高效液相色譜法測(cè)定西柚不同組織中的10種柑橘黃酮類化合物

王智聰 沙躍兵 余笑波 王珂

摘 要：該文建立了圣草次苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香風(fēng)草苷、枸橘苷、甜橙黃酮、川皮苷和蜜橘黃酮等10種柑橘黃酮類化合物同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜方法。色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（5μm，4.6×150mm），采用甲醇-水（含0.1%甲酸）流動(dòng)相體系，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。方法學(xué)考察結(jié)果表明，對(duì)10種柑橘黃酮類化合物，提取效率均大于95%；在給定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99；方法的精密度和重現(xiàn)性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別小于5.4%和7.1%。該方法用于西柚不同組織中柑橘黃酮類化合物含量的測(cè)定，結(jié)果顯示，柑橘黃酮類化合物在西柚果皮、囊衣和果瓣中的含量和分布差異顯著。

關(guān)鍵詞：柑橘黃酮類化合物；西柚；不同組織；高效液相色譜法

中圖分類號(hào) TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）18-0099-06

Determination of 10 Citrus Flavonoids in Different Parts of Grapefruit by High Performance Liquid Chromatography

Wang Zhicong et al.

（Zhejiang Province Institute of Metrology，Hangzhou 310018，China）

Abstract：A simple method was developed in this paper for simultaneous determination of 10 citrus flavonoids by high performance liquid chromatography，the compounds includes eriocitrin，narirutin，naringin，hesperidin，neohesperidin，didymin，poncirin，sinensetin，nobiletion and tangeretin. The samples were separated by Welch Ultimate XB-C18 column（5μm，4.6×150mm）using methanol and 0.1% formic acid aqueous solution as mobile phases by gradient elution detected by 280nm. The results showed that there are good extraction efficiencies greater than 95%，good linear ranges with good correlation coefficients（r2）greater than 0.99，and good precisions and repeatabilities with relative standard deviations（RSD）less than 5.4% and 7.1% for all 10 citrus flavonoids. The method was used for citrus flavonoids determination in various parts of grapefruit，the results showed that the amounts and distributions of citrus flavonoids have significant differences in grapefruit peel，utricle and pulp.

Key words：Citrus flavonoids；Grapefruit；Different parts；High performance liquid chromatography

西柚，又稱葡萄柚，屬蕓香科柑桔屬植物，由橙和柚天然雜交而成。西柚果實(shí)皮薄汁多，酸甜略帶苦味，風(fēng)味獨(dú)特、口感好，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，深受國(guó)內(nèi)老百姓的喜愛(ài)。李時(shí)珍在《本草綱目》中記載：“柚，功能消食，解酒毒，去腸胃中惡氣，長(zhǎng)發(fā)滋燥，療妊婦不思食口淡”。柚中含有多種對(duì)人體健康有益的活性物質(zhì)，如黃酮類化合物、檸檬苦素類化合物和精油等[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，柚皮提取物具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗衰老、抑酶、降血糖和降血壓等多種功能活性[3-7]。柑橘中的黃酮類化合物主要包括兩類，一是黃烷酮類化合物，多以糖苷的型式存在，如圣草次苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、香風(fēng)草苷和枸橘苷等，其主要區(qū)別是黃酮母體結(jié)構(gòu)A環(huán)-7位和C環(huán)-3′、-4′位置取代基因的差異；其中A環(huán)-7位以蕓香糖苷和新橙皮糖苷為主，形成多種同分異構(gòu)體，如橙皮苷/新橙皮苷、柚皮蕓香苷/柚皮苷、香風(fēng)草苷/枸橘苷等；二是多甲氧基黃酮類化合物，如甜橙黃酮、川皮苷和蜜橘黃酮等，主要區(qū)別在于黃酮母體結(jié)構(gòu)A環(huán)-8位和C環(huán)-3′位甲氧基數(shù)目和位置的差異。

