可可種質(zhì)資源果實(shí)色澤多樣性分析

秦曉威 吳剛 李付鵬 賴劍雄 陳鵬 郝朝運(yùn) 宋應(yīng)輝

摘 要 以86份可可核心種質(zhì)資源為試材，利用計(jì)算機(jī)圖像信息及其處理技術(shù)對(duì)可可果實(shí)色澤數(shù)字圖像進(jìn)行解析，采集果實(shí)色澤典型色域的CMYK模式參數(shù)，通過聚類分析及主成分分析方法對(duì)色澤指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明：C、M、Y、K值能較準(zhǔn)確科學(xué)地表現(xiàn)可可果實(shí)色澤，可以反映種質(zhì)間的差異。UPGMA聚類分析和主成分分析將可可果實(shí)色澤分為2大類9組，區(qū)分結(jié)果符合可可果實(shí)色澤的自然分類屬性。其中綠色為果實(shí)的基礎(chǔ)色，紅色為漸變的渲染色，形成豐富的9組色澤：墨綠色、青綠色、灰綠色、淺綠色、青白色、棗紅色、紅綠色、紫紅色和深紫色?？梢?，可可果實(shí)色澤能夠作為一項(xiàng)重要的分類參考指標(biāo)，為可可新品種選育和優(yōu)異種質(zhì)資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 可可；果實(shí)色澤；數(shù)字化描述；多樣性

中圖分類號(hào) S685.99 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

The Diversity Analysis of Cocoa Pod Color of

Theobroma cacao L. Accessions

QIN Xiaowei1，2， WU Gang1， LI Fupeng1， LAI Jianxiong1，

CHEN Peng1， HAO Chaoyun1，2， SONG Yinghui1，2 *

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops，

Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract The colors of the pod collected from 86 cocoa accessions were digitally described and determined by using the computer information technology combined with digital images to extract the parameters of CMYK pattern in the typical color region. The UPGMA clustering analysis and PCA analysis were carried out based on the data. The results showed that the value of C， M， Y， and K could more accurately and scientifically represent the colors of pod and reflect differences among accessions of cocoa. The 86 cocoa accessions could be divided into two types， and nine groups on the basis of pod color parameters. The clustering analysis results were basically consistent with the natural classification. Additionally， cocoa pod color is determined by the degree of red pigment that is superimposed over the base green color of the pod during development. Thus， it formed nine groups， black green， dark green， gray green， light-green， bluish white， purplish red， red-green， purple red， and deep-purple. The results showed that pod color parameters in cocoas might be a suitable index to assess the classification of the different cocoa accessions. The investigation could provide a reference for future breeding new varieties and the utilization of the germplasm resources.

Key words Theobroma cacao L.； Cocoa pod color； Digital description； Diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.007

可可（Theobroma cacao L.， 2n=20），又稱巧克力樹，為梧桐科（Sterculiaceae）可可屬（Theobroma）多年生熱帶經(jīng)濟(jì)作物。據(jù)Henderson等[1]考古證實(shí)，可可約有3 000多年的食用歷史。截至2013年，世界可可收獲面積達(dá)1.01×107 hm2，產(chǎn)量約4.6×106 t，其中，主產(chǎn)國科特迪瓦占總產(chǎn)量的29.4%，其次為印度尼西亞（19.1%）、加納（14.9%）、尼日利亞（10.1%）、喀麥?。?.2%）和巴西（5.5%）[2]。中國可可引種歷史相對(duì)較短，1922年首次由印度尼西亞和爪哇地區(qū)引入臺(tái)灣嘉義、高雄等地試種[3]，20世紀(jì)50年代又先后從越南、泰國、馬來西亞、巴布新幾內(nèi)亞等國家引進(jìn)可可種質(zhì)，在海南萬寧等地試種成功。目前，主要栽培于海南和臺(tái)灣地區(qū)，云南、廣東、福建等地也有零星分布[4-5]。作為一種深受人們喜愛的飲料食品以及具有重要用途的熱帶農(nóng)產(chǎn)品，可可長期以來存在需求旺盛與供應(yīng)不足的問題，我國每年僅原料豆就需進(jìn)口約1.5×105 t，且年進(jìn)口增長率約為10%～15%[6]。隨著生活水平不斷提高和飲食結(jié)構(gòu)變化，我國對(duì)可可的需求量還將大幅增加。

