興義維蚋蚋卵（胚胎）原代細胞培養(yǎng)及鑒定

周靜 劉占鈺 徐旭 崔立秋 吳慧 陳漢彬 楊明

摘要：【目的】篩選出最適宜興義維蚋蚋卵（胚胎）原代細胞的培養(yǎng)條件和最佳培養(yǎng)基組合，并對其原代細胞進行鑒定，為蚋類細胞系的建立打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎媒M織塊和單細胞法對興義維蚋蚋卵（胚胎）進行原代細胞培養(yǎng)，分析培養(yǎng)基、溫度、pH、CO2和培養(yǎng)器皿對細胞培養(yǎng)的影響；并測定蚋卵（胚胎）及原代細胞的rDNA-ITS區(qū)序列，通過構(gòu)建基于ITS區(qū)序列的蚋類系統(tǒng)發(fā)育進化樹鑒定其種屬來源?！窘Y(jié)果】興義維蚋蚋卵（胚胎）原代細胞最適宜的培養(yǎng)方法為組織塊法，培養(yǎng)基為改良型Shields and Sang M3，pH 6.0～6.5，培養(yǎng)溫度28 ℃，恒溫生化培養(yǎng)箱和5% CO2培養(yǎng)箱對原代細胞培養(yǎng)無明顯差異，培養(yǎng)器皿為經(jīng)多聚賴氨酸（PLL）處理的一次性塑料培養(yǎng)皿/板。由基于ITS區(qū)序列構(gòu)建的蚋類系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，蚋卵（胚胎）及其原代培養(yǎng)細胞均來源于興義維蚋?！窘Y(jié)論】成功建立的興義維蚋蚋卵（胚胎）原代細胞培養(yǎng)方法可在科研生產(chǎn)中進一步推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 興義維蚋；蚋卵（胚胎）；原代細胞；培養(yǎng)；鑒定

中圖分類號： S852.743 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1945-07

Abstract：【Objective】The present study was conducted to select the most suitable culture conditions and optimal culture media for culturing primary cells of eggs（embryos） in Simulium（Wilhelmia） xingyiense， and identify the primary cells in order to lay a foundation for establishment of blackfly cell lines. 【Method】Primary cells of eggs（embryos） in S.（W.） xingyiense were cultured using tissue block method and single cell method. The influence factors for cell culture were analyzed， including medium， temperature， pH value， CO2 and culture vessels. At the same time， the sequences of rDNA-ITS region of eggs（embryos） and primary cells were determined， and blackfly phylogenetic tree was established based on their ITS sequences to identify their species origin. 【Result】The tissue block method was the optimal culture method for culturing the primary cells of eggs（embryos） in S.（W.） xingyiense. The appropriate culture medium was modified Shields and Sang M3 with pH 6.0-6.5 and 28 ℃ culture temperature. Constant temperature biochemical incubator and 5% CO2 incubator made no significant differences on culturing primary cells. Poly-L-lysine（PLL） treated plastic petri dishes/plates could be used as culture vessels. The result of blackfly phylogenetic tree based on ITS sequences showed that blackfly eggs（embryos） and their primary cells were derived from S.（W.） xingyiense. 【Conclusion】The culture method for primary cells of eggs（embryos） in S.（W.） xingyiense successfully established can be further applied in scientific research and production.

Key words： Simulium（Wilhelmia） xingyiense； blackfly egg（embryo）； primary cell； culture； identification