目前柑橘黃酮類化合物的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[8-11]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]等。李利改等[13]研究了不同種類柑橘的花、皮和葉中柑橘黃酮類化合物的分布；吳倩等[14]研究了常山胡柚的皮、肉和籽中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等三種柑橘黃酮的含量分布。本文以西柚整果為研究對(duì)象，探討了西柚可食部分（果瓣）及副產(chǎn)物（果皮和囊衣）等不同組織中柑橘黃酮類化合物的分布特征。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Alliance e2695高效液相色譜，配光電二極管陣列檢測(cè)器和Empower 3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；AG285精密電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；5810R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Christ冷凍干燥濃縮儀（德國(guó)Christ公司）；KQ-100DE數(shù)控超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。甲醇（色譜純）購(gòu)自德國(guó)Merck公司；甲酸（分析純）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氨水（分析純）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)；圣草次苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香風(fēng)草苷和枸橘苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；甜橙黃酮、川皮苷和蜜橘黃酮標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海同田生物技術(shù)有限公司；西柚購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 分別稱取適量圣草次苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香風(fēng)草苷、枸橘苷、甜橙黃酮、川皮苷和蜜橘黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，加適量甲醇（對(duì)橙皮苷，添加少量氨水）漩渦震蕩、超聲溶解，配制濃度均為2.00mg/mL的母液；再用甲醇和水序列稀釋，配制濃度分別為10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、100和200μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對(duì)橙皮苷，增加400、750和1 000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作點(diǎn)，所有標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中甲醇的體積含量約為50%。

1.2.2 樣品的制備 取個(gè)頭適中的西柚?jǐn)?shù)個(gè)，用超純水清洗外皮，并擦干；小心剝離果皮，果瓣去除囊衣；分別收集果皮、囊衣和果瓣，置于-35℃冰箱冷凍12h；再冷凍干燥72h；取出置于粉碎機(jī)粉碎，干燥密閉保存。分別稱取適量上述制備的干燥果皮、囊衣和果瓣樣品，按照1∶25的料液比，加50%的甲醇-水（體積比）溶液，超聲提取30min，取出于7 000rpm離心10min，倒出上清液；殘?jiān)侔凑丈鲜龇椒ㄌ崛?次；合并上清液，混勻，用超純水稀釋2倍后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 液相色譜分析條件 色譜柱：Welch Ultimate XB-C18（5μm，4.6×150mm）；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；流動(dòng)相A：含0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫：30%B（0min）～30%B（2min）～50%B（15min）～70%B（18min）～90%B（25min）～98%B（26min）～98%B（30min）～30%B（31min）～30%B（35min）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；進(jìn)樣體積：10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜分析方法的建立 柑橘類水果成分復(fù)雜，既有極性較大的糖類、氨基酸類、有機(jī)酸類和酚酸類等，又有極性適中的黃烷酮類和極性較小的多甲氧基黃酮等，為了有效地進(jìn)行組分的分離，實(shí)驗(yàn)比較了不同梯度洗脫方式對(duì)分離的影響。在梯度開(kāi)始前采用較低比例的甲醇洗脫一定時(shí)間，有利于洗脫極性較大的干擾雜質(zhì)而不影響目標(biāo)組分的分離，待測(cè)化合物中圣草次苷的極性最大，保留因子k為3.14。待測(cè)化合物中有多種同分異構(gòu)體，如柚皮蕓香苷和柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷、香風(fēng)草苷和枸橘苷、甜橙黃酮和蜜橘黃酮等，在優(yōu)化的梯度條件下各組分均得到了良好的分離。10種柑橘黃酮類化合物的色譜如圖1所示。

2.2 樣品提取條件的優(yōu)化 以西柚果皮為例，考察提取溶劑、料液比、提取時(shí)間及提取次數(shù)等對(duì)提取效率的影響。

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化 稱取冷凍干燥粉碎后的果皮樣品1g（精確至0.001g）6份，按照1∶25的料液比，分別加入25mL 40%、50%、60%、70%、80%和90%的甲醇-水溶液（體積比），超聲提取30min；取出于7 000r離心10min，上清液用超純水稀釋2倍后，進(jìn)行液相色譜分析。在提取方法優(yōu)化中，選擇黃烷酮糖苷類化合物柚皮苷為代表，以及多甲氧基黃酮類化合物蜜橘黃酮為代表。以柚皮苷和蜜橘黃酮為例，在不同提取溶劑的情況下，柚皮苷和蜜橘黃酮提取含量的變化如圖2所示。從圖2可以看出，柚皮苷和蜜橘黃酮含量隨提取溶劑中甲醇含量的增加先增大后減少，在50%甲醇含量的情況下，柑橘黃酮類化合物的提取含量最大。增加提取溶劑中甲醇的含量，有利于柑橘中柑橘黃酮類化合物的浸出；但提取溶劑中甲醇含量太高，柑橘黃酮類化合物的含量反而降低，其原因可能是甲醇的極性較大，反而不利于其浸出。因此，試驗(yàn)中采用甲醇含量為50%的提取溶劑。

