阿扎霉素F_5a抗南方根結線蟲和香蕉枯萎病菌活性研究

羅少娥 解修超 曾慶飛 雒丹丹 申張鵬

摘 要 為尋找抗線蟲和香蕉枯萎病菌的天然產物。從鏈霉菌211726的發(fā)酵液中分離純化出阿扎霉素F5a，以南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）為供試線蟲，采用擊倒實驗，測定阿扎霉素F5a高（1.0%）、中（0.1%）、低（0.01%）3個濃度的抗線蟲活性；同時以尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）為供試菌株，采用牛津杯瓊脂平板法，對阿扎霉素F5a的抗香蕉枯萎病活性進行研究。結果表明：1.0%的阿扎霉素F5a溶液在24 h內對供試線蟲2齡幼蟲的平均校正擊倒率和平均校正死亡率分別為86.1%和84.5%；0.01%的阿扎霉素F5a溶液對供試線蟲2齡幼蟲平均校正擊倒率和平均校正死亡率分別為57.2%和54.7%，20 mg/mL的阿扎霉素F5a對尖孢鐮刀菌的抑菌圈直徑為2.93 cm。說明阿扎霉素F5a對南方根結線蟲2齡幼蟲（J2）具有顯著的毒殺作用，同時對香蕉枯萎病菌具有顯著抑制作用，顯示阿扎霉素F5a在生物農藥方面具有良好的研究和開發(fā)價值。

關鍵詞 阿扎霉素F5a ；根結線蟲 ；香蕉枯萎病 ；尖孢鐮刀菌

分類號 S432.4 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.03.008

Abstract To find the natural products with resistance to banana wilt and nematode. Azalomycin F5a was isolated and purified from the fermentation broth of Streptomyces sp. 211726. Meloidogyne incognita were used as the tested nematodes， using knockout experiments to measure azalomycin F5a with resistance to Meloidogyne incognita at three concentrations of high （1.0%）， medium （0.1%）， low （0.01%）； while against a reference strain Fusarium oxysporum f. sp. cubense and the Oxford Cup agar method were conducted to study the anti-banana fusarium wilt activity of azalomycin F5a. In 24 h， the average revised knock-down rate and the average corrected mortality rate of 1% bioactive substances water solution with activity against J2 were 86.1% and 84.5%， while the average revised knock-down rate and the average corrected mortality rate of 0.01% bioactive substances water solution still reached 57.2% and 54.7%. The inhibition zone diameter of 20 mg/mL of azalomycin F5a against Fusarium is 2.93 cm； The result indicated that azalomycin F5a has significant toxicity against 2nd instar larval （J2） survival of Meloidogyne incognita， while has a significant antagonistic effect against the banana fusarium wilt disease. These results demonstrated azalomycin F5a has shown good price in the research and development of biological pesticides.

Keywords Azalomycin F5a ； Meloidogyne ； banana fusarium wilt ； Fusarium oxysporum

根結線蟲屬于側尾腺口綱（Secernentea）墊刃目（Tylenchida）異皮總科（Heteroderidae）根結線蟲屬（Meloidogyne）。根結線蟲病主要由南方根結線蟲（M. incognita）、花生根結線蟲（M. arenaria）、爪哇根結線蟲（M. javanica）、象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）和北方根結線蟲（M. hapla）造成。它是一類固定型內寄生病原線蟲，在世界范圍內廣泛分布，可以寄生 2 000多種植物[1]。南方根結線蟲是能夠引起嚴重植物病害的重要病原線蟲之一，可以寄生單子葉和雙子葉植物，寄主范圍廣泛，在世界各地均有分布，是熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)最重要的植物病原線蟲[2]。根結線蟲病目前尚缺乏有效的防治辦法，其防治已成為世界性難題。目前應用較多的還是化學防治。但化學防治存在毒性大，對環(huán)境不友好等問題，所以根結線蟲的生物防治是目前重點關注的方向之一。

香蕉枯萎病又名香蕉巴拿馬病、黃葉病，其病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense），在世界各地都有發(fā)生，是香蕉生產中的一種毀滅性病害，摧毀了全世界近萬公頃的蕉園[3]。目前尚無有效防治香蕉枯萎病的化學藥劑，采用種植抗病品種、與水生作物輪作和生物防治是當前防治香蕉枯萎病比較有效的途徑。其中，生物防治日益受到重視，國內外關于香蕉枯萎病的生物防治主要集中在香蕉枯萎病拮抗菌的篩選及室內防治上，而篩選到具有抗香蕉枯萎病的化合物很少報道。