0 引言

【研究意義】昆蟲細胞培養(yǎng)是細胞工程研究的基本技術(shù)之一，已成為現(xiàn)代實驗生物學的重要研究手段（李守信等，2005）。昆蟲細胞培養(yǎng)來源于不同組織，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、遺傳學及生物學等研究領(lǐng)域（Smagghe et al.，2009），是研究昆蟲生理生化、生物反應(yīng)器及表達基因產(chǎn)物等的重要材料（Reid et al.，2016）。蚋類俗稱黑蠅（Blackfly），隸屬于昆蟲綱（Insecta）雙翅目（Diptera）蚋科（Simuliidae），是人類和畜禽多種疾?。ūP尾絲蟲病、禽鳥住白細胞蟲?。┑膫鞑ッ浇椋瑢倚蟮奈：τ葹閲乐?，輕者引發(fā)變態(tài)反應(yīng)，造成肉、乳產(chǎn)量下降，重者可導(dǎo)致家畜死亡，影響社會公共衛(wèi)生（陳漢彬等，2016）。因此，加強蚋類細胞培養(yǎng)體系研究，對了解蚋類生態(tài)習性及其生物防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】迄今為止，世界范圍內(nèi)已建成800多株昆蟲細胞系，包括黑腹果蠅細胞系（BSR-9840）、白紋伊蚊細胞系（Aa-778）和嗜人按蚊細胞系（Ana-104）等，這些細胞系主要來源于雙翅目和鱗翅目昆蟲（張寰等，2007）。昆蟲細胞系已廣泛應(yīng)用于病毒傳播和疾病治療等領(lǐng)域的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究，如果蠅和白紋伊蚊細胞系已用于研究Sindbis病毒與細胞間的交互作用（Mudiganti et al.，2006；唐芬芬等，2015；Roest et al.，2016）；蜜蜂、蚊類昆蟲細胞系主要用于研究我國蝙蝠科病毒、蝦黃頭病毒及登革熱病毒的傳播途徑（Gangnonngiw et al.，2010；Xia et al.，2014；Yang et al.，2015）。此外，昆蟲細胞系可用于研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗（Mena and Kamen，2011；Shilo，2016），或用于篩選新型化學殺蟲劑（Smagghe et al.，2009）及研究溴氰菊酯農(nóng)藥抗性基因（Chi et al.，2016）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，蚋類研究主要集中在形態(tài)和分子水平（楊明等，2004；徐旭等，2012；陳漢彬等，2016），尚無針對蚋類細胞培養(yǎng)的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以貴州省貴陽市郊區(qū)興義維蚋[Simulium（Wilhelmia） xingyiense]蚋卵（胚胎）為材料，篩選出最適宜興義維蚋蚋卵（胚胎）原代細胞的培養(yǎng)條件和最佳培養(yǎng)基組合，并對其原代細胞進行鑒定，以期為蚋類細胞系的建立打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗在貴州醫(yī)科大學分子生物學重點實驗室進行。供試材料為蚋卵前幼蟲期胚胎（肉眼觀察為棕黑色，顯微鏡下通過透明卵殼可見紅眼點出現(xiàn)，破卵器形成）（陳漢彬等，2016），采自貴州省貴陽市郊區(qū)。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 原代細胞培養(yǎng) 篩選野外采集的興義維蚋蚋卵（胚胎），經(jīng)70%乙醇→1%過氧乙酸→2.8% NaClO消毒處理（周靜等，2010）。選取Graces、Schneiders和Shields and Sang M3為基本培養(yǎng)基，并在Shields and Sang M3中添加5 mg/L胰島素作為改良型Shields and Sang M3培養(yǎng)基，然后分別加入20% FBS和抗生素混合液（500 U/mL青霉素、500 mg/mL硫酸鏈霉素和12.5 mg/mL兩性霉素B）。

1. 2. 2 原代細胞培養(yǎng)條件優(yōu)化 在生化培養(yǎng)箱和5% CO2培養(yǎng)箱中，設(shè)定細胞培養(yǎng)溫度為26、28和30 ℃，培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至6.2、6.5和6.8，分別在經(jīng)0.1%多聚賴氨酸（PLL）包被處理的玻璃培養(yǎng)瓶和塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并設(shè)未經(jīng)PLL包被處理的培養(yǎng)器皿為陰性對照。

1. 2. 3 原代細胞培養(yǎng)方法建立 分別以組織塊法和單細胞法進行蚋卵胚胎組織處理。組織塊法是經(jīng)眼科剪剪碎胚胎、紗布過濾后獲得的大量細小組織和少量細胞；單細胞法是在冰上勻漿胚胎組織塊，并用0.25%胰蛋白酶消化處理后，按1×105個/mL接種細胞（Xu et al.，2015）。

1. 2. 4 原代細胞培養(yǎng)觀察 根據(jù)細胞生長情況，分別進行1/2、1/3和1/4部分換液，倒置顯微鏡下定期觀察組織細胞貼壁情況及細胞遷移增殖生長狀態(tài)，應(yīng)用顯微測微尺測量細胞大小，并進行拍照分析。