2.2.2 料液比的優(yōu)化 稱取冷凍干燥粉碎后的果皮樣品1g（精確至0.001g）6份，按照1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40和1∶50的料液比，分別加入10、20、25、30、40和50mL的50%甲醇-水溶液（體積比），超聲提取30min；取出于7 000r離心10min，上清液用超純水稀釋2倍后，進(jìn)行液相色譜分析。以柚皮苷和蜜橘黃酮為例，在不同料液比的情況下，其含量變化如圖3所示。從圖3可以看出，柑橘黃酮類化合物的含量隨料液比的增加而增加，但料液比大于25后，其含量變化不大?？傮w來(lái)看，增大料液比，提取效率有所增加，但提取液中柑橘黃酮類化合物的濃度變低，考慮到西柚中某些柑橘黃酮類化合物的含量較低，提取液濃度太低，不利于其測(cè)定。因此，試驗(yàn)中采用1∶25的料液比。

2.2.3 提取時(shí)間的優(yōu)化 稱取冷凍干燥粉碎后的果皮樣品1g（精確至0.001g）6份，按照1∶25的料液比，加入25mL 50%的甲醇-水溶液，分別超聲5、10、20、30、45和60min；取出于7 000r離心10min，上清液用超純水稀釋2倍后，進(jìn)行液相色譜分析。以柚皮苷和蜜橘黃酮為例，其含量變化如圖4所示。從圖4可以看出，超聲時(shí)間小于20min，各種柑橘黃酮類化合物的變化差異較大，超聲30min后，其提取效率趨于一致，因此，試驗(yàn)中選擇超聲30min。

2.2.4 提取次數(shù)的優(yōu)化 稱取冷凍干燥粉碎后的果皮樣品1g（精確至0.001g），按照1∶25的料液比，加入25mL 50%的甲醇-水溶液，超聲提取30min，取出于7 000r離心10min，倒出上清液；殘?jiān)偌尤?5mL 50%的甲醇-水溶液分別提取3次。對(duì)每次提取離心后的上清液，用超純水稀釋2倍后進(jìn)行液相色譜分析。以柚皮苷和蜜橘黃酮為例，其提取效率如圖5所示。從圖5可以看出，柑橘黃酮類化合物的含量隨提取次數(shù)的增加而增加，提取2次后，提取回收率大于95%，提取3次后，提取回收率大于99%，試驗(yàn)中選擇提取2次。

2.3 線性關(guān)系、線性范圍和檢出限 對(duì)1.2.1節(jié)配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2.3節(jié)的色譜方法進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)為最低定量濃度，以3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限。各柑橘黃酮類化合物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限如表1所示，結(jié)果表明各柑橘黃酮類化合物在給定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.99，方法的檢出限小于1μg/mL。

2.4 方法精密度 對(duì)1.2.1節(jié)配制的10種柑橘黃酮類化合物的儲(chǔ)備液，用甲醇和水進(jìn)行稀釋，配制濃度均為25.0和150μg/mL的混合質(zhì)量控制溶液，按照1.2.3節(jié)的色譜方法進(jìn)行分析，重復(fù)進(jìn)樣5針，考察各柑橘黃酮類化合物峰面積的變化。對(duì)25.0μg/mL和150μg/mL兩種不同濃度的混合質(zhì)量控制溶液，10種柑橘黃酮類化合物測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5.4%和3.9%，表明方法的精密度良好。

2.5 方法重現(xiàn)性 以西柚果皮為例，稱取5份樣品，按照1.2.2節(jié)的提取方法，獨(dú)立進(jìn)行提取和分析，考察各柑橘黃酮類化合物峰面積的變化。對(duì)10種柑橘黃酮類化合物，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于7.1%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.6 樣品的測(cè)定 對(duì)1.2.2節(jié)制備的西柚果皮、囊衣和果瓣冷凍干燥樣品，每個(gè)樣品獨(dú)立提取3次，按照1.2.3節(jié)的色譜方法進(jìn)行分析，其色譜如圖6所示。

按照2.3節(jié)所述方法進(jìn)行外標(biāo)法定量分析，對(duì)西柚果皮、囊衣和果瓣等不同組織，柑橘黃酮類化合物的含量按照公式1進(jìn)行計(jì)算。

