木薯過氧物酶基因序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達(dá)特性

叢漢卿 龍婭麗 齊堯堯 朱文麗 陳松筆 喬飛

摘要：【目的】分析木薯Class III過氧化物酶（POD）基因（MePOD）的序列特征，并檢測乙烯（ET）和茉莉酸（JA）逆境信號對其表達(dá)的影響，為研究木薯對逆境脅迫的響應(yīng)和調(diào)控模式及培育抗逆新品種提供理論依據(jù)?！痉椒ā繌哪臼砘蚪M數(shù)據(jù)庫中獲取MePOD基因序列并進(jìn)行分析；以木薯品種華南8號懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測木薯MePOD基因在乙烯利和茉莉酸甲酯（MeJA）處理后的表達(dá)特性。【結(jié)果】MePOD基因編碼區(qū)含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子；轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游1061 bp處；啟動(dòng)子區(qū)域含多個(gè)順式作用元件，但無ET和JA響應(yīng)元件。MePOD蛋白由331個(gè)氨基酸組成，分子量為37.476 kD，理論等電點(diǎn)為8.66；有一個(gè)含信號肽的跨膜結(jié)構(gòu)，是一種陽離子分泌型Class III POD。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，木薯MePOD蛋白與大戟科橡膠樹（Hevea brasiliensis，ADR70870.1）的親緣關(guān)系最近，且除兩種裸子植物外，其他17種被子植物聚為一類，且同一科植物進(jìn)一步相聚，此結(jié)果與進(jìn)化地位一致。qPCR檢測結(jié)果表明，MeJA誘導(dǎo)0.5 h后，MePOD基因表達(dá)量整體上呈先升高后下降的變化趨勢，而乙烯利誘導(dǎo)0.5 h后其表達(dá)量呈緩慢上升的變化趨勢，但整體上維持在本底水平之下。【結(jié)論】JA和ET逆境信號不直接通過相應(yīng)響應(yīng)元件上調(diào)MePOD基因表達(dá)，而與其他激素信號進(jìn)行綜合調(diào)控，并進(jìn)一步參與植物體內(nèi)的抗氧化過程。

關(guān)鍵詞： 木薯；過氧化物酶（POD）基因；乙烯（ET）；茉莉酸（JA）；表達(dá)分析

中圖分類號： S533 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）12-2009-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to analyze sequence characteristics of Manihot esculenta Crantz Class III peroxidase gene（MePOD） and detect its expression stimulated by two stress signals viz.， ethylene（ET） and jasmonic acid（JA） in cassava， in order to lay theoretical foundation for studying response of M. esculenta Crantz to stress and breeding new resistant varieties. 【Method】MePOD gene sequence was obtained from Cassava Genome Database. Using suspension cultured cells of M. esculenta Crantz variety SC8 as materials， expression characteristics of MePOD gene were investigated by real-time quantitative PCR（qPCR） technique after being induced by ethephon and methyl jasmonate（MeJA）. 【Result】Results showed that， coding region of MePOD gene contained four extrons and three introns， and its transcription initiation site was located at the upstream 1061 bp of start codon. There were many cis-acting elements excluding JA and ET responsive elements in promoter region of MePOD gene. Furthermore， MePOD protein was composed of 331 amino acids and 37.476 kD in molecular weight， theoretical isoelectric point was 8.66， and it contained a transmembrane structure with a signal peptid， so it was secretory cationic Class III POD. Phylogenetic tree analysis showed that， MePOD protein of M. esculenta Crantz had a close genetic relationship with POD of Hevea brasiliensis（ADR70870.1） belonging to Euphorbiaceae. Seventeen species of angiosperms were clustered into one category except two species of gymnospermae， and the same family was clustered together. The above results were consistent with evolutionary status. qPCR results showed that， MePOD gene expression increased firstly and then decreased after being induced by MeJA for 0.5 h， whereas MePOD gene expression increased slowly but maintained below background level after being induced by ethephon for 0.5 h. 【Conclusion】In the absence of JA and ET responsive elements， MePOD gene can not be up-regulated directly， but can be regulated by integrating different hormones signals， and then participate in antioxidation processes.