1. 3 蚋卵（胚胎）及原代培養(yǎng)細胞種屬鑒定

1. 3. 1 rDNA-ITS序列擴增 采用基因組抽提試劑盒從用于原代細胞培養(yǎng)的卵筏上剩余卵塊提取蚋卵（胚胎）基因組DNA，而原代培養(yǎng)細胞需重懸于200 μL PBS中后，再以基因組抽提試劑盒提取原代細胞基因組DNA。采用本課題組自行設(shè)計的引物PCX1（5'-GTTGACCGAACTTGATGATTTAGAG-3'）和 PCX4

（5'-GGGTAGTCACACATTATTTGAGGC-3'）進行PCR擴增，擴增程序：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。對PCR產(chǎn)物進行純化及鑒定，挑選陽性克隆菌株送至南京金思瑞科技公司進行測序。

1. 3. 2 序列分析構(gòu)建 基于蚋類ITS區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，包含148條序列。其中，待鑒定序列11條，本課題組已測定的蚋科2屬8亞屬16種114條序列，GenBank中的蚋科5屬9亞屬20種23條序列。每條序列均為完整的rDNA-ITS區(qū)，包含ITS1、5.8S和ITS2。采用ClustalX 1.83進行多重序列比對，并以MEGA 4.0中的鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）和最大簡約法（Maximum parsimony method，MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以鑒定蚋（卵）胚胎及原代培養(yǎng)細胞的種屬來源。

2 結(jié)果與分析

2. 1 原代細胞培養(yǎng)材料

原代細胞培養(yǎng)材料為蚋卵前幼蟲期胚胎，其培養(yǎng)過程中可觀察到胚胎組織塊周圍有多種細胞遷移和生長（圖1-A），并可見多個圓形細胞分裂增殖（圖1-B）。初步證實蚋卵前幼蟲期胚胎可作為蚋類原代細胞培養(yǎng)材料來源，但其建系能力有待下一步研究驗證。

2. 2 原代細胞培養(yǎng)影響因素篩選結(jié)果

2. 2. 1 原代細胞培養(yǎng)基篩選 培養(yǎng)4周后，發(fā)現(xiàn)蚋卵（胚胎）組織細胞在Graces、Schneiders、Shields and Sang M3及改良型Shields and Sang M3培養(yǎng)基中均有細胞遷移生長（表1）。其中，在Graces培養(yǎng)基中只有極少量的組織塊貼壁，少量細胞遷移生長（圖2-A）；在Schneiders培養(yǎng)基中，部分組織塊貼壁，少量細胞遷移生長（圖2-B）；在Shields and Sang M3和改良型Shields and Sang M3培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～3 d后貼壁組織塊周圍細胞呈拉網(wǎng)樹枝樣遷移生長，細胞種類數(shù)量較多，形態(tài)規(guī)則，折光性較好，表現(xiàn)出較好的生長勢（圖2-C，圖2-D）；尤其在改良型Shields and Sang M3培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)2周后每日對3個視野的100個細胞分別進行計數(shù)，連續(xù)觀察3 d，發(fā)現(xiàn)其平均增殖率約20%。可見，改良型Shields and Sang M3培養(yǎng)基更適合蚋卵胚胎原代細胞培養(yǎng)。

2. 2. 2 原代細胞培養(yǎng)方法篩選 組織塊法培養(yǎng)12 h后可見大量組織塊貼壁（圖3-A），各種不同類型的細胞逐漸從貼壁組織塊周圍遷移生長，3～4 d呈拉網(wǎng)樹枝樣生長，組織塊周圍還可見多個圓形脫落細胞，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d后可見部分細胞分裂增殖。單細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)獲得的細胞以圓形細胞為主，形態(tài)較單一，細胞大小不一（圖3-B）；部分細胞培養(yǎng)24 h后為半貼壁生長，輕搖易動，其余細胞懸浮于培養(yǎng)液中生長，可見細胞碎片懸浮于培養(yǎng)液中；隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞形態(tài)不規(guī)則、折光性變差、細胞增殖生長不明顯，逐漸死亡。因此，確定蚋卵（胚胎）組織原代細胞培養(yǎng)宜采用組織塊法。

