糖溶液，3000xg離心10min，取上清液備用。

1.2.2 金針菇多糖相對(duì)還原力測定參照Ovai-ZU[7]的方法。分別取多糖樣品1.0mL于試管中，加入pH6.6的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液、1%的K₃[Fe（CN）₆]溶液各2.5mL，50℃水浴保持20min。冷卻，再加入10%三氯乙酸2.5mL混勻，3000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL水和0.1% FeCl₃溶液0.5mL，常溫反應(yīng)10min，測定A700nm，測定3次，取平均值。并以VC為對(duì)照比較兩種方法提取的金針菇多糖的相對(duì)還原力。

1.2.3 金針菇多糖清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH.）的測定 DPPH·清除率（I1）按公式（1）計(jì)算，其中A1為1.0mL多糖溶液和4.0mL6.5×10^-5mol/L DPPH·、A₂為1.0mL50%乙醇溶液和4.0mL不同濃度的多糖液、A₃為1.0mL 50%乙醇溶液和4.0mL 6.5×10^-5mol/L DPPH·分別反應(yīng)30min后在517nm處測得的吸光值；測定3次，取平均值。并以抗壞血酸為對(duì)照，比較兩種方法提取金針菇多糖對(duì)DPPH·的清除率。

1.2.4 金針菇多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力測定鄰苯三酚自氧化速率的測定：將試管中加入4.5mL的50mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH值8.2）和4.2mL蒸餾水，25℃水浴20min，取出后迅速加入0.3mL的3mmol/L鄰苯三酚溶液（溶劑為10mmol/L HCl，提前預(yù)熱至25℃），混勻后于325nm下每隔30s測一次吸光值，反應(yīng)4.5min結(jié)束?？瞻捉M為10mmol/L的HCl。一定線性范圍內(nèi)，計(jì)算每分鐘吸光度的增加值。

樣品自氧化速率的測定：取不同濃度的多糖溶液1.0mL，并按上述操作進(jìn)行，其中蒸餾水添加量為3.2mL，平行測定3次后取平均值。超氧陰離子自由基清除率（I2）用公式（2）計(jì)算。同時(shí)，以抗壞血酸為對(duì)照，比較兩種方法提取的金針菇多糖的清除能力。

式中：A1為鄰苯三酚自氧化速率；A2為加多糖液后鄰苯三酚的自氧化速率。

1.2.5 金針菇多糖對(duì)羥自由基（·OH）的清除能力 采用翟繼英的方法，取不同濃度的多糖溶液1.0mL，加入9mmol/L FeSO₄和9mmol/L水楊酸一乙醇溶液各1.0mL，混勻后加入1.0 mL8.8mmol/L H₂O₂啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴30min，于510nm處測定吸光值（蒸餾水調(diào)零）。蒸餾水代替水楊酸為空白對(duì)照，蒸餾水代替多糖溶液為對(duì)照組，平行測定3次后取平均值。羥自由基清除率（I₃）用公式（3）計(jì)算。同時(shí)以抗壞血酸為對(duì)照，比較兩種方法提取的金針菇多糖的·OH清除能力。

式中：Ao代表不加多糖溶液的空白對(duì)照液的吸光度；Ai代表加入多糖溶液后的吸光度；Aio代表無顯色劑時(shí)多糖的自身吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水與超聲波提取金針菇多糖相對(duì)還原力比較

還原能力的測定可以衡量樣品是否為一良好的電子供體，還原能力大的樣品是良好的電子供體。待測物所供應(yīng)的電子可以使Fe³⁺還原為Fe²⁺，使體系溶液顏色改變，即可反映出體系中氧化還原狀態(tài)的改變。具有還原能力的金針菇多糖物質(zhì)和Vc供應(yīng)的電子使Fe³⁺還原為Fe²⁺，并最終生成普魯士藍(lán)，從而使體系吸光值顯著上升。