Key words： Manihot esculenta Crantz； peroxidasen（POD） gene； ethephon（ET）； jasmonic acid（JA）； expression analysis

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）屬于大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot），原產(chǎn)熱帶南美洲（Laban et al.，2013），是第六大糧食作物，也是世界三大薯類作物之一，具有高光效、高淀粉產(chǎn)量、抗干旱、耐貧瘠等特性（張何芳等，2012）。逆境脅迫影響植物的生長發(fā)育，但植物會在進(jìn)化過程中形成相應(yīng)的抗脅迫機(jī)制，并通過生理生化指標(biāo)的改變來響應(yīng)各種脅迫（Cheng et al.，2013）。過氧化物酶（POD）是一種重要的植物抗氧化保護(hù)酶，與植物的抗逆性密切相關(guān)，可作為植物應(yīng)對逆境脅迫的生物標(biāo)記之一，其中Class III POD是一種植物特有的分泌型蛋白酶，參與生長素代謝、細(xì)胞壁延伸和加厚、活性氧和活性氮代謝及抗病等生理活動(dòng)（孟艷艷等，2011）。因此，研究POD基因在木薯逆境中的響應(yīng)模式和抗性調(diào)控機(jī)制對提高木薯抗逆性和產(chǎn)量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Class III POD是一個(gè)多基因家族，具有多種同工酶和酶促反應(yīng)類型，參與植物的多個(gè)生命活動(dòng)（Passardi et al.，2005）。1965年，Hinman和Lang發(fā)現(xiàn)Class III POD參與吲哚乙酸（IAA）代謝，具有催化IAA氧化脫羧的能力（Beffa et al.，1990），并證實(shí)Class III POD參與植物激素代謝（Hiraga et al.，2001）。當(dāng)植株受到病原菌侵染時(shí)，Class III POD基因表達(dá)水平上調(diào)（Almagro et al.，2009），表達(dá)蛋白形成結(jié)構(gòu)障礙或產(chǎn)生大量活性氧（ROS）和活性氮（RNS），構(gòu)成一個(gè)高毒性區(qū)，從而抑制侵染部位的擴(kuò)大（Passardi et al.，2005），其中高等植物中Class III POD基因表達(dá)受真菌（Harrison et al.，1995）、病毒（Hiraga et al.，2000）、細(xì)菌（Hilaire et al.，2001）和毒素（Jansen et al.，2004）等誘導(dǎo)，表明Class III POD參與了植物的抗病過程（Ostergaard et al.，2000；Hiraga et al.，2001；Passardi et al.，2004b）。由于Class III POD能催化聚合木質(zhì)素亞基分子在氧化連接過程中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，因此Class III POD也參與了木質(zhì)素合成（Barcelo et al.，2007），但此過程依賴于H2O2的存在（Weir et al.，2005）。此外，Class III POD還參與了細(xì)胞壁的延伸和加厚（Bernards et al.，2004）、纖維伸長（Mei et al.，2009）等過程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，已有學(xué)者研究了番茄（Thaler，1999）、枸杞（段文昌等，2012）、棉花（楊世勇等，2013a，2013b）、青楊（越慧芳等，2013）和長白落葉松（王杰等，2015）等作物中逆境信號分子對Class III類POD基因的表達(dá)調(diào)控作用，但鮮見木薯POD基因響應(yīng)茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信號的文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對木薯Class III POD基因（MePOD）（Manes.16G007300）進(jìn)行序列分析及乙烯利與茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)表達(dá)分析，研究ET和JA信號分子對MePOD基因表達(dá)的影響及其表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究木薯對逆境脅迫的響應(yīng)和調(diào)控模式打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

木薯品種華南8號（SC8）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞由葉片愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)獲得，保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所?？俁NA小量制備試劑盒購自美國Axygen公司；PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 MePOD基因結(jié)構(gòu)及啟動(dòng)子區(qū)序列分析 根據(jù)JGI木薯基因組數(shù)據(jù)庫MePOD的CDS序列和DNA序列（Prochnik et al.， 2012），用GSDS分析其內(nèi)含子相位，用TSSP分析轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，用PlantCARE綜合分析啟動(dòng)子區(qū)序列，尋找順式作用元件位點(diǎn)。

1. 2. 2 MePOD蛋白分析 利用BLAST對MePOD氨基酸序列進(jìn)行比對分析；利用PortParam預(yù)測其蛋白分子量和等電點(diǎn)，利用InterPro預(yù)測結(jié)構(gòu)域，利用TMHMM Server進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測，利用SignalP預(yù)測信號肽，利用PSIPRED預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，利用Swiss-model預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，利用PFP預(yù)測蛋白功能。

1. 2. 3 序列比對和進(jìn)化樹分析 利用MEGA 6.0對18種作物與木薯進(jìn)行POD氨基酸序列比對，并使用鄰接（Neighbor-joining，N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。使用Bootstrap方法1000次重復(fù)對系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行驗(yàn)證。

1. 2. 4 誘導(dǎo)表達(dá) 吸取1 mL處于指數(shù)增長期的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞于離心管中，置于25 ℃搖床穩(wěn)定0.5 h，共3組，其中2組分別用400 μL/L的乙烯利和MeJA處理，另1組未處理為對照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。取處理后0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品，微離心后，棄上清液，于氮液速凍后-80 ℃?zhèn)溆帽４妗?/p>