2. 2. 3 原代細胞培養(yǎng)條件篩選 蚋卵（胚胎）組織細胞在恒溫生化培養(yǎng)箱和5% CO2培養(yǎng)箱中均可生長、繁殖，在原代細胞培養(yǎng)階段無明顯差異。在28 ℃培養(yǎng)溫度條件下，組織塊貼壁后即有細胞遷移，2～3 d可見組織塊周圍細胞呈拉網(wǎng)狀生長（圖4-A）；培養(yǎng)溫度降至26 ℃時細胞遷移時間推遲；培養(yǎng)溫度上升至30 ℃時原代細胞出現(xiàn)胞質(zhì)皺縮現(xiàn)象，細胞生長狀態(tài)不佳（圖4-B）。原代培養(yǎng)細胞在pH 6.2～6.5內(nèi)生長狀態(tài)較好（圖4-C），但培養(yǎng)基pH超過6.5后，隨著培養(yǎng)時間的推移，培養(yǎng)基中極易出現(xiàn)結(jié)晶體，細胞逐漸消亡（圖4-D）。在經(jīng)PLL預(yù)處理的塑料培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)1～2 d開始有大量組織塊貼壁，并有多種細胞遷移生長（圖4-E）；而在未經(jīng)PLL處理的塑料培養(yǎng)皿及玻璃培養(yǎng)瓶中僅有少量組織細胞貼壁，較少細胞遷移生長（圖4-F）；培養(yǎng)液中的懸浮組織塊不利于細胞脫落和遷移生長。

2. 3 原代培養(yǎng)細胞的形態(tài)特征

蚋卵（胚胎）組織細胞培養(yǎng)40 d后，可觀察到組織塊周圍遷移出各種形狀的蚋卵（胚胎）原代細胞。根據(jù)細胞形態(tài)學特征可初步分為：神經(jīng)元樣細胞（圖5-A）、肌肉樣細胞（圖5-B）、肌管樣細胞（圖5-C）、上皮樣細胞（圖5-D）、巨噬樣細胞（圖5-E）和圓形/卵圓形細胞（圖5-F）。在細胞培養(yǎng)過程中增殖較明顯的是組織塊周圍脫落的圓形/卵圓形細胞，增殖率約20%（表1）。

2. 4 蚋卵（胚胎）組織及原代培養(yǎng)細胞的種屬鑒定結(jié)果

2. 4. 1 PCR擴增及驗證結(jié)果 用引物對PCX1/PCX4擴增6個蚋卵（胚胎）組織樣本及5個原代細胞樣本，均能獲得預(yù)期大小的目的片段。將目的片段純化后克隆，利用載體特異引物進行PCR驗證，可獲得1000 bp的片段（圖6），每個樣本挑取2～3個陽性克隆送至南京金思瑞科技生物公司測序，其序列比對結(jié)果顯示蚋卵（胚胎）組織樣本及原代細胞的11條序列均為蚋類特異基因，可用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。

2. 4. 2 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析序列結(jié)果 通過對比基于ITS區(qū)序列構(gòu)建的NJ樹和MP樹，發(fā)現(xiàn)兩者在各類群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上基本一致，尤其是待鑒別的6個蚋卵（胚胎）組織序列（zj-B1-6、zj-B1-1、zj-2-3、zj-1-4、zj-2-2和zj-B2-1）和5個原代培養(yǎng)細胞序列（zj-1-3、zj-1-2、zj-B1-8、zj-2-1和zj-B2-7）在兩個系統(tǒng)發(fā)育進化樹中的歸屬相同。從圖7可看出，待鑒別的6個蚋卵（胚胎）組織序列和5個原代培養(yǎng)細胞序列明確歸屬于興義維蚋一枝，即可確定待鑒別的蚋卵（胚胎）及其原代培養(yǎng)細胞均來源于興義維蚋。

