TDZ和BA對(duì)金花梨和鴨梨葉片不定芽再生的影響

孫洪雁 陶吉寒 辛力 孫清榮

摘要：為了提高金花梨和鴨梨2個(gè)品種葉片不定芽再生能力，以其試管苗葉片為外植體，以NN69為基本培養(yǎng)基，研究了不同濃度TDZ和BA對(duì)2個(gè)品種梨葉片不定芽再生的影響。結(jié)果表明：BA對(duì)鴨梨葉片不定芽的再生比TDZ有效，TDZ未能誘導(dǎo)鴨梨葉片產(chǎn)生不定芽；BA對(duì)金花梨葉片不定芽再生率的影響與TDZ無(wú)顯著差異，但TDZ比BA顯著提高了金花梨葉片的平均每葉不定芽數(shù)。

關(guān)鍵詞：梨；葉片；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；不定芽再生；TDZ；BA

中圖分類號(hào)：S661.204⁺.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001-4942（2016）01-0026-04

梨是我國(guó)第三大果樹(shù)，其種植面積和產(chǎn)量?jī)H次于蘋(píng)果和柑桔。梨果也是世界范圍內(nèi)深受消費(fèi)者喜愛(ài)的水果之一。但梨樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常受到一些病害的威脅。傳統(tǒng)的雜交育種雖然可以進(jìn)行有利性狀包括抗病性狀的轉(zhuǎn)移，但由于梨樹(shù)具有高度雜合的遺傳背景和較長(zhǎng)的童期，采用雜交育種方法進(jìn)行抗性選擇不僅難度較大，而且需時(shí)長(zhǎng)。果樹(shù)的自然芽變，雖然可以出現(xiàn)果實(shí)大小、果皮顏色、株型等的變異，但很難出現(xiàn)抗性突變變異。基因工程的外源基因遺傳轉(zhuǎn)化操作為植物的抗病性改良提供了新的育種方法，并在多種植物上獲得了成功，但遺傳轉(zhuǎn)化操作成功應(yīng)用于果樹(shù)的前提是離體葉片高效不定芽再生體系的建立。離體葉片不定芽再生體系的建立還可用于體細(xì)胞誘變研究及無(wú)性變異選擇研究。關(guān)于梨樹(shù)葉片不定芽再生的研究已在很多品種上獲得了成功，但不同基因型不定芽再生的難易及再生頻率不同。而一個(gè)品種離體葉片不定芽再生的高效性應(yīng)該是既有高的再生頻率又有高的單位葉片不定梢數(shù)，這是應(yīng)用遺傳轉(zhuǎn)化操作技術(shù)改良品種的理想的前提條件。本試驗(yàn)通過(guò)研究不同濃度TDZ和BA對(duì)金花梨和鴨梨葉片不定芽再生的影響，旨在提高2個(gè)品種梨離體葉片的不定芽再生力，為利用體細(xì)胞誘變方法及外源基因轉(zhuǎn)化操作改良品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室繼代保存的金花梨和鴨梨的試管苗。

1.2試驗(yàn)方法

試管苗繼代增殖培養(yǎng)3～4周時(shí)，取綠梢頂部2～3片剛展開(kāi)的幼嫩葉片，用無(wú)菌手術(shù)刀片垂直于葉片中脈橫切，葉緣不切斷以保證葉片完整，把帶有切口的葉片接種于裝有不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)。每個(gè)處理接種3瓶，每瓶接種10片，重復(fù)3次。葉片接種后先置于黑暗條件下暗培養(yǎng)3周，然后轉(zhuǎn)移至光培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至6周時(shí)，觀察和統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生不定芽的葉片數(shù)，記錄每個(gè)葉片產(chǎn)生的不定芽數(shù)，計(jì)算不定芽再生率和平均每葉不定芽數(shù)。不定芽再生率（%）=產(chǎn)生不定芽的葉片數(shù)/接種總?cè)~片數(shù)×100；平均每葉不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/產(chǎn)生不定芽的葉片數(shù)。再生力=不定芽再生率（%）×平均每葉不定芽數(shù)×100。