可可果實(shí)的鮮艷色澤常吸引松鼠、猴子等動(dòng)物取食以完成種子散布與后代繁衍[7-8]，這也是研究其起源、進(jìn)化與遺傳分類的重要性狀之一。最早從事可可種質(zhì)資源形態(tài)學(xué)分類的學(xué)者van Hall[9]認(rèn)為，可可分為中美洲的Theobroma cacao ssp. cacao和南美洲的Theobroma cacao ssp. sphaeorocarpum亞種，分別包含Criollo和Forastero兩大遺傳類群。其中Forastero遺傳類群根據(jù)果實(shí)色澤分為Cundeamor verugosa amarillo（amarillo，西班牙語為“綠色”）、Cundeamor verugosa colorado（colorado，西班牙語為“紅色”）、Liso amarillo、Liso colorado、Amelonado amarillo、Amelonado colorado、Calabacillo amarillo和Calabacillo colorado等8個(gè)類別。之后，研究者觀察到不同可可種質(zhì)果實(shí)色澤的變異度較為豐富，基本存在由淺綠色至深綠色、由紅色至深紫色的變異規(guī)律，而中間狀態(tài)的色澤特征被描述為“在綠色的底層上渲染了紅色”[10-12]。Bartley[13]認(rèn)為花青素的累積差異是形成可可果實(shí)色澤變異的主要原因。此外，可可果實(shí)色澤屬于寡基因性狀（oligogenic trait），但由于顯性效應(yīng)的存在而不能簡單地依據(jù)雙親果實(shí)色澤性狀來預(yù)測雜交后代的色澤發(fā)生情況[14]。而且可可為常異花授粉作物，種質(zhì)間花粉的蟲媒、風(fēng)媒傳播更容易獲得色澤性狀變異豐富的雜交后代，這為形成豐富的可可果實(shí)色澤提供了遺傳基礎(chǔ)。

近年來，果實(shí)色澤的遺傳分類與形成機(jī)理逐漸成為農(nóng)作物種質(zhì)資源學(xué)研究的熱點(diǎn)話題之一[15-17]。然而，關(guān)于可可果實(shí)色澤的研究基礎(chǔ)相對(duì)較為薄弱，自Engels[18]首次制定出可可種質(zhì)資源描述規(guī)范以來，可可果實(shí)色澤的描述基本以目測并通過衡量花青素含量的強(qiáng)弱等級(jí)（0=沒有，3=少許，5=中等，7=較多）進(jìn)行鑒定?？紤]到果實(shí)發(fā)育過程中色澤變化帶來的對(duì)果實(shí)色澤描述的差異，國際熱帶農(nóng)業(yè)研究與高等教育中心（CATIE）規(guī)定了可可色澤描述時(shí)應(yīng)盡量選擇2個(gè)月大小的未成熟可可果實(shí)[19]。近年來，數(shù)字化技術(shù)在準(zhǔn)確獲取色彩信息及其在色澤豐富的遺傳多樣性分析中的成功應(yīng)用[20-21]，為可可果實(shí)的色澤描述提供了一條科學(xué)便捷規(guī)范的技術(shù)路線。為了能夠進(jìn)一步了解可可果實(shí)的色澤變化特點(diǎn)，本研究利用數(shù)碼圖像和計(jì)算機(jī)信息技術(shù)對(duì)可可種質(zhì)資源果實(shí)色澤信息進(jìn)行采集，通過提取典型色域的CMYK模式參數(shù)，應(yīng)用聚類和主成分分析，從果實(shí)色澤變化的角度去揭示可可種質(zhì)資源的多樣性，為今后可可種質(zhì)資源分類、新品種選育及資源保護(hù)與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

于2013年10～11月，以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所熱帶香料飲料作物種質(zhì)資源圃保存的86份可可核心種質(zhì)資源為采集對(duì)象。土壤為黃色磚紅壤，有良好的水肥一體化灌溉條件，管理水平中等，蔭蔽度60%～80%，每份種質(zhì)種植5株，栽培措施中未使用植物生長調(diào)節(jié)劑。