阿扎霉素F5a為多種鏈霉菌所產的代謝產物，屬于大環(huán)內酯類化合物，具有廣譜的抗菌作用，包括多種真菌、細菌，其中含有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等耐藥性菌株，同時對人結腸腫瘤細胞HCT-116有中等毒性[4-5]。本研究從鏈霉菌211726發(fā)酵液中分離純化出阿扎霉素F5a[5]，對阿扎霉素F5a抗南方根結線蟲和香蕉枯萎病菌活性進行研究，以期發(fā)現該類農作物病害的生物防治新藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料及培養(yǎng)基

鏈霉菌211726 （Streptomyces sp.211726），由江西農業(yè)大學生物科學與工程學院袁干軍博士課題組提供；香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense），由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所提供。供試線蟲，純種的南方根結線蟲（M. incognita）經溫室盆栽保存。

YE培養(yǎng)基[5]：酵母粉4 g，麥芽浸膏粉10 g，葡萄糖4 g，氯化鈉3 g，去離子水1 000 mL，起始pH 7.2～7.4；

發(fā)酵培養(yǎng)基[5]：葡萄糖10 g、可溶性淀粉35 g、酵母粉2 g、干酪素4 g，氯化鈉18 g，去離子水1 000 mL，起始pH 7.2。

1.1.2 儀器與設備

C18填料（大曹DAISOGEL ODS反相填料）；硅膠薄層層析板GF254，硅膠200-300目（青島海洋化工）；甲醇和乙腈，色譜純；其它試劑為國產分析純。手提式壓力蒸汽滅菌器XFS280（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；pHS-3C酸度計（彭州市中亞嘉華電器廠）；桌上式（垂直送風）超凈工作臺VD-850型[1]（蘇州智凈凈化設備有限公司）；高效液相色譜儀（島津LC-10AD型）；RE-201C 旋轉蒸發(fā)儀（鞏義市英峪予華儀器廠）；SCIENTZ-10N冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

1.2.1 .1 色譜條件

色譜柱：依利特SinoChrom ODS-BP （4.6 mm×250 mm，5 μm）：流動相：乙腈-0.05 mol/L pH 7.2的磷酸緩沖液（60∶40，體積比）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：223 nm；進樣量：20 μL；柱溫：室溫。

阿扎霉素F5a保留時間為6.5 min，計算含量方法：歸一化法。

1.2.1.2 種子培養(yǎng)

將菌株鏈霉菌211726用YE瓊脂平板活化，接種于裝有400 mL YE培養(yǎng)基的2 000 mL三角瓶中，于30℃下，190 r/min的搖床上培養(yǎng)3～4 d，作為種子液。

1.2.1.3 發(fā)酵

將種子液以15%的接種量，接種到含有l(wèi) L培養(yǎng)基的5 L錐形瓶中，在30℃下，190 r/min的搖床上搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵11 d時收獲發(fā)酵液。

1.2.1.4 化合物的分離純化

鏈霉菌211726的發(fā)酵液，加入4倍體積的90%甲醇，室溫浸提3次，每次4 h，得提取液。減壓濃縮至不含甲醇，凍干，得凍干粉。取凍干粉100 g，上硅膠柱，依次用氯仿：甲醇溶劑系統(tǒng)（100∶0，90∶10，80∶20，75∶25，0∶100）洗脫，經HPLC（高效液相色譜）檢測，合并得目標產物組分，將該部分減壓濃縮，取5 g用80%甲醇溶解，上反相C18柱層析，先用20%的甲醇洗下極性大的雜質，再用70%的甲醇進行洗脫，洗脫速度為1～2滴/s，分管收集洗脫液，經HPLC檢測，將目標化合物純度大于95%的洗脫液合并。減壓濃縮至不含甲醇，凍干得供試樣品。

1.2.1.5 供試溶液的制備

將經鑒定為純種的南方根結線蟲的單塊卵囊孵化出2齡幼蟲（J2）水溶液，接種于用滅菌土培育的盆栽番茄苗根部，在溫度為25℃～28℃的溫室內繁殖保存。需要靶標線蟲時，從感染根部挑取新鮮卵囊，用0.4%NaClO消毒3 min，再用無菌水清洗3次后置于淺盤濾紙上恒溫遮光孵化，制備2齡幼蟲液，每隔24 h換水1次，保證每次選用的2齡幼蟲新鮮且活力一致。