如圖1所示，在0.125～2.000mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，還原力都逐漸增強(qiáng)，當(dāng)熱水和超聲提取多糖濃度增加8倍時(shí)，還原力分別增加了3.9和3.0倍，但二者差別并不大。以Vc作為對(duì)照，當(dāng)濃度為0.125mg/mL時(shí)，其吸光值為0.57，而超聲多糖吸光值為0.089，熱水多糖吸光值0.077，Vc的還原力約為兩種金針菇多糖還原力的6.4和7.4倍，在0.125～2.000mg/mL濃度范圍內(nèi)，Vc的還原力約為金針菇多糖還原力的4.8～8.1倍。

2.2 熱水與超聲波提取金針菇多糖對(duì)DPPH.清除能力

DPPH.是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能清除它，則表示受試物具有羥自由基、烷自由基或過氧自由基等自由基，有打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。熱水與超聲法提取金針菇多糖對(duì)DPPH.清除能力如圖2所示，在0.125～2.000mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加，多糖對(duì)DPPH·清除能力逐漸增強(qiáng)，且兩種多糖上升幅度基本一致，二者對(duì)DPPH·清除能力略有影響，但差別不大，當(dāng)濃度小于1.5mg/mL，兩種多糖對(duì)DPPH·清除能力小于Vc，當(dāng)大于1.5mg/mL濃度時(shí)，與VC能力相當(dāng)。

2.3 熱水與超聲波提取金針菇多糖對(duì)清除能力

超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)所有活性氧自由基中的第一個(gè)自由基，自身不太活潑，但可通過歧化反應(yīng)和其它反應(yīng)途徑產(chǎn)生H，0，和羥自由基（·OH），是生物體中自由基產(chǎn)生的根源，所以清除超氧陰離子自由基意義很大。熱水與超聲法提取金針菇多糖對(duì)的清除能力如圖3，在0.125-2.000mg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)的清除能力隨多糖濃度的增加而增加，兩種多糖清除超氧陰離子的能力很接近，VC對(duì)超氧陰離子清除能力也逐漸增強(qiáng)，但清除能力略低于兩種多糖。

2.4 熱水與超聲波提取金針菇多糖對(duì)·OH清除能力

本試驗(yàn)采用的是Fenton反應(yīng)體系，以H₂O₂為氧化劑，以Fe²⁺為催化體系的氧化法。熱水與超聲法提取金針菇多糖對(duì).OH清除能力如圖4，在0.125～2.000mg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)·OH的清除能力隨著濃度的增加而增加，且兩種多糖對(duì)羥自由基清除能力幾乎相等，但不及Vc對(duì)·OH的清除能力，Vc對(duì)·OH的清除能力約為金針菇多糖清除能力的1.3～3.3倍。

3 結(jié)論

多糖是食用菌中最重要的活性成分之一，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化等抗氧化活性，從而起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用，因此食用菌多糖成為保健食品、藥品以及抗氧化劑開發(fā)的重要來源。食用菌多糖的抗氧化能力不僅與食用菌種類有關(guān)，也與提取純度、提取部位等有關(guān)。如董丹丹對(duì)黑木耳、香菇、金針菇、雙孢蘑菇多糖對(duì).OH、DPPH.等的清除能力進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，其多糖抗氧化能力依次為雙孢菇>香菇>黑木耳>金針菇。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，熱水法與超聲法提取的金針菇多糖抗氧化能力基本一致，且在0.125～2.000mg/mL范圍內(nèi)，隨濃度增加，金針菇多糖的抗氧化能力增強(qiáng)；金針菇多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力較強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基的清除能力次之，對(duì)羥自由基的清除能力和相對(duì)還原力較低。本研究結(jié)果與王晶等利用超聲波提取桑樹皮黃酮的抗氧化能力結(jié)果一致，即超聲波提取與熱回流提取物質(zhì)的體外抗氧化作用相當(dāng)。但超聲波提取對(duì)金針菇多糖分子鏈結(jié)構(gòu)的影響如何，還有待進(jìn)一步研究。