為保證所測顏色具有代表性，參考Phillips等[19]對(duì)可可果實(shí)色澤描述的要求，取可可樹干高100～150 cm處的2個(gè)月未成熟果實(shí)。采摘時(shí)選擇顏色較為均勻、無可可盲蝽叮咬且具有代表性的可可果實(shí)。每份資源隨機(jī)選取3株，每株采摘果實(shí)數(shù)量為3個(gè)，避免表皮磨損，采后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，2～3 h完成拍照。選擇天氣連續(xù)晴朗時(shí)期，在3個(gè)工作日內(nèi)完成對(duì)86份可可種質(zhì)資源果實(shí)色澤的圖像信息采集。

1.2 圖像拍攝

在相同光源下用同一相機(jī)拍攝。相機(jī)機(jī)身為Canon EOS5D，鏡頭為Canon 100 mm F2.8微距鏡頭。機(jī)身設(shè)置：光圈優(yōu)先，鏡頭光圈F8，白平衡設(shè)置為日光模式，人工光源為71 cm專業(yè)翻拍臺(tái)套裝，包括71 cm翻拍臺(tái)，燈罩4只（帶方向燈頭，可上下左右調(diào)節(jié)方向），45 W 5 500 K三基色專業(yè)攝影燈泡4只，20～60 cm可調(diào)節(jié)燈架4只。背景選用黑色臺(tái)布，將果實(shí)置于背景臺(tái)布中央拍照。

1.3 色彩模式選擇及數(shù)據(jù)采集方法

依據(jù)不同的使用范圍，彩色圖像的色彩模式主要有RGB、Lab和CMYK模式。其中，RGB是由光源產(chǎn)生顏色，由R（紅色）、G（綠色）和B（藍(lán)色）3種基色光混合疊加而成，主要用于電視機(jī)、顯示屏、幻燈片、網(wǎng)絡(luò)、多媒體等利用色光顯色顏色的彩色模式，但R、G和B值大小變化復(fù)雜，難以根據(jù)其辨別出具體顏色[20]。Lab色彩模式是由亮度L、紅綠色彩要素a和黃藍(lán)色彩要素b組成，能定義的色彩最多，但a、b是指顏色比值，人們無法感官認(rèn)識(shí)，不能準(zhǔn)確地用數(shù)字表現(xiàn)出來一種顏色的含量[21]。此外，Lab模式的測定方法須有特定儀器。與上述兩種模式不同，CMYK模式根據(jù)紙上油墨的吸收特性來定義顏色，是一種減色色彩模式，即當(dāng)陽光照射到一個(gè)物體上時(shí)，這個(gè)物體將吸收一部分光線，并將剩下的光線進(jìn)行反射，反射的光線就是人們所看見的物體顏色。C（青色）、M（洋紅色）、Y（黃色）和K（黑色）可以準(zhǔn)確地用數(shù)字來描述一種顏色的多少，每一個(gè)像素的每一種印刷油墨會(huì)被分配一個(gè)百分比值，更有利于材料色彩的再現(xiàn)。因此，根據(jù)RGB、Lab和CMYK模式的使用范圍，本研究選用CMYK色彩模式進(jìn)行可可果實(shí)顏色的測定。

在Adobe Photoshop CS軟件中打開CMYK色彩模式，將照片添加到選區(qū)，選擇“視圖”-“顯示”-“網(wǎng)格”添加網(wǎng)格線。將果實(shí)長軸方向水平放置，如有偏離，選擇“圖像”-“旋轉(zhuǎn)畫布”調(diào)整任意角度使其與水平方向平行。選用矩形選取工具沿果實(shí)頂端至基部水平方向的中部，用裁剪工具進(jìn)行切割，切割面積占總面積的1/3。利用黃金分割0.618原理（從果實(shí)頂端算起），通過標(biāo)尺計(jì)算切割果實(shí)的水平長度乘以0.618，得出待測色區(qū)域。利用吸取工具于待測色區(qū)域的每一網(wǎng)格中心測C、M、Y、K的百分比值，所求數(shù)值的平均值即表示果實(shí)的顏色。

1.4 聚類與主成分分析

根據(jù)采集的C、M、Y、K指標(biāo)參數(shù)，構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS 17.0軟件對(duì)可可果實(shí)色澤參數(shù)分別進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析和主成分分析，依據(jù)聚類樹狀圖和主成分散點(diǎn)圖，對(duì)不同種質(zhì)進(jìn)行歸類分級(jí)，評(píng)價(jià)果實(shí)色澤遺傳特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同可可種質(zhì)果實(shí)色澤差異