尖孢鐮刀菌測試用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，取馬鈴薯200 g煮沸30 min，4層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水至1 000 mL。

抗線蟲測試用供試品溶液的制備：用無菌水將阿扎霉素F5a分別配制成濃度為1.0%、0.1%、0.01%的混懸水溶液，pH 7.0～8.0。

抗香蕉枯萎病菌測試用供試品溶液的制備：精密稱取適量阿扎霉素F5a樣品，溶于二甲基亞砜，定容，混勻，配制成濃度為20 mg/mL的供試品溶液。

1.2.2 項目測定

1.2.2.1 抗根結線蟲活性測定

取0.2 mL（約200條J2）的南方根結線蟲液于24孔細胞培養(yǎng)板中，將配制成的1.0%、0.1%和0.01%阿扎霉素F5a水溶液，各取1 mL加入盛有線蟲液的培養(yǎng)孔內，混勻。每個化合物濃度為1個處理，每個處理做3次重復，并設立無菌水處理作為對照。在25～28℃靜置24 h后于倒置顯微鏡下觀察，僵直不動的蟲體視作被擊倒，計算校正擊倒率；將被擊倒的線蟲吸入清水中24 h后鏡檢，不能復活的算作死亡，計算線蟲校正死亡率。試驗結果的計算方法如下：

擊倒率（%）=（擊倒線蟲數/處理線蟲數）×100

校正擊倒率（%）=[（處理擊倒率-對照擊倒率）/（1-對照擊倒率）]×100

死亡率（%）=（死亡線蟲數/處理線蟲數）×100

校正死亡率（%）=[（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）]×100

1.2.2.2 抗香蕉枯萎病菌活性測定

將活化的香蕉枯萎病菌孢子懸液（孢子濃度為1.0×107 CFU/mL）100 μL加入冷卻至50℃左右的15 mL PDA培養(yǎng)基中輕輕搖動，待培養(yǎng)基冷卻后在培養(yǎng)基中央放置一無菌的牛津杯，再將100 μL化合物溶液注入牛津杯中，以100 μL二甲基亞砜做對照，重復3次，28℃培養(yǎng)3 d觀察并測量化合物的抑菌圈直徑大小。

1.2.3 數據分析及處理

采用excel進行數據處理，SPSS軟件進行均值和方差計算，鄧肯氏新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 阿扎霉素F5a的發(fā)酵與分離制備

菌株鏈霉菌211726的發(fā)酵液經過浸提分離純化后，所得的供試樣品阿扎霉素F5a通過HPLC檢測，采用歸一化法，計算其純度為96.8%。

2.2 阿扎霉素F5a抗根結線蟲的活性

阿扎霉素F5a水溶液處理M. incognita J2 24 h后，存活狀態(tài)發(fā)生了很大變化。由圖1可知，靶標線蟲液處理前可觀察到J2線蟲彎曲能動；由圖2可知，靶標線蟲液處理24 h后，J2線蟲僵直不動。

由此表明，阿扎霉素F5a水溶液對M. incognita J2具顯著的毒殺效果，且不同濃度其毒殺效果程度不同（表1）。隨著阿扎霉素F5a水溶液濃度的提高，其毒殺效果增強。在24 h內，處理濃度為1.0%的阿扎霉素F5a水溶液的平均校正擊倒率和平均校正死亡率分別為86.1%和84.5%，處理濃度為0.01%的阿扎霉素F5a水溶液的平均校正擊倒率和平均校正死亡率都在50%以上，這說明阿扎霉素F5a具有較強的殺線蟲活性。

2.3 阿扎霉素F5a抗香蕉枯萎病活性

20 mg/mL的阿扎霉素F5a抗尖孢鐮刀菌的活性測定結果如圖3，其抑菌圈直徑為（2.93±0.04）cm。由此表明，阿扎霉素F5a具有顯著的抗尖孢鐮刀菌活性，顯示其抗香蕉枯萎病病的潛在前景。