3 討論

蚋類細胞系的建立可為從細胞水平上研究蚋類的生理生化特性及其病毒學、免疫學、遺傳學和新型農(nóng)藥研制等提供有效的技術(shù)手段。目前，已建立的800多種昆蟲細胞系主要來源于鱗翅目和雙翅目（張寰等，2007）。雙翅目中，以果蠅建立的細胞系最多、應(yīng)用最廣（Cross and Sang，1978），但迄今未見成功建立蚋類細胞系的研究報道。已建立的昆蟲細胞系母細胞50%以上來自昆蟲的胚胎、初孵幼蟲（張寰等，2007）。本研究選用野外采集的蚋卵（胚胎）作為培養(yǎng)材料，并將其置于蚋類槽式飼養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)育至蚋卵前幼蟲期胚胎，再用于蚋卵（胚胎）原代細胞培養(yǎng)。蚋類細胞培養(yǎng)具有以下特點：（1）野外采集的各時期胚胎樣本中，可鑒別的蚋卵前幼蟲期胚胎保證了培養(yǎng)材料來源的一致性。（2）胚胎發(fā)育時間越短，細胞增殖能力越強，但對消毒劑耐受力較差，不利于細胞系建立。野外采集樣本需經(jīng)多種消毒劑處理，蚋卵前幼蟲期胚胎既保留了胚胎組織增殖潛能，又可有效抵抗多種消毒劑。（3）在原代培養(yǎng)過程中，蚋卵前幼蟲期胚胎組織塊周圍有大量細胞遷移分化，同時可觀察到較多圓形細胞增殖生長?？梢?，蚋卵前幼蟲期胚胎是蚋類細胞系建立的較好組織來源。果蠅、家蠶等也曾應(yīng)用晚期胚胎成功建立了細胞系（Schneider，1972；Xu et al.，2015）。

適宜的細胞培養(yǎng)基利于細胞增殖與分化。國內(nèi)外學者已應(yīng)用Graces、Schneiders和Shields and Sang M3培養(yǎng)基成功建立了果蠅、家蠶等雙翅目昆蟲細胞系（Schneider，1972）。本研究結(jié)果表明，蚋卵（胚胎）組織塊在Graces培養(yǎng)基中細胞遷移生長較少，在Schneiders培養(yǎng)基有部分細胞遷移，在Shields and Sang M3培養(yǎng)基中細胞遷移、分化及部分增殖，在改良型Shields and Sang M3培養(yǎng)基中細胞遷移早，增殖率約達20%。對比Shields and Sang M3與Schneiders培養(yǎng)基的組成成分，發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)基氨基酸組成相似，以必需氨基酸和非必需氨基酸為主，氨基酸含量較高，且培養(yǎng)基中均添加了酵母浸出液，作為多種維生素及嘌呤的主要來源；而Graces培養(yǎng)基中無酵母浸出液，但戊糖含量較高。因此，初步推測高含量的氨基酸及多種維生素和嘌呤物質(zhì)對蚋類細胞培養(yǎng)尤為重要。激素和生長因子是動物細胞培養(yǎng)基中有益的添加劑（Freshney，2014），在Shields and Sang M3培養(yǎng)基中添加胰島素（改良型Shields and Sang M3培養(yǎng)基）可有效促進葡萄糖和氨基酸的攝入和吸收，以利于細胞生長增殖。

Mitsuhashi（2003）對無脊椎動物細胞培養(yǎng)技術(shù)進行總結(jié)，認為昆蟲細胞可在20～30 ℃范圍內(nèi)生長，適宜的培養(yǎng)基pH在6.4左右，大多數(shù)昆蟲細胞對于培養(yǎng)基pH波動并不敏感，因而不需要使用CO2培養(yǎng)箱，一般生化培養(yǎng)箱即可達到培養(yǎng)要求。本研究以此培養(yǎng)條件為基準，結(jié)合蚋類的生長習性，篩選出興義維蚋蚋卵（胚胎）原代細胞培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)方法為組織塊法，培養(yǎng)基為改良型Shields and Sang M3，pH 6.0～6.5，培養(yǎng)溫度28 ℃，有無CO2均可，培養(yǎng)器皿為經(jīng)PLL處理的一次性塑料培養(yǎng)皿/板。

4 結(jié)論

興義維蚋蚋卵（胚胎）原代細胞培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)方法為組織塊法，培養(yǎng)基為改良型Shields and Sang M3，pH 6.0～6.5，培養(yǎng)溫度28 ℃，有無CO2均可，培養(yǎng)器皿為經(jīng)PLL處理的一次性塑料培養(yǎng)皿/板。該培養(yǎng)方法可在科研生產(chǎn)中進一步推廣應(yīng)用，為蚋類細胞系建立打下基礎(chǔ)。

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（責任編輯 蘭宗寶）