1. 2. 5 qPCR檢測 按照總RNA小量制備試劑盒說明提取樣品總RNA，利用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。最后，使用SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）實(shí)時(shí)定量試劑盒檢測MePOD基因在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中乙烯利和MeJA誘導(dǎo)表達(dá)情況，以18S rRNA為內(nèi)參。qPCR反應(yīng)體系10.0 μL： 2×SYBR Premix Ex Taq 5.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，以ddH2O補(bǔ)足至10.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所用MePOD基因和18S rRNA引物均用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成，引物序列如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2. 1 基因序列分析結(jié)果

MePOD基因序列（圖1和表2）分析發(fā)現(xiàn)，MePOD基因編碼區(qū)含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子；轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游1061 bp處；啟動(dòng)子區(qū)域包含典型啟動(dòng)子調(diào)控元件CAAT-box和TATA-box、多個(gè)光響應(yīng)順式元件及熱脅迫響應(yīng)的順式元件、分生組織特異活化的順式作用元件、HvMYB結(jié)合位點(diǎn)各1個(gè)等，但無ET響應(yīng)元件和JA響應(yīng)元件。

2. 2 蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

MePOD蛋白由331個(gè)氨基酸組成，分子量為37.476 kD，理論等電點(diǎn)為8.66。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，MePOD屬于Plant_peroxidase_like亞家族，具有Secretory_peroxidase結(jié)構(gòu)域。同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，其與陽離子型POD、分泌型POD和Class III POD相似度最高。跨膜區(qū)預(yù)測分析結(jié)果顯示，MePOD蛋白可能有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，且含信號肽結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，MePOD蛋白含有15個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)和1個(gè)折疊結(jié)構(gòu)，可參考其三級結(jié)構(gòu)（圖2）。蛋白功能預(yù)測結(jié)果顯示，MePOD蛋白最符合Gene Ontology（GO）中的GO：0004601條目，具有POD活性。

2. 3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果

從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）可看出，木薯MePOD蛋白與木本植物如橡膠樹（Hevea brasiliensis，ADR70870.1）、木欖（Bruguiera gymnorhiza，ADD54644.1）和毛白楊（Populus tomentosa，AKE81099.1）親緣關(guān)系較近，其中與同為大戟科的橡膠樹最近，處于同一分支。豆科的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，XP_003610431.1）和鷹嘴豆（Cicer arietinum，NP_001266136.1）處于同一分支，大豆（Glycine max，NP_001237601.1）和菜豆（Phaseolus vulgaris，AHA84196.1）處于同一分支，且四者處于同一大分支上。錦葵科的木棉（Gossypium arboreum，KHG03947.1）和陸地棉（Gossypium hirsutum，AAA99868.1）處于同一分支。山茶科的油茶（Camellia oleifera，ACT21094.1）與?？频拇ㄉ＃∕orus notabilis，XP_010092206.1）親緣關(guān)系也較近，木薯MePOD蛋白與馬鞭草科的海欖雌（Avicennia marina，BAB16317.1）、夾竹桃科的長春花（Catharanthus roseus，AAY-26520.1）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。其他作物如可可（Theobroma cacao，XP_007026071.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_ 567641.1）、文心蘭（Oncidium hybrid cultivar，ABC- 02343.1）均單獨(dú)分支。裸子植物云杉（Picea abies，CAD92856.1）和黑松（Pinus thunbergii，AHN05533.1）位于進(jìn)化樹基部，是較被子植物更原始的類群。綜上所述，除兩種裸子植物外，其他17種被子植物聚為一類，且同一科植物進(jìn)一步相聚，此結(jié)果與進(jìn)化地位一致。

2. 4 基因表達(dá)水平檢測結(jié)果

為排除MePOD基因本底變化造成的影響，將MeJA和乙烯利誘導(dǎo)后的MePOD基因表達(dá)量值除以對照的表達(dá)量。擬合曲線顯示MePOD基因表達(dá)在乙烯利和MeJA誘導(dǎo)后呈不同的響應(yīng)趨勢（圖4），MeJA誘導(dǎo)0.5 h后整體上呈先升高后下降的變化趨勢，乙烯利誘導(dǎo)0.5 h后其表達(dá)呈緩慢上升的變化趨勢，但整體上維持在本底水平之下。

3 討論

細(xì)胞是植物基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，具有所有遺傳信息。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞具有對外界信號響應(yīng)一致的特點(diǎn)，尤其適用于相對表達(dá)量不高、易被背景淹沒的基因表達(dá)分析研究。本研究中，MePOD基因在0.5 h內(nèi)對逆境信號分子作出響應(yīng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，且重復(fù)間誤差均較小，表明供試材料適用于其基因表達(dá)分析。