3 討論

根結線蟲病已經嚴重地影響到了國民經濟的發(fā)展。近年來，國內外也非常重視尋找合適的高效防治方法，有報道通過化學藥劑來控制根結線蟲危害，其中有呂和平等[6]研究4種無機鹽對南方根結線蟲卵囊、卵孵化及其幼蟲存活的影響，收到了一定的效果。也有報道從植物中來尋找解決的途徑，銀膠菊葉和花提取物、草酸、巴豆酸等植物源物質對其均有較好的控制作用[7-8]，其中遲玉成等[9]利用蓖麻葉水提取液對花生根結線蟲的防治也收到一定效果。國外也有不少學者從植物中提取成分來防治南方根結線蟲病害，Satoshi Taba等[10]報道了用乙醇和水從野生植物中提取的活性物質對J2的生存活力及流動性具有一定的影響。報道從微生物方面來尋找防治方法的研究主要集中在微生物發(fā)酵液方面，其中王波等[11]利用淡紫擬青霉孢子液和放線菌發(fā)酵上清液組合復配菌劑處理對根結線蟲的卵孵化制率和二齡幼蟲殺死率分別可達到66.6%和78.0%；李玲玉等[12]發(fā)現，放線菌Snea 253活性物質對南方根結線蟲卵孵化的相對抑制率為84.95%；唐佳頻等[13]發(fā)現，惡臭假單胞菌可以分泌某些活性成分直接抗南方根結線蟲；焦俊等[14]發(fā)現，4株木霉發(fā)酵濾液均能顯著降低南方根結線蟲卵的孵化和2齡幼蟲（J2）的活性。本研究通過從吸水鏈霉菌中分離出的菌株，經過發(fā)酵獲得阿扎霉素F5a，對其進行活性測定，發(fā)現其具有顯著的抗根結線蟲活性，為防治根結線蟲提供新藥物，為進一步在微生物發(fā)酵產物方面尋找防治途徑提供指導。

香蕉枯萎病的生物防治是近年來的研究熱點。其中劉昌燕等[15]通過對峙試驗測定表明3株拮抗菌對香蕉枯萎病病原菌都有顯著抑制作用，對峙培養(yǎng)7 d，抑制率均在55%以上。徐剛等[16]從土壤中篩選出4株對香蕉枯萎病具有高效拮抗作用的細菌，且當4種拮抗菌發(fā)酵濾液濃度達到70%時，其在高度抑制水平上的抑制率分別為46%、57%和50%。Monteiro等[17]發(fā)現迷迭香，百里香，錫蘭肉桂和丁香的植物提取物和揮發(fā)性精油在不同的濃度對英美香蕉枯萎病病原菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)均有抑制作用，可以有效地避免枯萎病菌的傳播。劉小玉等[18]從土壤的分離和篩選出鏈霉菌菌株1-g-59，盆栽試驗結果表明，菌株1-g-59發(fā)酵液對香蕉枯萎病具有較強的防治作用，防治效果達64.9%。孫建波等[19]從香蕉根部土樣中分離到枯萎病拮抗芽孢桿菌XY-10，拮抗試驗表明，菌株XY-10不同濃度的發(fā)酵濾液均可抑制病原菌孢子萌發(fā)和生長。Cubense Jun Yuan等[20]發(fā)現，解淀粉芽孢桿菌NJN-6產生的揮發(fā)性化合物可以抑制枯萎病菌的生長和孢子萌發(fā)。R.Akila等[21]發(fā)現，植物制劑和生物防治劑的聯(lián)合應用可以非常有效地降低香蕉枯萎病的發(fā)病率。俞魯等[22]從香蕉根際土壤中分離篩選出芽孢桿菌屬拮抗菌株YL-19，用YL-19二次發(fā)酵的生物有機肥對香蕉枯萎病的防治效果達到74%，且對香蕉苗有明顯的促生效果。生物防治相比于抗病品種的選育，具有省時、資金花費少等優(yōu)點；與化學防治相比，又具有綠色環(huán)保的優(yōu)勢。吸水鏈霉菌發(fā)酵產生的阿扎霉素F5a具有顯著的抗尖孢鐮刀菌活性，本研究結果對香蕉種植過程中香蕉枯萎病生物防治的選擇，提供了一個理論數據和實踐指導。

本研究利用鏈霉菌211726發(fā)酵，并分離純化出阿扎霉素F5a，發(fā)現其對南方根結線蟲2齡幼蟲（J2）具有顯著的毒殺作用，同時對香蕉枯萎病病原菌具有顯著拮抗作用，顯示阿扎霉素F5a在生物農藥方面具有良好的研究和開發(fā)價值，可應用于實際生防藥劑。

致 謝 本研究得到江西農業(yè)大學生物科學與工程學院袁干軍博士，武漢大學藥學院洪葵教授的幫助與指導，謹致謝意。

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