[C=C'×V×Dm] （1）

式中：C表示西柚各組織中柑橘黃酮類化合物的含量（mg/kg），C'表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出的含量（μg/mL），V表示樣品提取的總體積（mL），D表示進(jìn)樣前的稀釋倍數(shù)，m表示樣品的稱取質(zhì)量（g）。

西柚冷凍干燥果皮、囊衣和果瓣中柑橘黃酮類化合物的含量測(cè)定結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，西柚各組織的凍干產(chǎn)品，囊衣中的總黃酮（10種柑橘黃酮的總量）含量最高，達(dá)73.8mg/kg，其次是果皮，總黃酮含量為61.6mg/kg，果瓣中總黃酮含量最低，為6.57mg/kg。在總黃酮含量的比例中，三種組織中柚皮蕓香苷和柚皮苷的含量最高，所占比例大體一致，為87.4%～89.0%。在果皮、囊衣和果瓣中，柚皮苷的含量比例遞減，分別為80.7%、75.0%和61.2%；而柚皮蕓香苷的含量比例遞增，分別為8.5%、12.7%和26.3%，其中果瓣中柚皮蕓香苷的含量分別是囊衣和果皮的2倍和3倍。枸橘苷的含量?jī)H次于柚皮蕓香苷，在果皮、囊衣和果瓣中其占總黃酮的比例分別為7.2%、9.1%和4.0%。橙皮苷和新橙皮苷的含量在三種組織中的含量為0.5%～3.4%，其中果瓣中橙皮苷和新橙皮苷的含量較果皮和囊衣中的含量多5～7倍。三種甲氧基黃酮的含量之和均小于0.5%，其中囊衣中含量最低，接近于0。

通過(guò)上述分析可以看出，西柚的不同組織如果皮、囊衣和果瓣，其中柑橘黃酮類化合物的含量和分布差異顯著，如圖7所示。

西柚鮮果中果皮約占總重的21.4%，囊衣約占8.1%，果瓣約占70.5%；對(duì)各組織冷凍干燥后，果皮失重62.2%，囊衣失重70.0%，果瓣失重92.3%。通過(guò)表2的分析可以看出，柑橘黃酮在凍干后西柚不同組織如果皮、囊衣和果瓣中的含量及其分布，由于各組織在鮮果中重量的不同和含水量的不同，柑橘黃酮類化合物在鮮果中的分布表現(xiàn)出另外的特點(diǎn)，如圖8所示。

比較圖7和圖8可以看出，在西柚不同組織的凍干產(chǎn)品中，果皮、囊衣和果瓣中柑橘黃酮類化合物的總量分別占西柚總黃酮含量的43.4%、52.0%和4.6%；而在鮮果中，果皮、囊衣和果瓣中柑橘黃酮類化合物的總量分別占西柚總黃酮含量的74.2%、20.4%和5.3%。由于果皮和囊衣含水量相近，而果皮比囊衣所占西柚總質(zhì)量的比重較大，導(dǎo)致鮮果中果皮所含黃酮的總量占比加大，從43.4%上升至74.2%，相反，囊衣所含黃酮的總量從52.0%下降至20.4%。對(duì)總黃酮中含量較高的柚皮蕓香苷和柚皮苷來(lái)講，有相同的變化趨勢(shì)。果瓣為西柚鮮果的可食部分，其中柑橘黃酮的含量約占西柚鮮果總黃酮含量的5.3%，西柚中大部分的柑橘黃酮存在于果皮和囊衣中。另外，西柚不同組織中所含柚皮蕓香苷和柚皮苷的含量差異巨大，果瓣中含有較多的柚皮蕓香苷，在柑橘類水果中呈現(xiàn)出西柚獨(dú)特的口感和風(fēng)味。

3 結(jié)論

本文建立了西柚不同組織中10種柑橘黃酮類化合物的測(cè)定方法，通過(guò)色譜分離條件的優(yōu)化，各組分取得了良好的分離度，該方法提取效率高、線性關(guān)系好、檢出限低、精密度高。該方法用于西柚不同組織中柑橘黃酮類化合物含量的測(cè)定，結(jié)果顯示西柚果皮、囊衣和果瓣中柑橘黃酮類化合物的含量和分布特征差異顯著。所建立的方法對(duì)西柚加工副產(chǎn)物的綜合利用，西柚產(chǎn)品的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)、保健和藥理研究，以及柑橘黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的純化制備等具有重要的意義。

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