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以NN69為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的BA（3、5mg/L）或TDZ（1、2mg/L），共設(shè)4個(gè)處理，每個(gè)處理均添加0.3mg/LIBA、30g/L蔗糖、6g/L瓊脂，滅菌前pH值調(diào)節(jié)為5.8。

培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)的光周期為16h光/8h暗，光強(qiáng)為40μmol·m-2^-2·S^-1，培養(yǎng)溫度為（25±+2）℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理平均值用LSD法進(jìn)行差異比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TDZ和BA對(duì)金花梨葉片不定芽再生的影響

由表l可知，添加不同濃度TDZ和BA的培養(yǎng)基均能成功誘導(dǎo)金花梨葉片產(chǎn)生不定芽（圖1A、B），各處理對(duì)不定芽再生率的影響無(wú)顯著差異，均可達(dá)80%以上。其中，1mg/L TDZ處理顯著提高了金花梨的平均每葉不定芽數(shù)，與其他處理間差異顯著，且再生力最高，為539.88。由此可見(jiàn)，TDZ對(duì)誘導(dǎo)金花梨葉片不定芽再生比BA更有效。

2.2 TDZ和BA對(duì)鴨梨葉片不定芽再生的影響

由表1可知，添加不同濃度BA的培養(yǎng)基均可成功誘導(dǎo)鴨梨葉片產(chǎn)生不定芽（圖1C），其中，3mg/L BA處理的不定芽再生率顯著高于5mg/LBA的處理，且再生力明顯較高；5mg/L BA處理的平均每葉不定芽數(shù)略高于3mg/L BA處理，但差異不顯著。添加TDZ的培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)鴨梨葉片產(chǎn)生不定芽，只能誘導(dǎo)葉片傷口處產(chǎn)生愈傷（圖ID）。表明BA對(duì)誘導(dǎo)鴨梨葉片不定芽再生比TDZ有效，且較低濃度的BA更有利于誘導(dǎo)鴨梨葉片不定芽再生。

2.3 TDZ和BA對(duì)不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響

BA誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽，在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可直接伸長(zhǎng)生長(zhǎng)形成不定芽綠苗（圖1B、C），2個(gè)品種結(jié)果表現(xiàn)一致；TDZ誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽，在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上不能直接伸長(zhǎng)生長(zhǎng)形成不定芽（圖1A），轉(zhuǎn)移至添加1mg/L BA的MS培養(yǎng)基上可獲得正常伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的不定芽綠苗。

2.4 不定芽的增殖和生根培養(yǎng)

獲得的不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基MS+1mg/LBA+0.2mg/LIBA上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，2個(gè)品種均獲得了良好的增殖生長(zhǎng)和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

繼代伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的綠苗在生根培養(yǎng)基1/4MS（MS大量元素的1/4）+0.5mg/L IBA上，2個(gè)品種均獲得了85%以上的生根率。

3 結(jié)論與討論

TDZ和BA對(duì)不同基因型梨葉片不定芽再生的影響不同。Caboni等研究表明BA對(duì)野生梨葉片不定芽再生的影響比TDZ更有效。Liu等研究表明TDZ對(duì)‘中梨1號(hào)葉片不定芽再生的誘導(dǎo)比BA更有效。本研究結(jié)果表明，TDZ對(duì)金花梨葉片不定芽再生的誘導(dǎo)比BA更有效，且明顯提高了不定芽再生力；而B(niǎo)A對(duì)鴨梨葉片不定芽再生的影響比TDZ更有效，且BA誘導(dǎo)葉片不定芽再生率可達(dá)55%，而TDZ未能誘導(dǎo)鴨梨葉片產(chǎn)生不定芽。

在木本植物的組織培養(yǎng)中，TDZ是一種活性很強(qiáng)的類細(xì)胞分裂素物質(zhì)，雖能有效誘導(dǎo)不定芽再生，但又常存在著抑制不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的作用。本研究中，對(duì)金花梨葉片不定芽再生的試驗(yàn)也表現(xiàn)為TDZ抑制不定芽的伸長(zhǎng)，這與前人研究結(jié)果一致。鴨梨在BA培養(yǎng)基上可直接獲得伸長(zhǎng)的不定芽，但鴨梨的不定芽再生力較低，提高鴨梨葉片不定芽再生率的研究正在進(jìn)一步試驗(yàn)中。