Class III POD與Class I POD是胞內(nèi)抗壞血酸過氧化物酶（APX）共同的原核起源，但Class III POD是分泌到細(xì)胞壁或周圍介質(zhì)中。Class I POD仍保存著細(xì)菌的基因序列信息，Class III POD則在進(jìn)化中發(fā)生了基因變異，僅保存了蛋白結(jié)構(gòu)上的相似性（Schuller et al.，1996）。所有陸生植物為適應(yīng)高氧的陸生生活均進(jìn)化產(chǎn)生Class III POD（Passardi et al.， 2004a）。這個(gè)多基因家族的進(jìn)化與植物組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、生存環(huán)境及病原物的多樣性密切相關(guān)。本研究通過對木薯MePOD蛋白生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其屬于Plant_ peroxidase_like亞家族，具有Secretory_peroxidase結(jié)構(gòu)域，是一種分泌型POD；其理論等電點(diǎn)為8.66，是一種堿性陽離子型POD。通過同源比對也發(fā)現(xiàn)其與陽離子型POD、分泌型POD和Class III POD的相似度最高。由此推測，MePOD是一種屬于Class III的陽離子分泌型POD。

JA和ET是植物逆境響應(yīng)的信號分子。其中，JA具有誘導(dǎo)植物防御基因表達(dá)、調(diào)控植物對機(jī)械傷害、鹽害及紫外線照射等非生物脅迫反應(yīng)的功能（Wasternack and Hause， 2013）。ET可引起植物多種生理效應(yīng)和形態(tài)建成，如對環(huán)境脅迫反應(yīng)、偏上生長、器官衰老與脫落、種子萌發(fā)、果實(shí)成熟等。此外，多種調(diào)控果實(shí)后熟、植物衰老的酶及由傷害或脅迫誘導(dǎo)的防御蛋白基因序列均含ET響應(yīng)元件（Johnson and Ecker，1998；Bleecker and Kende，2000）。本研究的qPCR檢測結(jié)果顯示，經(jīng)乙烯利和MeJA處理后，MePOD基因表達(dá)呈不同的響應(yīng)趨勢，MeJA處理后0.5～4.0 h MePOD基因表達(dá)上調(diào)，之后又逐漸回落，而經(jīng)乙烯利處理后，MePOD基因表達(dá)整體上維持在本底水平之下。由啟動(dòng)子區(qū)元件分析結(jié)果顯示，MePOD基因既無JA響應(yīng)元件，又無ET響應(yīng)元件，表明其不受ET和JA信號的直接調(diào)控，而是間接調(diào)控。由此推測，JA信號激活了其他信號途徑，從而引起MePOD基因表達(dá)上調(diào)。

大量研究證實(shí)，JA信號能引起POD基因表達(dá)上調(diào)，如外源JA或MeJA可刺激番茄（Thaler，1999）、枸杞（段文昌等，2012）、青楊（越慧芳等，2013）、棉花（楊世勇等，2013a，2013b）和長白落葉松（王杰等，2015）的POD酶活性明顯增加，以增強(qiáng)植物抗性，與本研究結(jié)論一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，ET信號的作用卻相反，說明存在其他機(jī)制造成其下調(diào)并維持在低表達(dá)水平。已有研究證明，ET對抗氧化酶的調(diào)控是以H2O2為中介（孟艷艷等，2014），但ET和H2O2在抗氧化反應(yīng)中的信號傳導(dǎo)機(jī)理還需進(jìn)一步研究。植物中JA和ET與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間激素的交叉互作在整個(gè)生育周期內(nèi)的不同組織器官間、不同類型細(xì)胞中一直存在（Johnson and Ecker，1998；Bleecker and Kende，2000；Wasternack and Hause， 2013），表明不同激素信號的整合共同調(diào)控了植物的生長發(fā)育、對環(huán)境的響應(yīng)及衰老死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，MePOD基因的啟動(dòng)子區(qū)還有其他多種響應(yīng)元件，推測ET和JA與其他不同激素的交叉互作產(chǎn)生了不同的調(diào)控模式，最終造成MePOD基因表達(dá)量的差異。雖然本研究已明確木薯的MePOD基因可受到JA和ET信號影響，并初步確定其表達(dá)特性，但其還能影響哪些生物學(xué)過程及如何影響，仍需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

JA和ET逆境信號不直接通過相應(yīng)響應(yīng)元件上調(diào)MePOD基因表達(dá)，而與其他激素信號進(jìn)行綜合調(diào)控，并進(jìn)一步參與植物體內(nèi)的抗氧化過程。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）