由表1可知，86份可可種質(zhì)果實(shí)色澤的C、K、M、Y值均表現(xiàn)出極顯著的差異，其中C值值域?yàn)?6.75～72.80（F85，1634=180.37，Pr<0.000 1），K值值域?yàn)?.00～66.20（F85，1634=70.08，Pr<0.000 1），M值值域?yàn)?.05～98.70（F85，1634=340.80，Pr<0.000 1），Y值值域?yàn)?6.00～98.75（F85，1634=22.75，Pr<0.000 1），說明可可果實(shí)色澤的多樣性極為豐富。由圖1可見，C、K、M、Y值頻率分布變化規(guī)律明顯不同。C、M值呈雙峰型變化趨勢（圖1-A，1-C），Y值呈單峰型變化趨勢（圖1-D），而K值呈遞減變化趨勢（圖1-B）。

2.2 不同可可種質(zhì)果實(shí)色澤聚類分析

以C、M、Y、K為果實(shí)色澤參數(shù)變量，計(jì)算各個(gè)種質(zhì)間的Euclidean遺傳距離，采用UPGMA聚類法對(duì)86份供試材料進(jìn)行聚類分析（圖2），從樹狀圖可以看出，在遺傳距離67.25處86個(gè)供試材料可分2大類，第1類為包含YLDDZ8、STSZ11等53份種質(zhì)的綠色類，第2類為包含STS9-2、ZYP7-9等33份種質(zhì)的紅色類，區(qū)分結(jié)果符合可可果實(shí)色澤的自然分類屬性。在遺傳距離26.90處劃分為9大組，第1組為墨綠色，包含YLDDZ8、ZYP2-8、ZYP6-5等27份種質(zhì)；第2組為青綠色，包含YLDDZ5、STSZ1、BGL14等8份種質(zhì)；第3組為灰綠色，包含STSS4、STSS14、ZYP1-2等9份種質(zhì)；第4組為淺綠色，包含BGL8、ZYP5-7、ZYP1-18等8份種質(zhì)；第5組為青白色，只有STSZ11種質(zhì)，極為少見，屬于特殊類；第6組為棗紅色，包含YLDDZ14、ZYP4-9、STS9-2等9份種質(zhì)；第7組為紅綠色，該類紅色的果實(shí)色澤中夾雜著少許的綠色，屬于綠色和紅色類別間的過渡類型；第8組為紫紅色，包含ZYP4-7、ZYP8-9、STSZ10等15份種質(zhì)；第9組為深紫色，包含ZYP2-4、ZYP6-6、ZYP7-9等3份種質(zhì)。

2.3 不同可可種質(zhì)果實(shí)色澤主成分分析

對(duì)原始矩陣進(jìn)行主成分分析，前兩個(gè)主成分分別能夠解釋果實(shí)色澤遺傳差異的57.75%和28.64%，占總變異的86.39%。位置靠近者關(guān)系密切，遠(yuǎn)離者表示關(guān)系疏遠(yuǎn)，根據(jù)主成分二維散點(diǎn)圖（圖3），將位置靠近的種質(zhì)劃歸在一起，可將供試材料劃分成2大類9個(gè)組。綠色類包含墨綠色、青綠色、灰綠色、淺綠色和青白色，而紅色類包含棗紅色、紅綠色、紫紅色和深紫色。與聚類分析結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

果實(shí)色澤描述是可可植物學(xué)分類、新品種培育與種質(zhì)資源創(chuàng)新利用的重要性狀，同時(shí)也是困擾農(nóng)藝工作者的難題。為解決可可果實(shí)色澤性狀分類鑒定不清的問題，本研究利用數(shù)字化描述方法對(duì)86份可可核心種質(zhì)的果實(shí)色澤進(jìn)行分析，該方法可以通過獲取具體、準(zhǔn)確的色澤數(shù)據(jù)信息來比較色澤差異。結(jié)果顯示，可可果實(shí)色澤具有豐富的遺傳多樣性，C（青色）、M（洋紅色）和Y（黃色）參數(shù)是決定可可果實(shí)色澤的主要因子。比較C、M、Y、K頻率分布規(guī)律可知，大部分可可果實(shí)色澤的Y較大，其次為C、M值，K值相對(duì)較小。當(dāng)C值越大、M值越小的條件下，隨著Y值的減小可可果實(shí)色澤由深綠色變淺綠色；當(dāng)C值越小、M值越大的條件下，隨著Y值的增加可可果實(shí)色澤由紫紅色變深紅色。由此可見，可可種質(zhì)果實(shí)色澤可籠統(tǒng)地描述為綠色和紅色，這與Wood和Lass[10]及Hui[11]等研究的泛性描述結(jié)論是一致的。因此，可可果實(shí)色澤數(shù)字化信息的應(yīng)用，不僅能夠全面反映不同可可種質(zhì)果實(shí)色澤的差異，而且便于圖像信息的存儲(chǔ)與輸出，體現(xiàn)了這種色彩界定方法高度的一致性、可移植性和可還原性，為可可果實(shí)的色澤描述確定了一條科學(xué)便捷規(guī)范的技術(shù)路線。

關(guān)于可可果實(shí)色澤的描述及其豐富性尚無統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。通常研究者多利用花青素含量的強(qiáng)弱等級(jí)進(jìn)行劃分[18]，該方法并不能描述出可可果實(shí)的具體色澤，而且其判斷多以成熟可可果實(shí)的花青素為基礎(chǔ)。然而，Phillips等[19]認(rèn)為可可果實(shí)成熟過程對(duì)色澤描述的干擾較大，主觀性太強(qiáng)，并建議選擇2個(gè)月大小的未成熟果實(shí)進(jìn)行可可色澤描述。此外，可可新品種DUS測試指南中，將可可果實(shí)色澤粗略地描述為：黃綠色、黃色、橘黃色、中紅色、深紅色和紫色[22]。其中，黃綠色、黃色和橘黃色是果實(shí)成熟后的色澤，為可可泛性屬性，極易受葉綠素降解程度的干擾，而對(duì)于可可果實(shí)基本色澤的描述不具有代表性。本研究結(jié)果表明，可可果實(shí)基本色澤可分綠色和紅色2大類9組，區(qū)分結(jié)果符合可可果實(shí)色澤的自然分類屬性[11-12]。其中綠色是果實(shí)的基礎(chǔ)色，紅色是漸變的渲染色，形成了豐富的9組色澤，即墨綠色、青綠色、灰綠色、淺綠色、青白色、棗紅色、紅綠色、紫紅色和深紫色。其中，墨綠色和灰綠色為可可果實(shí)色澤的典型類別，但在可可新品種DUS測試指南、可可種質(zhì)資源描述規(guī)范中均未有記錄。此外，研究還鑒定出STSZ11種質(zhì)為青白色，具有較低的C值、M值和K值，分別僅為26%、2%和0，果實(shí)色澤特異。

果實(shí)色澤的準(zhǔn)確采集和評(píng)價(jià)，可為可可品種鑒別和創(chuàng)新利用提供新的參考指標(biāo)。厄瓜多爾主栽的Nacional品種具有特殊的花香味等優(yōu)點(diǎn)，約占國際優(yōu)質(zhì)可可供應(yīng)總量的75%，價(jià)格比普通可可豆高40%左右，但是Nacioanl品種產(chǎn)量低，約897 kg/hm2，市場供需矛盾極為突出。CCN51品種具有產(chǎn)量高、抗病性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)量高達(dá)1 641 kg/hm2，但是其酸味、澀味過高且不具有特殊的香氣風(fēng)味，品質(zhì)不佳[23]。一直以來，育種家致力于以Nacional和CCN51為親本選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的雜交后代，但雜交后代的早期鑒別是面臨的難題，大大降低了育種效率。Nacional品種果實(shí)顏色為綠色，而CCN51品種果實(shí)顏色為紅色，近年來，有研究者正在利用兩者的色澤差異，通過篩選與綠色和紅色性狀相關(guān)的候選基因，開發(fā)對(duì)色澤性狀具有顯著效應(yīng)的功能基因或SNP分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)雜交后代的早期快速鑒定[14]。此外，可可為典型的“熱帶莖生植物”，豐富的可可果實(shí)色澤為園林景觀設(shè)計(jì)提供了素材來源，具有潛在的旅游開發(fā)利用價(jià)值。因此，對(duì)可可果實(shí)色澤的分類鑒定不僅為育種家和園林景觀設(shè)計(jì)者提供所需的材料資源，而且有利于可可資源的開發(fā)利用與保護(hù)。

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